Bu protokol, mandibular kemik onarımını analiz etmek için kapsamlı ve etkili bir yöntem sunar. Bir fare modelinde stabilize olmayan mandibular kırık için tekrarlanabilir bir teknik tanımladık ve minimum doku hasarı ve kemik kaybı ile endokondral kemik onarımı sürecinin analizine izin verdik.
Yöntem makalesi
Fare Modellerinde Stabilize Olmayan Mandibular Kırık için Daha Az İnvaziv Teknik
Bu makalede
Özet
Özet
Farelerde mandibular bölgelerde stabilize olmayan kırıklar yapılabilir, böylece bir endokondral ossifikasyon modu kullanarak kemik onarımını analiz etmeyi mümkün kılar. Bu süreci in vivo olarak en doğru şekilde yansıtmak için, özellikle minimal erişim ile karakterize anatomik bir bölge olan mandibular bölgede aşırı kemik kaybını ve yumuşak doku hasarını önlemek için standart bir protokole sahip olmak gerekir. Bildiğimiz kadarıyla, farelerde ilk kez stabilize olmayan mandibular kırığın daha az invaziv bir protokolünü tanımladık. Yetişkin fareler izofluran ile uyuşturulur ve subkutan enjeksiyon yoluyla preoperatif bir buprenorfin dozu alırlar. Mandibulanın alt sınırı boyunca yapılan bir cilt insizyonu ile submandibular bir yaklaşım gerçekleştirilir. Masseter kası, bir periosteal elevatör ile mandibular ramus boyunca subperiosteal bir düzlemde yükseltilir. Mandibular ramusun kırığını tamamlamak için baziler kenarda serum irrigasyonu ve makas altında piezoelektrik kemik cerrahisi cihazı kullanılarak baziler sınırdan koronoid çentiğe (kondiler ve koronoid süreçler arasında) dikey ve tam bir ramus kırığı gerçekleştirilir. Cilt yaklaşımı ipek dikişlerle kapatılır. Stabilize olmayan mandibular kırıklar için bu ayrıntılı prosedür, minimum kemik kaybı ve yumuşak doku hasarına izin veren etkili bir prosedür sunar. Bu teknik, fare modellerinde endokondral kemik onarımı sürecini doğru bir şekilde yansıtmak için başarılı ve tutarlı sonuçlar sağlar.
Giriş
Kemik onarımı, kırık veya osteotomi stabilizasyonuna bağlı olarak hem membranöz hem de endokondral ossifikasyon süreçlerini ifade eder. Stabilize kemik osteotomilerini veya kırıklarını takiben kemik onarımı membranöz ossifikasyona dayanırken, stabilize olmayan kırıklar veya kötü stabilize osteotomiler bir endokondral ossifikasyon moduna göre konsolide olur1. Membranöz kemik onarımı, mezenkimal hücrelerin osteoblastlara doğrudan farklılaşması ile kemik oluşumu ile karakterize edilirken, endokondral kemik onarımı, kemik kallus2'yi oluşturmak için osteoblastlara farklılaşan geçici bir kıkırdak şablonunun oluşumunu içerir.
Kemik onarımı çoklu doku ve hücresel etkileşimlere bağlıdır; Ayrıca bölgeye özgü faktörlerden ve nasır3'e uygulanan kuvvetten de etkilenir. Mandibular kemik, çoğunlukla kortikal kemik tarafından oluşturulan, çiğneme kuvvetlerini destekleyen hareketli bir kemiktir. Mandibular kemik onarımı süreci, kırığın bölgesinden ve yönünden etkilenir. Kas ve periost yaralanmalarının kemik konsolidasyonunu etkileyebileceği ve kırık bölgesinde önemli kemik kaybı olabileceği iyi bilinmektedir 4,5,6.
Endokondral mandibular kemik onarımını analiz etmek, değerli, önyargısız karşılaştırmalar için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir protokoller anlamına gelir. Literatürle ilgili olarak, sadece birkaç yazar fare modellerinde 3,7 ve çoğunlukla molar seviye8'de ön yönde stabilize olmayan mandibular kırıklar için protokoller bildirmektedir. Bu tekniği geliştirerek, kas ve periost yaralanmalarını önlemeyi ve endokondral kemik onarımı sürecini kafa karıştırıcı faktörler olmadan en iyi şekilde analiz etmek için kırık bölgesinde kemik kaybını sınırlamayı amaçlıyoruz. Ek olarak, farelerde mandibular kırık için yeni bir teknik geliştirmenin amacı, küçük hayvanlarda bu tür ameliyatlarda sık görülen ameliyat sonrası ağrıyı ve hayvan ölümünü en aza indirmekti. İlk kez, farelerde ramus seviyesinde stabilize olmayan mandibular kırık için daha az invaziv bir protokol tanımladık. Bu in vivo protokol, kırık bölgesinde aşırı kas ve periost hasarını veya kemik kaybını önler ve ameliyat sonrası ağrı seviyesini ve hayvanın ölüm riskini azaltmaya yardımcı olur.
Protokol
Bu protokol, Imagine Enstitüsü'nün hayvan bakımı yönergelerini takip eder ve etik komiteler ve Fransız bakanlığı tarafından onaylanmıştır (APAFIS 26995).
1. Hayvanlar
- Grup başına hayvan sayısını belirleyin. Grup başına 12 hayvan öneriyoruz. Farelerin cinsiyetini ve yaşını belirleyin. Bu protokol 6 haftalık C57BL/6J fareler (erkek veya dişi) için uyarlanmıştır.
- Hayvanlara işlemden en az 1 hafta önce iklimlendirme için besin takviyesi jeli verin.
2. Cerrahi prosedür
- Gerekli malzemeyi hazırlayın. Aletleri otoklavlayın: makas, iğne sürücüsü, forseps, piezoelektrik kemik cerrahisi cihazının eki ve el aleti ve asansör. İzofluran inhalasyonu için steril eldivenler, ipek dikişler (4/0), tıraş makinesi, pamuklu gazlı bez,% 10 povidon-iyot çözeltisi, ısıtma masası, izofluran ve burun maskesi hazırlayın.
- Steril enjekte edilebilir fizyolojik serum içinde seyreltilmiş 0.1 mg / kg'da buprenorfin hazırlayın. Ameliyattan 30 dakika önce 25G iğne ile deri altı enjeksiyonu ile buprenorfin uygulayın.
- Isıtma plakasını (37 °C) hazırlayın, üzerine köpük desteği yerleştirin ve burun maskesini küçük iğneler veya yapışkan bantla sabitleyin.
- Fareyi, izofluran difüzyonu (% 4) ile indüksiyon için izofluran tankına yerleştirin. Bir ayak parmağı çimdikleme yaparak anestezi derinliğini test edin. Yeterli indüksiyon durumunda, pedal refleksi eksikliği gözlenecektir.
- Anestezi uygulanmış fareyi, tüm prosedür boyunca 37 °C'de tutulan steril bir alanla kaplı ısıtma plakasına sırt üstü yerleştirin. Sürekli izofluran inhalasyonu için maskeyi burun üzerine yerleştirin (% 2,5'te bakım). Fare uzuvlarını yapışkan bantla sabitleyin.
- Genel anestezinin neden olduğu göz kuruluğunu önlemek için göz kayganlaştırıcıyı iki taraflı olarak uygulayın. Submandibular saçları tıraş edin, steril eldivenler giyin ve cildi birkaç kez %10 povidon-iyot çözeltisi ve alkolle dezenfekte edin.
- Submandibular kutanöz yaklaşımı aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirin.
- Mikro makasla mandibular açıdan mandibulanın yatay dalının 1/3 posterior - 2/3 anterior bileşkesine kadar bir cilt insizyonu yapın.
- Masseter kasını ortaya çıkarmak için deri altı dokuları inceleyin.
- Masseter kasını mandibulanın alt sınırından bir periosteal asansör kullanarak çıkarın.
- Asansör ile mandibular ramus boyunca subperiosteal düzlemde masseter kasını yükseltin.
- Mandibulanın alt sınırında, mandibular açının önünde, içbükeyliğin arka kısmında, tuzlu serum irrigasyonu altında (maksimum 10 mL/dk) Piezoelektrik kemik cerrahisi cihazı kullanılarak mandibulanın alt sınırında küçük bir osteotomi (3 mm uzunlukta) oluşturun (Şekil 1, Şekil 2).
- Mandibulanın arka sınırını ve koronoid çentiği (mikro makas veya forseps ile) bulun ve ek masseter kas açıklığı ve yaralanmasını önlemek için mandibular ramus boyunca yerleştirilen küçük düz makas kullanarak kırığı tamamlayın. Kırığın doğru yönlendirilmesini sağlamak için, makası mandibulanın alt sınırına dik olarak yerleştirin.
- Kırığın tamamen tamamlandığını doğrulayın: 2 segmentin forseps ile yumuşak mobilizasyonu sırasında iki kemik segmenti arasındaki toplam hareketlilik gözlenmelidir.
- Cilt yaklaşımını ipek dikişlerle (4/0) ayrı dikişlerle kapatın. Periosteumda herhangi bir dikişe gerek yoktur.
NOT: Alternatif olarak, cilt yaklaşımı diğer adsorbe edilemeyen sütürlerle (ör. Polipropilen sütürler) dikilebilir. - Kırığın yönünü doğrulamak için sefalik lateral röntgen çekin (Şekil 3).
- X-ışınlarını gerçekleştirmeden önce kısa bir reindüksiyon için fareyi tekrar izofluran tankına yerleştirin. Ardından, X-ışını analizi için fareyi yan tarafta, başı hafifçe hiperekstansiyonda olacak şekilde uzantıya yerleştirin.
- Mandibular molar dişler seviyesinde çok öne yerleştirilmiş kırık durumunda veya kırık mandibular açıyı ayırdığında (Şekil 4), kemik kallus hacminde anormal bir artış gözlemleyin. Bu durumlarda, analizde herhangi bir yanlılığı önlemek için hayvanları çalışmadan çıkarın.
- Fareleri kafese geri koymadan önce bilinçlerini geri kazanana kadar kontrol edin.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Herhangi bir çiğneme kuvvetinden kaçınmak için mama taneleri ve sert zenginleştirme içermeyen bir fare kafesi hazırlayın.
- Ameliyat edilen fareyi, cilt tamamen iyileşene kadar 1. hafta boyunca tek bir kafeste izole edin. Ameliyattan 1 hafta sonra, grup dişi fareleri aynı kafeste birlikte ameliyat etti.
- İşlemden 4 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra deri altı enjeksiyonlarla buprenorfin (0.1 mg / kg) uygulayın.
- Ağrıyı ve kırığın ikincil yer değiştirmesini önlemek için 0. günden konsolidasyon süresinin sonuna kadar (yani 28 gün) ameliyat sonrası tüm dönemlerde fareleri yumuşak diyet jeli ile besleyin.
- Fareleri günlük olarak 0. günden kırık sonrası 4. güne kadar, sabahları buprenorfin enjeksiyonundan önce ve daha sonra hayvan kurban edilene kadar (kırılmadan 14 gün sonra) haftada 3 kez tartın.
- Ameliyat sonrası hayvan bakımını optimize etmek için ameliyat sonrası hayvan refahını değerlendirin. Hayvanın postoperatif durumunu değerlendirmek ve takibi uyarlamak için Tablo 1'deki skor ölçeğini kullanın. SKOR > 1 olduğunda buprenorfin enjeksiyonu, skor > 3 olduğunda ve/veya gıda zenginleştirmesine rağmen ameliyat öncesi kilonun %20'si > kilo kaybı durumunda ötenazi mutlaka tartışılmalıdır (Tablo 1).
Sonuçlar
İn vivo cerrahi prosedürlere gelince, bir fare modelinde stabilize edilmemiş mandibular kırığın bu prosedürünü en iyi şekilde gerçekleştirmek için özel öğrenme ve eğitim gereklidir.
Stabilize olmayan mandibular kırık için bu teknik, endokondral kemik onarım sürecinin incelenmesine izin verir. Ötenaziyi takiben, mandibular örnekler %4'lük paraformaldehitte (24 saat) toplandı. EDTA pH 8 ile tam dekalsifikasyondan sonra, kesitler parafine gömüldü. Sagital seri kesitler yapıldı, deparafinizasyon solüsyonunda deparafinize edildi ve daha sonra standart protokoller kullanılarak Sirus Kırmızısı/Alcian Mavisi boyamadan önce rehidre edildi. Histolojik görüntüler, kıkırdaklı bir şablona sahip yumuşak bir kallus oluşumunu doğruladı (Şekil 5). Kemik iyileşmesi, mikro-BT analizlerinin gösterdiği gibi kırıktan 4 hafta sonra tamamlanır. Kemik onarım sürecinin, kallus oluşumunun başlangıcından (örneğin, çalışmanın amacına bağlı olarak her 7 günde bir (7, 14, 21. gün) veya daha fazla) kemik iyileşmesinin sonuna (yani 28. gün) kadar farklı kilit noktalarda histomorfolojik ve mikro-BT morfometrik analizlerle çalışılmasını öneriyoruz.
Tartışma
Teknik, bir fare modelinde stabilize olmayan mandibular kırıkların kısa bir prosedür süresinde (yaklaşık 10 dakika veya daha az) minimal bir açık yaklaşımla gerçekleştirilmesine izin verir. Bu kısa süreli prosedür, özellikle fareler gibi küçük hayvanlarda hayvan morbiditesi ve ölüm riskini sınırlar. Endokondral kemik onarım sürecinin analizinde karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, mandibular açının anormal bir şekilde bölünmesi olmadan mandibular kırıkların aynı yönde gerçekleştirilmesine özellikle dikkat edilmelidir, çünkü bu istenmeyen etki kemik kallusunun hacmini anormal bir şekilde artırabilir ve konsolidasyon süresini geciktirebilir. Mandibular kırık için bu protokol, ameliyat sonrası mandibular kesici dişin büyümesini etkilemez. Bu protokolün etkinliğini artırmak için, deneyciye önce benzer yaştaki ötenazi uygulanmış hayvanlar üzerinde egzersiz yapmasını ve gerekirse kırılma yönünü doğrudan görselleştirmek için mandibulayı kırdıktan hemen sonra incelemesini tavsiye ediyoruz.
Komşu kaslardan nasırlara göç eden mezenkimal progenitörler kemik onarımına katkıda bulunur6. Periosteum ve kas yaralanmasının kemik konsolidasyonunu etkilediği gösterilmiştir 5,6. Ek olarak, geniş kas bölümleri kanama riskinin artmasına neden olur ve ameliyat sonrası enfeksiyona yol açabilir. Piezocerrahi büyük ölçüde kraniyofasiyal kemik cerrahisi alanında geliştirilmiştir; Konvansiyonel osteotomilere göre yumuşak doku yaralanması ve postoperatif ağrı oranlarının daha düşük olduğu bildirilmiştir 7,9. Masseter kası ve periost yaralanmasını en aza indirmek için piezocerrahi kullanarak kırığı mandibula alt sınırında başlattık ve masseter kasının geniş kesitini önlemek için kırığı ramusun üst seviyesinde makasla tamamladık. Bu, ramusun üst kısmını makasla kırmadan önce mandibulanın arka sınırının ve koronoid çentiğin pozisyonunun kontrol edilmesi anlamına gelir. Mandibula alt kenarından piezocerrahi ile başlattıktan sonra küçük düz makas kullanımı ile kırığı tamamlamada herhangi bir zorlukla karşılaşmadık. Bu prosedürü farklı genetik geçmişlere (C57BL / 6J, CD1 (sonuçlar gösterilmedi)), farklı kemik yoğunluklarına ve mandibular boyutlara (prognatizm, mikrognati) sahip yetişkin farelerde yaşadık. Bununla birlikte, herhangi bir anormal kırılma bölünmesini önlemek için makasın uzunluğunun üst ramusun yalnızca bir kez kırılmaya uygun olup olmadığını kontrol etmenizi öneririz.
Bu minimal açık yaklaşım sayesinde bu işlemde kanama riski en aza indirgenir. Kas yükselmesi sırasında oluşabilecek aşırı kanama durumunda, ameliyat bölgesinin gazlı bez ile kısa bir süre sıkıştırılması kanamayı durdurur. Mandibular kırık çok öne yerleştirildiğinde molar diş kırığı durumunda potansiyel bir ameliyat yeri enfeksiyonu riski ortaya çıkabilir; bu olumsuz etki ameliyat sonrası yan röntgenlerde tespit edilebilir. Bu durumda, hayvan çalışmadan çıkarılmalıdır. Ameliyat bölgesinin ameliyat sonrası enfeksiyonu da hematoma bağlı olabilir; Bu, ameliyat öncesi anormal kanama meydana geldiğinde spontan tahliyeye izin veren ayrı kutanöz dikişler yapılarak önlenebilir. İntraperitoneal enjeksiyona karşı izofluran ile yapılan genel anestezi, intraperitoneal enjeksiyonların olumsuz travmatik etkilerine bağlı aşırı mortalite oranlarını önler. Deneyimlerimize göre, izofluran ile genel anesteziye doğrudan bağlı herhangi bir hayvan ölümü gözlemlemedik.
Fareler, ameliyat sonrası gıda alımında azalma gösterebilir. Yetersiz gıda alımı veya yetersiz kilo alımı durumunda, jele elenmiş kuru mama tozu eklenebilir. Ameliyat sonrası gıda alımını iyileştirmek için konaklama için işlemden en az 1 hafta önce mama ile birlikte besin takviyesi jeli verilmesini öneririz. Potansiyel kırık yer değiştirmesini değerlendirmek için takip sırasında (her hafta, takip sırasında) ve fedakarlık sırasında ek röntgenler yapılmasını öneriyoruz. Patolojik olmayan durumlarda, kırıktan 4 hafta sonra kemik konsolidasyonu tamamlanır.
Birkaç yazar, farelerde mandibulanın stabilize olmayan kırıkları için farklı protokoller tanımlamıştır 3,10,11. Osteotomiyi gerçekleştirmek için kullanılan aletler, matkaplar, cerrahi cımbızlar vb. gibi farklı olabilir. Bununla birlikte, matkapların kullanılması daha büyük kemik kaybına ve yumuşak doku yaralanmalarına neden olabilir. Bildiğimiz kadarıyla, stabilize edilmemiş mandibular kırıkların bu prosedürü, osteotomiyi tamamlamak için piezocerrahi ve makası birleştiren ilk prosedürdür. Bu teknik, minimum kemik kaybı ile hassas bir osteotomiye izin verirken yumuşak dokuları koruma avantajına sahiptir.
Tüm tekniklerde olduğu gibi, bu yöntemin de bazı sınırlamaları vardır. Potansiyel bir konsolidasyon gecikmesi ve/veya psödoartroz oluşumunu şiddetlendirebilecek herhangi bir genişlemiş masseter kas kesiti ve periost yaralanmasından kaçınmak için kırığı piezoelektrik cerrahi eki ile başlattıktan sonra makas kullanımı ile gerçekleştirmeyi tercih ettik. Bununla birlikte, bu teknik, kırığı aynı yönde gerçekleştirmek için mandibular ramusun tamamen görselleştirilmesi olmadan koronoid çentiğin pozisyonunun kontrol edilmesini gerektirir. Bu nedenle, cerrahi deneyime bağlı olarak bir öğrenme eğrisi beklenir. Ek olarak, X-ışınları üzerindeki mandibular kırığın yönünü, X-ray cihazına bağlı olarak görselleştirmek zor olabilir. Genel anestezi süresinin artması nedeniyle fare iyileşmesini tehlikeye atabileceğinden, kırık yönünü doğrulamak için in vivo mikro-BT kullanmadık.
Endokondral kemik onarım sürecinin incelenmesi, stabilize olmayan kırıkların gerçekleştirilmesi anlamına gelir, böylece kemik onarım sürecinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu adım, genetik hastalıklar bağlamında veya travma sonrası veya tümör sonrası sekeller durumunda hastalarda kusurlu kemik onarımı ve psödoartrozu tedavi etmek için yeni klinik uygulamalar geliştirmek amacıyla kemik onarım kusurları olan fare modellerinde klinik öncesi çalışmaları düşünmek istiyorsak gereklidir.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Çalışma, kısmen Mutuelles AXA Hayırseverlik Departmanı tarafından Baş ve Kalp Koltuğu ve ANR BonyBrain aracılığıyla desteklenmektedir. SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Paris, Fransa platformunun tüm üyelerine prosedürün gerçekleştirilmesine katkılarından dolayı teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Buprenorfin : Buprecare 0.3 mg/kg | Hayvan Bakım | ||
| Asansörü OBWEGESER genişliği 6mm Uzunluk 17,5cm | Collin Medical | HA 5905 | |
| Forseps: Tampon Plakası MORIA 11 cm N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Isıtma masası Bioseblab 55 cm x 33 cm | Bioseblab | 707 | |
| İğne TUTUCU : Mikro Halsey İğne Tutucu - Metal | LABODERM | 21,100 | |
| Neo Şeffaf | Merck Millipore, Darmstadt, Almanya | 109843 | |
| Ocry Jel Tüp 10 g (göz kayganlaştırıcı) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FİNAL | ACTEON | X57402 | |
| Piezotome uç Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Makas mikro | MORIA | MC52 | |
| İpek sütürler PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Düz makas | MORIA | 4877A | |
| Vetflurane (izofluran) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Kaynaklar
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Ortho Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
- Landry, P. S., Marino, A. A., Sadasivan, K. K., Albright, J. A. Effect of soft-tissue trauma on the early periosteal response of bone to injury. J Trauma. 48 (3), 479-483 (2000).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nat Commun. 12 (1), 2860(2021).
- McGuire, C., Boudreau, C., Prabhu, N., Hong, P., Bezuhly, M. Piezosurgery versus conventional cutting techniques in craniofacial surgery: A systematic review and meta-analysis. Plast Reconstr Surg. 149 (1), 183-195 (2022).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Vercellotti, T. Technological characteristics and clinical indications of piezoelectric bone surgery. Minerva Stomatol. 53, 207-214 (2004).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Tian, Y., et al. HIF-1α regulates osteoclast activation and mediates osteogenesis during mandibular bone repair via CT-1. Oral Dis. 28 (2), 428-441 (2022).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste