Kemik Dokularının Mekansal Transkriptomiklerini Etkinleştirme Yöntemleri

Summary

Burada, taze elde edilen kemik dokularının dekalsifikasyonuna ve yüksek kaliteli RNA'nın korunmasına izin veren bir yöntemi açıklıyoruz. Taze dokuların mevcut olmadığı veya toplanamadığı durumlarda iyi kalitede sonuçlar elde etmek için demineralize edilmemiş kemiklerin Formalin Sabit Parafin Gömülü (FFPE) örneklerini kesitlemek için bir yöntem de gösterilmiştir.

Abstract

Hücreler arasındaki ilişkiyi ve her bir doku içindeki konumlarını anlamak, normal gelişim ve hastalık patolojisi ile ilişkili biyolojik süreçleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Mekansal transkriptomik, doku örnekleri içindeki tüm transkriptomun analizini sağlayan, böylece hücresel gen ekspresyonu ve hücrelerin bulunduğu histolojik bağlam hakkında bilgi sağlayan güçlü bir yöntemdir. Bu yöntem birçok yumuşak doku için yaygın olarak kullanılırken, kemik gibi sert dokuların analizi için uygulanması zor olmuştur. En büyük zorluk, sert doku örneklerini kesitleme için işlerken kaliteli RNA ve doku morfolojisinin korunamamasıdır. Bu nedenle, mekansal transkriptomik verileri etkili bir şekilde oluşturmak için yeni elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek için burada bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, numunelerin dekalsifikasyonuna izin vererek, RNA bozulmasını önlerken korunmuş morfolojik ayrıntılara sahip başarılı doku kesitleri sağlar. Ek olarak, doku bankalarından toplanan numuneler gibi demineralizasyon olmadan daha önce parafine gömülü olan numuneler için ayrıntılı kılavuzlar sağlanmıştır. Bu kılavuzlar kullanılarak, primer tümör ve kemik osteosarkomunun akciğer metastazı doku bankası örneklerinden üretilen yüksek kaliteli mekansal transkriptomik veriler gösterilmektedir.

Introduction

Kemik, esas olarak kollajen tip 1 liflerinden ve inorganik tuzlar^1'den oluşan özel bir bağ dokusudur. Sonuç olarak, kemik inanılmaz derecede güçlü ve serttir, aynı zamanda hafif ve travmaya dayanıklıdır. Kemiğin büyük gücü mineral içeriğinden kaynaklanmaktadır. Aslında, mineral içeriği yüzdesindeki herhangi bir artış için, sertlik beş kat artar². Sonuç olarak, araştırmacılar, bir kemik örneğinin biyolojisini histolojik kesit yoluyla analiz ettiklerinde önemli problemlerle karşı karşıya kalmaktadırlar.

Kalsifiye edilmemiş kemik histolojisi mümkündür ve bazen araştırmanın türüne bağlı olarak gereklidir (örneğin, kemiğin mikro mimarisini incelemek için); Bununla birlikte, özellikle örnekler büyükse, çok zordur. Bu durumlarda, histolojik amaçlar için doku işleme, standart protokollerin ve tekniklerin çeşitli modifikasyonlarını gerektirir³. Genel olarak, yaygın histolojik değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, kemik dokuları fiksasyondan hemen sonra dekalsifiye edilir, bu işlem dokunun boyutuna ve kullanılan kireç çözücü ajana bağlı olarak birkaç gün ila birkaç hafta sürebilir⁴. Dekalsifiye bölümler genellikle kemik iliği muayenesi, tümörlerin teşhisi vb. İçin kullanılır. Üç ana kireç çözücü ajan türü vardır: güçlü asitler (örn. nitrik asit, hidroklorik asit), zayıf asitler (örn. formik asit) ve şelatlama ajanları (örn. etilendiaminetetracetic asit veya EDTA)⁵. Güçlü asitler kemiği çok hızlı bir şekilde kireçten arındırabilir, ancak dokulara zarar verebilir; zayıf asitler çok yaygındır ve teşhis prosedürleri için uygundur; Şelatlama ajanları, araştırma uygulaması için açık ara en çok kullanılan ve uygun olanlardır, çünkü bu durumda, demineralizasyon işlemi yavaş ve naziktir, bu da birçok prosedürün gerektirdiği gibi yüksek kaliteli morfolojinin tutulmasına ve gen ve protein bilgilerinin korunmasına izin verir (örneğin, yerinde hibridizasyon, immün boyama). Bununla birlikte, gen ekspresyon analizleri gibi tüm transkriptomun korunması gerektiğinde, yavaş ve hafif bir demineralizasyon bile zararlı olabilir. Bu nedenle, dokuların morfolojik analizinin hücrelerin gen ekspresyon analizleri ile eşleştirilmesi gerektiğinde daha iyi yaklaşımlara ve yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.

Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) ve uzamsal transkriptomikteki son gelişmeler sayesinde, doku örneklerini saklamak için formalin fiksasyon parafin gömme (FFPE) kullanıldığında bile bir doku örneğinin gen ekspresyonunu incelemek artık mümkündür ^6,7,8. Bu fırsat, dünya çapında doku bankalarında saklananlar gibi daha fazla sayıda örneğe erişimin kilidini açtı. Eğer scRNA-seq kullanılacaksa, RNA bütünlüğü en önemli gerekliliktir; bununla birlikte, FFPE örneklerinin uzamsal transkriptomikleri söz konusu olduğunda, her doku bölümünün histolojik bağlamında gen ekspresyonunu görselleştirmek için hem yüksek kaliteli doku kesitleri hem de yüksek kaliteli RNA gereklidir. Yumuşak dokularla bu kolayca başarılırken, kemik gibi sert dokular için aynı şey söylenemez. Aslında, bildiğimiz kadarıyla, FFPE kemik örnekleri üzerinde uzamsal transkriptomik kullanan hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bunun nedeni, RNA içeriğini korurken FFPE kemik dokularını etkili bir şekilde işleyebilen protokollerin olmamasıdır. Burada, önce RNA bozulmasını önlerken taze elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek ve kireçten arındırmak için bir yöntem sağlanır. Daha sonra, dünya çapında doku bankalarında toplanan FFPE örneklerinin transkriptomik analizine duyulan ihtiyacın farkında olarak, demineralize edilmemiş kemiklerin FFPE örneklerini uygun şekilde işlemek için geliştirilmiş kılavuzlar da sunulmaktadır.

Protocol

Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Pittsburgh Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak onaylanmıştır.

1. Demineralizasyon gerektiren kemik dokusu örneklerinin FFPE bloklarını hazırlama yöntemi

1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
   1. EDTA% 20 pH 8.0 hazırlayın. 1 L için 200 g EDTA'yı 800 mL ultra saf suda çözün, sodyum hidroksit 10 N ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve son olarak hacmi ultra saf su ile 1L'ye getirin. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Her zaman taze hazırlanmış EDTA %20 pH 8.0 kullanın. Sodyum hidroksit (NaOH) 10 N, 400 g NaOH'nin 1 L ultra saf suda çözülmesiyle hazırlanır.
   2. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS kullanarak bir çeker ocakta %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
      NOT: Konsantre paraformaldehit çözeltileri veya paraformaldehit katıları ile çalışmak için çeker ocakta bir alan belirleyin ve bu şekilde etiketleyin. Maruz kalmayı önlemek için kapları mümkün olduğunca kapalı tutun. Gerçekleştirilen deney için gereken en küçük pratik miktarlarda kullanın. Paraformaldehit tozu tartımı ve tartı bir çeker ocakta kullanılamıyorsa, önce bir kap alın, ardından davlumbaza PFA tozu ekleyin ve tozu tartmak için kantara geri dönmeden önce kapağını kapatın. Her zaman taze hazırlanmış %4 PFA kullanın.
   3. Her numune için uygun bir kap kullanın.
      NOT: Örneğin, 1 mg kemik dokusu için, herhangi bir çözeltinin en az 1 mL'sinin kemikle temas etmesine izin veren bir kap kullanın.
   4. Diseksiyon için gerekli tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.
   5. RNazları gidermek için tüm alanları dekontamine edici bir solüsyonla temizleyin.
   6. Buz kapları, %70 etanol spreyi dahil olmak üzere kalan deneysel materyalleri toplayın ve bir yörünge çalkalayıcıya erişin.
2. Farelerden kemik dokusu örneklerinin izolasyonu
   1. Fareyi CO₂ maruziyeti ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın ve sırt üstü yatırın. Fare derisine% 70 etanol püskürtün.
   2. Steril diseksiyon makası kullanarak cildi açın ve bacak kasını ortaya çıkarın. Kemiğin konumunu net bir şekilde görmek için kası bacakla birlikte kesin ve zarar görmeden çıkarmak için kemiği nazikçe ayırın.
      NOT: Kemiğe bağlı tüm kasların tamamen çıkarılması gerekli değildir. RNA bozulmasını sınırlamak için mümkün olduğunca hızlı olmaya çalışın.
   3. Kemik örneğini hemen %4 PFA içeren bir tüpe yerleştirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   4. İstediğiniz gibi diğer kemik örneklerini toplamak için prosedürü tekrarlayın.
   5. Uygun fiksasyonu sağlamak için %4 PFA'lı numuneleri en az 24 saat boyunca 4 ° C'de 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
3. Kemik dokusu örneklerinin dekalsifikasyonu
   1. Fiksasyondan sonra kemik dokusunu orbital çalkalayıcıdan alın.
   2. Kalan PFA'yı çıkarmak için kemik dokusunu 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 3 dakika boyunca 1x PBS ile 2 kez yıkayın.
   3. Steril diseksiyon makası kullanarak, hala kemiğe bağlı kalan kasları çıkarın.
   4. Kemik dokusunu 1x PBS ile 3 dakika boyunca bir kez daha yıkayın.
   5. Kemik dokusunu %20 EDTA pH 8.0 olan yeni bir kaba koyun. Ardından, kabı oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
   6. Çözeltiyi atın, kabın içine taze% 20 EDTA pH 8.0 ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
   7. Adım 1.3.6'yı 10 kez tekrarlayın.
   8. Çözeltiyi atın, kabın içine taze %20 EDTA pH 8.0 ekleyin ve gece boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde soğuk bir odada 4 °C'ye yerleştirin.
4. Kemik dokusu örneklerinin dehidrasyonu
   1. Kemik dokusu örneğini kaptan alın.
   2. Dokuyu inceleyin ve kemiği nazikçe döndürerek ve bükerek dekalsifikasyonun etkinliğini doğrulayın. Alternatif olarak, bir X-ışını makinesi kullanarak kemiğin röntgenini çekin.
      NOT: Numune kolayca esniyorsa, iyi bir dekalsifikasyon derecesi elde edilmiştir. Değilse, dekalsifikasyon parametreleri (zaman, ajitasyon hızı, kullanılan %20 EDTA pH 8.0. hacmi vb.) arttırılmalıdır.
   3. EDTA kalıntılarını gidermek için kemik dokusunu 1x PBS ile 3 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
   4. Kemik dokusunu yeni bir kaba koyun ve% 70 etanol ile dehidrasyonu başlatın. 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
   5. %70 etanol çözeltisini atın, numuneyi %90 etanol çözeltisine koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
   6. %90 etanol çözeltisini atın, numuneyi %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
   7. %100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
   8. %100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.
   9. %100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 30 dakika inkübe edin.
   10. %100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 45 dakika inkübe edin.
       NOT: Dehidrasyon, otomatik bir işlemci kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bu durumda, programı manuel dehidrasyon için bildirilen aynı koşullarla ayarlayın. Bildirilen koşullar, 4 mm'den daha kalın olmayan örnekler içindir (yani, farelerden elde edilen kemik dokusu örnekleri). 4 mm'den daha kalın numuneler için dehidrasyon zamanlaması deneysel olarak belirlenmelidir.
5. Kemik dokusu örneklerinin temizlenmesi
   1. Kemik dokusu örneğini yeni bir kaba koyun ve ksilen kullanarak temizleme işlemini başlatın. 140 rpm'de 20 dakika inkübe edin.
   2. Kullanılmış ksileni atın, yeni ksilen ekleyin ve 140 rpm'de 20 dakika daha inkübe edin.
   3. Kullanılmış ksileni atın, yeni ksilen ekleyin ve 140 rpm'de 45 dakika inkübe edin.
      NOT: Temizleme, otomatik bir işlemci kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bu durumda, programı manuel temizleme için bildirilen koşulların aynısıyla ayarlayın. Bildirilen koşullar, 4 mm'den daha kalın olmayan örnekler içindir (yani, farelerden elde edilen kemik dokusu örnekleri). 4 mm'den daha kalın numuneler için zamanlama deneysel olarak belirlenmelidir.
6. Kemik dokusu örneklerinin infiltrasyonu ve gömülmesi
   1. Temizledikten sonra kemik dokusu örneğini orbital çalkalayıcıdan/otomatik işlemciden alın.
   2. Kemik dokusu örneğini bir gömme kasete yerleştirin ve balmumu ile sızmayı başlatın (bkz. Malzeme Tablosu). 60 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Kullanılmış balmumu atın, yeni balmumu ekleyin ve 60 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   4. Kullanılmış balmumu atın, yeni balmumu ekleyin ve 60 °C'de 45 dakika inkübe edin.
   5. Kemik dokusu örneğini istenen yönde bir kalıba dikkatlice yerleştirin.
   6. Numune bloğunun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin.
   7. Elde edilen FFPE'yi kesitlemeye başlamaya hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: FFPE blok, kesitleme yapılmadan önce uzun yıllar saklanabilir.

2. Demineralize edilmemiş FFPE numunelerinin kesitlerine ayrılması için yönergeler

NOT: Aşağıdaki kılavuzlar, özellikle küçük, kireçten arındırılmamış kemik örneklerinde RNA bozulmasını önlerken doku bölümlerinin kalitesini büyük ölçüde iyileştirmek için yararlı olan değerli ipuçları ve talimatlar sağlar. Bu kılavuzlar, mevcut olduğunda kalsifiye edilmiş kemik örneklerine de uygulanabilir. Daha büyük kemik dokusu örnekleri için, daha kaliteli kesitler elde etmek için demineralizasyon yapılmalıdır; Bu gibi durumlarda, yukarıda bildirilen yöntem izlenmeli ve parametreler (zamanlama, çözelti hacimleri vb.) buna göre ayarlanmalıdır. Aşağıdaki yönergeler, FFPE kemik dokuları zaten işlendiğinde (örneğin, doku bankalarından veya diğer laboratuvarlardan toplanan FFPE bloğu) veya toplanan bölümlerin iyi kalitede RNA, yüksek kaliteli doku kesitleri veya her ikisini birden gerektiren herhangi bir analiz türünü gerçekleştirmek için kullanılacağı durumlarda uygundur.

1. Ekipman hazırlığı
   1. RNazları gidermek için tüm çalışma yüzeylerine ve aletlere dekontamine edici solüsyonlar püskürtün.
   2. Çift damıtılmış su ile bir su banyosu hazırlayın ve sıcaklığı 42 °C'ye ayarlayın.
   3. Bir mikrotom bıçağı alın, yağ kalıntılarını gidermek için% 70 etanol püskürtün, ardından RNazları çıkarmak için dekontamine edici solüsyonlarla püskürtün.
   4. Bıçağı mikrotomun üzerine sabitleyin. Boşluk açısının 10° olarak ayarlandığından emin olun.
      NOT: Kesit almak için her zaman yeni bıçaklar kullanın.
   5. İki kova buz hazırlayın.
   6. Cımbız, fırça ve prob alın, RNazları çıkarmak için dekontamine edici solüsyonlarla püskürtün ve iki buz kovasından birine yerleştirin.
   7. Diğer buz kovasına çift damıtılmış su ekleyerek bir buz banyosu hazırlayın.
      NOT: FFPE bloğu eklenen suda yüzmemelidir; Bu nedenle, buz kovasına eklenen su miktarı, numunenin yüzmeden ıslanmasına izin verecek kadar yeterli olmalıdır.
2. Bölümlere ayırma
   1. FFPE bloğunu 4 °C'deki depodan alın ve mikrotomun üzerine yerleştirin. Komutu Kırp veya 14 μm kaydırma kalınlığına ayarlayın ve doku açığa çıkana kadar numuneyi kırpmaya başlayın.
      NOT: FFPE bloğu zaten kesilmişse ve doku zaten açığa çıkmışsa, adım 2.2.1'i atlayın. Bloğun delik ve çatlak içermediğini doğrulayın. Öyleyse, doğrudan adım 2.2.2'ye ilerleyin. Değilse, yüzeyi düzleştirmek ve deliklerden ve çatlaklardan kaçınmak için birkaç bölüm kesin ve ardından adım 2.2.2'ye geçin.
   2. Numuneyi nemlendirmek için FFPE bloğunu buz banyosuna yerleştirin. Hidrasyon zamanı deneysel olarak belirlenmelidir.
      1. 2 dakika ile başlayın ve hidrasyon yeterli değilse süreyi artırın. 10 dakikayı aşmayın. Hidrasyon dokuyu genişletecek ve "Venedik panjurları" ve çizgilerin oluşumunu azaltacaktır. Daha uzun hidrasyon süreleri parafin bloğunda çatlaklara ve muhtemelen doku ayrılmasına neden olabilir.
      2. Numuneyi nemlendirmek için 10 dakika yetersizse, 10 dakikadan uzun olmayan hidrasyon döngüleri gerçekleştirin ve tekrar kesit almayı deneyin.
      3. Bloğun yüzeyi çatlaklar veya kesikler nedeniyle pürüzsüz ve temiz değilse, numuneyi yeniden gömmeyi düşünün. RNA kalitesi, yeniden gömme işleminden etkilenmeyecektir.
   3. Numuneyi mikrotomun numune kelepçesine koyun, bıçakla hizalayın ve bölümlere ayırmaya başlayın. Kaydırma kalınlığını 5 μm olarak ayarlayın.
   4. Kesiti toplayın ve soğuk cımbız ve fırça kullanarak 42 °C'deki su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Alternatif olarak, doku bölümlerinin RNA izolasyonu yapılacaksa, bölümleri bir santrifüj tüpünde toplayın ve RNA hazırlığı için üretim özelliklerini takip edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   5. Dokuyu germek ve kalan kırışıklıkları ve kıvrımları ortadan kaldırmak için bölümü su banyosunda inkübe edin.
      NOT: Her bölüm için su banyosunda yüzme süresi deneysel olarak belirlenmelidir. Doku ayrılması sorunları ortaya çıkarsa kemik bölümlerini fazladan bir dakika bırakmayı düşünün. Uzun yüzer süreler dokuya zarar verebileceğinden, bölümü çok uzun süre yüzer halde bırakmayın.
   6. Kesiti bir cam slayt üzerine yerleştirin, ardından 42 °C'de 3 saat inkübe edin.
   7. Düzgün kurutma için cam sürgüyü gece boyunca RT'de bir kurutucuya veya fırına yerleştirin.
   8. Cam slaytı, ekli bölümü RT'de olacak şekilde bir slayt kutusunda saklayın.
      NOT: Slaytlar RT'de uzun yıllar saklanabilir. Uzamsal transkriptomik yapılacaksa, cam bir slayt yerine, bölümü üretici tarafından sağlanan uzamsal gen ekspresyon slaydına yerleştirin ve bildirilen önerileri izleyin (bkz. Malzeme Tablosu).

Results

Burada sunulan yöntem, RNA bütünlüğünü korurken bir mikrotom ile kolayca kesit alınabilen demineralize FFPE örnekleri elde etmek için yeni izole edilmiş kemiklerin nasıl işleneceğini açıklar (Şekil 1). Yöntem, murin femurlarında başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak benzer boyutlardaki diğer kemik dokusu örnekleri için takip edilebilir veya tüm parametreleri (zamanlama, çözelti hacimleri, vb.) artırarak daha büyük kemik örnekleri (örneğin, insan örnekleri) için uyarlanabilir.

Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Korunmuş RNA bütünlüğü ile dekalsifiye kemik dokularının FFPE bloklarını elde etmek için yöntemin şematik diyagramı (1. ve 2. noktalar). FFPE blokları bölümüne ilişkin yönergelerin şematik diyagramı (madde 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dekalsifikasyonun doğru zamanlamasını doğrulamak için, dekalsifiye edilmemiş femurların, femurların 3 saat boyunca dekalsifiye edildiği (EDTA'nın her 30 dakikada bir toplam 6 kez değiştirildiği) ve femurların 24 saat boyunca dekalsifiye edildiği (EDTA'nın her 30 dakikada bir toplam 10 kez değiştirildiği ve daha sonra gece boyunca EDTA'da bırakıldığı) karşılaştırıldığı bir zaman kursu gerçekleştirildi (Şekil 2). Elde edilen FFPE blokları daha sonra yukarıdaki kılavuzlara göre kesitlere ayrıldı ve elde edilen kesitlerin histolojik kalitesi ve RNA bütünlüğü doğrulandı. Bunu yapmak için, doku kesitlerinin yapısal bütünlüğü ve morfolojisi hematoksilen ve eozin (H&E) boyama ve ardından mikroskobik inceleme ile değerlendirildi (Şekil 2A, C, E), RNA kalitesi, 200 nükleotidden (200 nt) daha yüksek boyutta RNA fragman dağılım değeri değerlendirilerek değerlendirildi (DV200 skoru olarak bilinir)⁴ (Şekil 2B, D, F). H&E görüntüleri, dekalsifiye edilmemiş ve 3 saat dekalsifiye femur kesitlerinin çeşitli kırık, delik ve hasarlarla ortaya çıktığını (Şekil 2A,C,), 24 saat boyunca dekalsifiye edilmiş femur kesitlerinin ise iyi histolojik kalite gösterdiğini gösterdi (Şekil 2E). Tüm örnekler, scRNA-seq veya mekansal transkriptomik analizler yapmak için minimum değer olarak kabul edilen P'den daha yüksek DV200 skorları sundu⁴. Daha küçük kaplarda daha hafif ajitasyon ile 4 ° C'de günlük EDTA değişiklikleri ile daha uzun inkübasyon süreleri de test edilmiştir ve bu koşullar kullanıldığında numunelerin RNA bütünlüğü önemli ölçüde azaldığından tavsiye edilmez (Şekil 2H). Bu nedenle, inkübasyon süresi 24 saate düşürülürken, dekalsifikasyonu artırmak için dekalsifikasyon sıklığı, ajitasyon ve hacimleri arttırıldı.

Şekil 2. Dekalsifikasyon sonrası 8 haftalık fare femurlarının kesitleri ve RNA bütünlüğü kalite kontrolü (QC). 8 haftalık farelerden elde edilen femurlar taze disseke edildi, fikse edildi ve EDTA pH 8.0 ile dekalsifiye edildi. farklı zaman noktalarında, açıklanan yöntem kullanılarak parafine gömülür ve rapor edilen yönergelere göre bölümlere ayrılır. Elde edilen kesitlerin histolojik kalite kaydı daha sonra H&E boyama ile gerçekleştirilirken, RNA bütünlüğü, 200 nükleotidden (200 nt) (DV200) daha büyük bir boyuta sahip RNA Fragman Dağılım Değeri değerlendirilerek değerlendirildi. (A) Dekalsifikasyon yapılmadıktan sonra 8 haftalık fare femur kesitlerini gösteren H & E boyama. Sağdaki görüntü, kutulu alanın daha yüksek bir büyütme oranını gösterir. (B) Dekalsifikasyon yapılmadıktan sonra 8 haftalık fare femur bölümlerinin RNA QC'si. (C) 3 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur kesitlerini gösteren H & E boyama. Sağdaki görüntü, kutulu alanın daha yüksek bir büyütme oranını gösterir. (D) 3 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur bölümlerinin RNA QC'si. (E) 24 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur kesitlerini gösteren H & E boyama. Sağdaki görüntü, kutulu alanın daha yüksek bir büyütme oranını gösterir. (F) 24 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur bölümlerinin RNA QC'si. (G) 72 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur kesitlerini gösteren H & E boyama. Sağdaki görüntü, kutulu alanın daha yüksek bir büyütme oranını gösterir. (H) 72 saatlik dekalsifikasyondan sonra 8 haftalık fare femur bölümlerinin RNA QC'si. Kısaltmalar: H&E = hematoksilen ve eozin; DV200 (%) = 200 nt> parça dağılım değerinin% 'si; nt = nükleotidler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Demineralize edilmemiş FFPE örneklerini işlemek için rapor edilen kılavuzların etkinliğini test etmek için, Kas-İskelet Sistemi Onkoloji Tümör Kayıt ve Doku Bankamızdan (MOTOR) elde edilen demineralize edilmemiş insan primer osteosarkomu ve akciğer osteosarkomu metastazlarının FFPE blokları toplandı ve mekansal transkriptomik analiz yapıldı (Şekil 3). Mekansal transkriptomik analize geçmeden önce, FFPE blokları düzgün bir başlangıç yüzeyi elde etmek için parafine yeniden gömüldü. Daha sonra, kesitlerin RNA'sı ve histolojik kalitesi değerlendirildi (veriler gösterilmedi). Primer osteosarkom örnekleri uygun hidrasyon olmadan kesit alınamadığından hidrasyon adımları belirleyiciydi. Buna karşılık, akciğer metastazları herhangi bir hidrasyon adımı gerektirmedi. Kesitlemeden sonra, dokular H&E ile boyanmış (Şekil 3D) uzamsal bir transkriptomik lam (Şekil 3A) üzerine yerleştirildi ve üretici spesifikasyonlarına göre uzamsal transkriptomik analiz yapıldı (bkz. Elde edilen cDNA kütüphaneleri dizilenmiş ve işlenmiş veriler kalite kontrol⁵ için Space Ranger ile görselleştirilmiştir (Şekil 3B). Space Ranger çıktısı, geçerli barkodlar, geçerli benzersiz moleküler tanımlayıcılar (UMI'ler), Q30 bazları ve nokta başına tespit edilen genlerin medyanı (1700 ile 5000 arasında) için çok yüksek puanlar (yaklaşık 0) gösterdi ve elde edilen verilerin sağlamlığını ve sağlamlığını gösterdi (Şekil 3B). Yansız grafik tabanlı küme analizi yoluyla, ostojenik, immün, epitel ve endotel hücrelerinin yanı sıra adipositlerin kümeleri de dahil olmak üzere 12 ana küme tanımlanmıştır (Şekil 3E). Dikkat çekici bir şekilde, kümelerin sınırları, patolog tarafından tanımlanan histolojik bölgelerin kenarları ile örtüşüyordu (Şekil 3D). Aynı örneklerin ek bölümleri de mineralize alanları görselleştirmek için Goldner'ın Trikrom ile boyandı (Şekil 3C).

Şekil 3. İki çift dekalsifiye edilmemiş primer osteosarkom (OS) ve akciğer metastazlarının mekansal transkriptomik analizi. Demineralize olmayan insan primer osteosarkomu ve akciğer metastazı olan iki eşleşen çifte ait FFPE blokları MOTOR doku bankamızdan toplandı. Örnekler, rapor edilen yönergeler kullanılarak bölümlere ayrıldı ve uzamsal transkriptomik analiz yapmak için FFPE örnekleri için bir Visium Uzamsal Gen İfadesi slaydına yerleştirildi. (A) Ekli bölümlerle birlikte FFPE örnekleri için Visium Uzamsal Gen İfadesi slaytı. (B) Tüm numuneler için elde edilen verilerin kalitesini değerlendirmek için kullanılan ortak parametreleri gösteren Space Ranger çıktısı. (C) Mineralize kemik dokularının ve osteoidin lokalizasyonunu gösteren Goldner'ın Trikrom boyası. (D) Patoloğun açıklamasını gösteren H&E boyası. (E) Doku ikamet eden hücre popülasyonlarının lokalizasyonunu gösteren küme analizi. Kısaltmalar: FFPE = formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülü; MOC'ler = kötü huylu osteojenik hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada, dekalsifiye kemiklerin FFPE bloklarını hazırlamak ve dizileme (yani yeni nesil dizileme (NGS)) veya diğer RNA ile ilgili teknikler (yani in situ hibridizasyon, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), vb.) için RNA bütünlüğünü korumak için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır.

Yöntem, kemik dokusu örneklerini kireçten arındırmak için EDTA'yı kullanır; EDTA inkübasyonu, numunelerin yavaş ama ince demineralizasyonuna izin verir, böylece dokunun histolojik özelliklerini en iyi şekilde korur. Genellikle, kemik dekalsifikasyonu en az 2 hafta boyunca% 10 EDTA pH 7.0 kullanılarak, çözeltiyi her gün tazeleyerek gerçekleştirilir⁴. Bununla birlikte, uzun dekalsifikasyon süreleri, RNA bozulmasına önemli ölçüde katkıda bulunur ^6,7,8. Bu sorunun üstesinden gelmek için EDTA konsantrasyonu %20'ye, pH 8.0'a yükseltildi ve çözelti değiştirme sıklığı her 30 dakikada bir artırıldı. Bu koşullar, dokunun maruz kaldığı büyük miktarda çözelti, şiddetli ajitasyon ve yüksek kap / doku hacmi oranı ile birlikte, dekalsifikasyonu en üst düzeye çıkardı ve tedavi sürelerini kısalttı, nazik ama hızlı bir demineralizasyona izin verdi. Transkriptom dizilimi için kemik dokusu örnekleri kullanılacağı zaman, bunların tamamen kireçten arındırılmasının gerekli olmayabileceğini belirtmek önemlidir. Bu durumda, yeterli demineralizasyon ve iyi RNA koruması arasındaki en uygun oran bulunmalıdır. Bahsedilmesi gereken bir diğer önemli nokta da, numuneler nasıl işlenirse işlensin, eğer düzeltilmişlerse, RNA'larının parçalanacağıdır. Burada bildirilen yöntem, 200 nükleotidden (%DV200) daha büyük bir boyuta sahip RNA fragmanlarının tutulmasına izin verir (Şekil 2F), bu da yüksek RNA kalitesini gösterir ^9,11.

Bu yöntem belirli sınırlamalar sunar. İlk olarak, fareler kemik dokusu örneklerinin tek kaynağı olduğundan, yöntem sadece nispeten küçük olan murin kemikleri üzerinde doğrulanmıştır. Ayrıca, bu yöntemin sadece 8 haftalık fareler üzerinde test edildiğinden, 8 haftadan büyük veya daha küçük fareler için kullanılıp kullanılamayacağı bilinmemektedir. İskelet olarak olgun oldukları için 8 haftalık fareleri seçtik. Yaşlanma kemiklerin mineral içeriğini değiştirdiğinden, bu yaklaşımda değişikliklerin uygulanması gerekebilir.

Ek olarak, örneğin doğrudan doku bankalarından toplandıklarında olduğu gibi, küçük kireçlenmemiş kemik örneklerinin FFPE örnekleri kullanıldığında, doku kesitlerinin kalitesini iyileştirmeye yardımcı olmak için kılavuzlar bildirilmektedir. Bu durumlarda, RNA bozulursa hiçbir şey yapılamaz, ancak kesit kalitesi iyileştirilebilir. Öte yandan, burada gösterilenler gibi iyi RNA içeriğine sahip numuneler için, sağlanan yönergelere uyulursa uzamsal transkriptomik analiz mümkündür. Dikkat çekici bir şekilde, primer osteosarkom örneklerinde, kemik yapısı tümör kütlesinin varlığı ile değiştirilebilir, bu da gerçek örnekleri daha zayıf ve kırılgan hale getirir, bu da kesitlemeyi kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu boyama tekniği ile mineralize ve mineralize olmayan alanlar tanımlanabildiğinden, durumun böyle olup olmadığını değerlendirmek için Goldner'ın Trikrom boyaması kullanılmıştır (Şekil 3C).

Sonuç olarak, rapor edilen yöntem, kemik dokusu örneklerini dekalsifiye etmek ve NGS veya RNA bütünlüğü gerektiren diğer teknikler için etkili bir şekilde kullanılabilecek FFPE kesitleri elde etmek için kolay uygulanabilir bir yöntemi temsil etmektedir. Ek olarak, doku bankalarından elde edilen numuneler gibi, parafin gömülmeden önce demineralize edilmemiş olabilecek numunelerin kesitlere ayrılması için kılavuzlar sağlanmıştır. Mekansal transkriptomik analizlerin hızlı gelişimi göz önüne alındığında, önerilen yöntem ve kılavuzlar genel olarak kemik araştırmalarında ve kemik kanseri araştırmalarında da çok yardımcı olabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelişmiş orbital çalkalayıcı	VWR	76683-470	Yöntem talimatlarında bildirildiği gibi inkübasyon sırasında dokuları ajitasyon altında tutmak için kullanın.
Deve Kılı Fırçalar	Ted Pella	11859	Kılavuzda belirtildiği gibi FFPE bölümlerini işlemek için kullanın.
Çift İndeks Kiti TS Set A 96 rxns	10X Genomik	PN-1000251	Uzamsal transkriptomik yapmak için kullanın.
Etanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Yöntem talimatlarında bildirildiği gibi doku dehidrasyonunu gerçekleştirmek için kullanın.
Etilendiamintetraasetik Asit, Disodyum Tuzu Dihidrat (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	EDTA% 20 pH hazırlamak için kullanın 8.0.
Fisherbrand Kavisli Orta Nokta Genel Amaçlı Forseps	Fisher Scientific	16-100-110	Kılavuzda belirtildiği gibi FFPE bölümlerini işlemek için kullanın.
Fisherbrand İnce Hassas Prob	Fisher Scientific	12-000-153	FFPE bölümlerini kılavuzda belirtildiği şekilde işlemek için kullanın.
Balıkçı markası  Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Fisher Scientific	12-550-15	Kılavuzda belirtildiği gibi bölümlere ayrılmış parşömenleri eklemek için kullanın.
Yüksek profilli elmas mikrotom bıçakları	CL Sturkey	D554DD	FFPE bloklarını kılavuzda belirtildiği gibi bölümlere ayırmak için kullanın.
Novaseq 150PE	Novogene	/A	Sıralayıcı.
Paraformaldehit (PFA)% 32 Sulu Çözelti EM Sınıfı Elektron	Mikroskobu Bilimleri	15714-S	Doku fiksasyonunu gerçekleştirmek için 1x PBS & nbsp ile% 4'lük nihai konsantrasyona seyreltin.
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Kullanıma hazır. PFA'yı seyreltmek ve yöntem talimatlarında bildirildiği gibi yıkamaları gerçekleştirmek için kullanın.
Premiere Doku Yüzer Banyosu	Fisher Scientific	A84600061	Kılavuzda belirtildiği gibi FFPE bölümlerindeki kırışıklıkları gidermek için kullanın.
RNase AWAY Yüzey Dekontaminantı	Thermo Fisher Scientific	7002	Yöntem talimatlarında bildirildiği gibi tüm yüzeyleri temizlemek için kullanın.
RNeasy DSP FFPE Kiti	Qiagen	73604	Kılavuzlarda bildirildiği gibi oluşturulduktan sonra FFPE bölümlerinden RNA'yı izole etmek için kullanın.
Yarı Otomatik Döner Mikrotom	Leica Biosystems	RM2245	Kılavuzda belirtildiği gibi FFPE bloklarını bölümlere ayırmak için kullanın.
Sodyum hidroksit	Millipore Sigma	S8045-500	400 g'ı 1 litre Milli-Q suda yavaşça çözerek 10 N'luk çözelti hazırlayın.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Sıralama veri çıktısını işlemek için kullanın.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Yöntem talimatlarında belirtildiği gibi doku infliltrasyonu ve gömmesi gerçekleştirmek için kullanın.
Visium Aksesuar Kiti	10X Genomik	PN-1000194	Uzamsal transkriptomik deneyler yapmak için kullanın.
Visium İnsan Transkriptom Prob Kiti Küçük	10X Genomik	PN-1000363	Uzamsal transkriptomik deneyler yapmak için kullanın.
Visium Uzamsal Gen İfadesi Slayt Kiti 4 rxns	10X Genomik	PN-1000188	Uzamsal transkriptomik deneyler yapıyorsanız bölümleri yerleştirmek için kullanın.
Ksilen	Leica Biosystems	3803665	Yöntem talimatlarında bildirildiği gibi doku temizleme işlemini gerçekleştirmek için kullanın.