Yöntem makalesi

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66866

⸱

14 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

Bu makalede

Özet

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Özet

Son on yılda, tek hücreli yaklaşımlar, örnekler içindeki gen ekspresyon dinamiklerini, hücre heterojenliğini ve hücre durumlarını incelemek için altın standart haline geldi. Tek hücreli ilerlemelerden önce, erken gelişim sırasında dinamik hücresel manzarayı ve hızlı hücre geçişlerini yakalamanın fizibilitesi sınırlıydı. Bu yazıda, embriyonik gün E6.5'ten E8'e kadar olan fare embriyoları üzerinde, gastrulasyonun başlangıcına ve tamamlanmasına karşılık gelen tek hücre ve çekirdek analizi yapmak için sağlam bir boru hattı tasarlanmıştır. Gastrulasyon, gelişim sırasında üç germinal tabakayı oluşturan temel bir süreçtir: organogenez için gerekli olan mezoderm, ektoderm ve endoderm. Yabani tip perigastrulan embriyolara uygulanan tek hücreli omikler hakkında kapsamlı literatür mevcuttur. Bununla birlikte, mutant embriyoların tek hücreli analizi hala azdır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır. Bu kısmen genotipleme ihtiyacı, zamanlanmış gebelikler, gebelik başına istenen genotiplere sahip embriyo sayısı ve bu aşamalarda embriyo başına hücre sayısı ile ilişkili teknik kısıtlamalardan kaynaklanmaktadır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmış bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yöntem, istenen genotiplerle daha yüksek senkronize gebelik şansı elde etmek için üreme ve zamanlanmış gebelik kılavuzları oluşturur. Embriyo izolasyon sürecindeki optimizasyon adımları, aynı gün genotipleme protokolü (3 saat) ile birleştiğinde, mikro damlacık bazlı tek hücrenin aynı gün gerçekleştirilmesine izin vererek, hücrelerin yüksek canlılığını ve sağlam sonuçları garanti eder. Bu yöntem ayrıca embriyolardan optimal çekirdek izolasyonları için kılavuzları içerir. Böylece, bu yaklaşımlar gastrulasyon aşamasındaki mutant embriyoların tek hücreli yaklaşımlarının uygulanabilirliğini arttırmaktadır. Bu yöntemin, mutasyonların gastrulanın hücresel manzarasını nasıl şekillendirdiğinin analizini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Giriş

Gastrulasyon, normal gelişim için gerekli olan temel bir süreçtir. Bu hızlı ve dinamik süreç, pluripotent hücreler, organların nasıl oluştuğunu tanımlayan soya özgü öncülere geçtiğinde meydana gelir. Yıllar boyunca, gastrulasyon uzun zamandır büyük ölçüde homojen üç popülasyonun oluşumu olarak tanımlandı: mezoderm, ektoderm ve endoderm. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü teknolojiler ve ortaya çıkan sayıda embriyonik kök hücre modeli 1,2, erken germ katmanları arasında benzeri görülmemiş bir heterojenliği ortaya çıkarmaktadır 3,4. Bu, gastrulanın farklı hücre popülasyonlarını düzenleyen mekanizmalar hakkında ortaya çıkarılacak çok daha fazla şey olduğunu göstermektedir. Fare embriyonik gelişimi, gastrulasyon sırasında erken hücre kaderi kararlarını incelemek için en iyi modellerden biri olmuştur 3,5. Farelerde gastrulasyon hızlıdır, çünkü tüm gastrulasyon süreci embriyonik gün E6.5'ten E85'e kadar 48 saat içinde gerçekleşir.

Tek hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, vahşi tip fare embriyonik gelişiminin ayrıntılı haritalanmasını sağlayarak, gastrulasyon 3,4,6,7,8 sırasında embriyoların hücresel ve moleküler manzaralarına kapsamlı bir genel bakış sağlamıştır. Bununla birlikte, bu aşamalarda mutant embriyoların analizi daha az yaygındır ve genellikle FACS'a göre sıralanmış popülasyonlarla sınırlıdır 9,10. Kıt literatür, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların manipülasyonu ve tek hücreli hazırlanması ile ilgili teknik zorlukları yansıtmaktadır. Dinamik gastrulasyon sürecini yakalamak, özellikle mutant embriyoları anlamak için hızlı doğası nedeniyle zorluklar doğurabilir. Gebeliklerin zamanlaması ve senkronizasyonu çok önemlidir, çünkü zamanlanmış gebelikler arasındaki küçük farklılıklar bile mutant genden kaynaklanan gelişimsel bir fenotip olarak yanlış yorumlanabilir. Bu, mutant gen gastrulasyon sürecini etkilediğinde özellikle önemli hale gelir13,14. Bu çalışmada, vajinal tıkaçların (yani, çiftleşmeden sonra dişinin vajinasında oluşan pıhtılaşmış seminal sıvı kütlesi) görselleştirilmesi yoluyla senkronize gebelikler elde etmek için kılavuzlar oluşturulmuştur. Ek olarak, E6.5'ten E8'e kadar mutant gastrulasyon yapan embriyolardan sağlam tek hücreli veriler elde etmek için bir strateji tasarlanmıştır. Bu strateji, gebelik başına istenen genotipe sahip düşük embriyo sayısı ve embriyoların veya hücrelerin dondurulması-çözülmesinin neden olduğu canlılıktaki azalma ile ilişkili kısıtlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır.

Bu makale, vajinal tıkaçlar yoluyla zamanlanmış gebeliklerin oluşturulmasından tek hücrelerin/çekirdeklerin son dizilimine kadar optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yöntem, istenen genotipe sahip daha fazla sayıda embriyo elde etmek için senkronize gebelik sayısının nasıl artırılacağını, hücrelerin canlılığını artırmak için hücre/çekirdek izolasyonlarını ve aynı gün genotipleme protokolünü açıklar. Bu el yazması aynı zamanda farklı gastrulasyon zaman noktalarında embriyo izolasyonu sürecini de açıklamaktadır. Metodoloji, dizileme için nihai canlı embriyo hücrelerinin/çekirdeklerinin sayısını artırmaya yardımcı olur ve yüksek kaliteli dizileme verileri sağlar. Bu nedenle, bu yöntem, genotipleme gerektiren gastrulasyon yapan embriyoların tek hücreli çalışmaları için kapıları açacaktır.

Protokol

Bu protokol ve açıklanan tüm hayvan deneyleri resmi olarak onaylanmıştır ve Temple Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından oluşturulan ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği uluslararası yönergelerini takip eden kurumsal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır. Tarif edilen tüm fareler C57 / BL6N arka plan suşu üzerindeydi. Bu çalışmalarda hayvan sağlığı ile ilgili herhangi bir endişe gözlenmemiştir.

1. Üreme kolonisi ve zamanlanmış gebelikler

  1. Vajinal bir tıkaç görselleştirme ile gebelikleri zamanlayın. Fişin yapıldığı gün öğlen E0.5 olarak kabul edilir.
  2. Yontma ahşap yatak takımı ve kağıt yuvalama malzemesi içeren yatak malzemesi ile kafeslerde ev fareleri.
    1. Her kafeste fare yemeği, tatlı su ve bir zenginleştirme öğesi (örneğin, tünel ve yuvalama malzemesi) bulunur. Zamanlanmış üreme sırasında koloni bilgilerini günlük olarak takip edin ve toplayın.
    2. Farenin yaşı, dişi farenin sahip olduğu gebelik sayısı, erkek fare tarafından yerleştirilen tıkaç sayısı ve dişi fareler için kızgınlık aşaması (Şekil 2) gibi tüm bilgileri kaydedin.
      NOT: Zaten 1-2 kez doğum yapmış dişiler, sonraki gebeliklerde daha büyük yavru boyutları doğuracaktır.
  3. Zamanlanmış gebeliklere başlamadan önce, üremeden 1 hafta önce erkek fareyi tek başına bir kafeste barındırın. Üremenin başladığı hafta boyunca, kafeste erkek başına en az 1 dişi tanıtın.
    NOT: Onaylanmış hayvan protokolüne bağlı olarak, bir üreme kafesine 2-3 dişi eklenmesine izin verilebilir ve tıkaç oluşumunu artırmak için tercih edilir.
  4. Kafesler arasında senkronize gebelik şansını artırmak için en az 4 üreme üçlüsü (2 dişi fareye 1 erkek) kurun (diğer bir deyişle, aynı gün içinde birden fazla fiş). Bu, aynı gelişim aşamasında izole edilen embriyo sayısını artıracaktır.
  5. Öğleden sonra veya akşam saat 5'ten önce ideal çiftleşmeyi düzenleyin ve dişiler erkeğin kafesine yerleştirilir veya tam tersi olur. Üreme 4-5 gün içinde gerçekleşmezse, çiftleşme partnerlerini her gün değiştirmeyi düşünün.
    NOT: Ertesi sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edemiyorsanız, üreyen çifti bir gece önce ayırın (ör. hafta sonu/tatil günleri).
  6. Her gün sabahın erken saatlerinde vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin; sabah 9'dan önce tercih edilir.
    1. Vajinal tıkaçları kontrol etmek için dişi fareleri kuyruğun tabanından nazikçe kaldırın ve vajinal açıklığı gözlemleyin. Beyaz veya krem renkli jelatinimsi bir kütle arayın. Genellikle, vajinal tıkaç belirgin olabilir, ancak net değilse, cımbız alın ve vajinal açıklığı nazikçe araştırın. İzolasyon için yalnızca daha belirgin tapaları düşünün. Şekil 2C'ye bakın.
      NOT: Potansiyel bir hamileliği kaçırmamak için sabahları mümkün olduğunca erken vajinal tıkaçları kontrol etmek çok önemlidir. Fişler 12 saat sonra düşebilir veya çözülebilir.
      NOT: Bir tıkaç görülse bile, dişi farenin hamile olacağını garanti etmez. Kısmi bir tıkaç gözlenirse veya hiç gözlenmezse, ancak dişi farelerin vajinal açıklığının yakınında kızarıklık varsa, bu dişileri izolasyon için düşünmeyin, çünkü tıkacın yapışma olasılığı daha düşüktür. Çiftleşmeden sonra hamilelik olasılığı fare suşları arasında değişir ve çiftleşme sırasındaki kızgınlık döngüsünün fazına bağlıdır (Şekil 2).
  7. Vajinal tıkaç görüldüğünde, günü kaydedin. Vajinal tıkaçın görüldüğü aynı günün öğlen vakti E0.5 olarak kabul edilir. Dişi fareleri üreme kafesinden ayırın ve istenen gastrulasyon aşamasına bağlı olarak embriyoları izole edin.
    NOT: Bu yöntem, çiftleşme için kesin bir zamanlama sağlamaz. Geleneksel olarak, çiftleşmenin önceki gece gece yarısı civarında gerçekleştiği varsayılır. Sonuç olarak, embriyoların vajinal tıkaç görüldüğü gün öğlene kadar yarım günlük (E0.5) olduğu kabul edilir.

2. Gastrulasyon sırasında fare embriyolarının izolasyonu

  1. Embriyo izolasyonuna başlamadan önce, gerekli tüm reaktifleri ve ekipmanı hazırlayın.
    1. Alanı %70 etanol ile iyice temizleyin. Tüm diseksiyon aletlerinin (forseps ve makas) yıkandığından ve sterilize edildiğinden emin olun. Steril 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) /% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 20 mL DPBS-/- alın ve buzun üzerine yerleştirin.
    2. Brüt gelişimsel fenotiplemeye yardımcı olmak için iletilen bir ışık aşaması ve kamera ile bir stereomikroskop kullanarak tüm izolasyonları gerçekleştirin.
  2. Hamile fare barajına ötenazi yapın ve izolasyona hemen başlayın.
    1. Hamile barajı, CO2 akış hızı dakikada kafes hacminin %20'sini yer değiştirecek şekilde ayarlanmış bir CO2 odasına yerleştirin. Fareyi yakından izleyin ve solunum hareketlerinin olmadığını gözlemleyerek ölümü onaylayın.
    2. Solunum hareketlerinin yokluğundan sonra CO2 akışını 2 dakika daha koruyun. Servikal çıkık yaparak ötenaziyi onaylayın.
    3. Fareleri sağlam, düz bir yüzey üzerinde normal bir ayakta durma pozisyonunda konumlandırın. Daha sonra, bir elin baş parmağı ve ilk parmağı kafatasının tabanındaki boynun arkasına dayayarak, diğer elinizle kuyruk tabanını tutarak geriye doğru çekerken ileri ve aşağı doğru itin.
    4. Servikal omurların ayrılmasını hissederek çıkığın etkinliğini doğrulayın. Omurilik koptuğunda, oksipital kondiller ile birinci servikal vertebra arasında 2-4 mm'lik bir boşluk hissedilecektir.
      NOT: Hücre canlılığı etkileneceğinden, aynı anda birden fazla hamile baraja ötenazi yapmayın. İzofloran, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) veya eşdeğer bir kuruluş tarafından onaylanırsa alternatif bir anestezik ajan olarak kullanılabilir.
  3. Hamile barajını sırtına yerleştirin ve vajinal açıklığın yakınındaki alanı etanol ile sterilize edin.
    1. Diseksiyon makası ve cımbız kullanarak, vajinal açıklığın yakınındaki deri kıvrımını kaldırın ve hamile barajın rahmini yavaşça ortaya çıkaran V şeklinde küçük bir kesi yapın (Şekil 3 [sarı ok]).
    2. Hamile barajın uterus boynuzunu, bir ucunu cımbızla tutarak ve keserek, rahim ağzını çıkardığınızdan emin olarak inceleyin. Rahim boynuzunu buz üzerinde DPBS-/- içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 3).
      NOT: Embriyo izolasyon aşamasına bağlı olarak, rahim daha küçük veya daha büyük implantasyon bölgelerine (yani, bir ip üzerindeki 'inciler') benzeyecektir.
  4. Diseksiyon makası ve cımbızla, içindeki yaprak döken şişlikleri içeren her bir implantasyon bölgesini ('inciler') kesin ve buz üzerinde 6 cm'lik bir Petri kabına taze DPBS-/- yerleştirin (Şekil 3).
    NOT: Ortalama bir hamile barajında yaklaşık 6-8 implante edilmiş embriyo olacaktır.
  5. Bir implantasyon bölgesi alın ve stereomikroskop aşamasının üzerine 6 cm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin ve üzerine 500 μL DPBS-/- ekleyin. Mikroskobun ve ışık kaynağının odağını ayarlayın (Şekil 3).
    NOT: İmplantasyon bölgesinin boyutuna bağlı olarak, DPBS miktarı değişebilir; Amaç, implantasyon bölgesinin suya batırılması için yeterli DPBS'ye sahip olmaktır.
  6. İnce uçlu diseksiyon cımbızı kullanarak uterus kasını implantasyon bölgesinden çıkarın. Bir elinizle bir cımbız seti ile implantasyon bölgesini basılı tutun ve diğer elinizle uterus boynuzundan kesilen implantasyon bölgesinin ucuna yavaşça başka bir forseps çifti yerleştirin ve desidua şişliğini yavaşça ortaya çıkarın (Şekil 3).
    NOT: Rahim yüzeyini çok sert çekmeyin veya çekmeyin, çünkü yaprak döken şişliğin yırtılmasına ve hatta embriyonun parçalanmasına neden olabilir.
  7. Yaprak döken şişlik izole edildikten sonra, embriyoyu ortaya çıkarmaya devam edin.
    1. Yaprak döken şişliğin anti-mezotrial ucunu bir çift forseps ile tutun ve diğer çiftle, mezometriyal uçtan (yani, genellikle yaprak döken şişliğin daha sivri ucu) yaprak döken şişliğin boyutunun yaklaşık 1/4'ü kadar yatay bir kesim yapın.
    2. Şimdi, her iki forseps ile, yaprak döken şişliğin anti-mezotrial ucundan yavaşça itin ve embriyo taze kesilmiş mezometriyal uçtan dışarı çıkacaktır (Şekil 3).
      NOT: Embriyoyu kıracağı için yaprak döken şişliği yırtmayın. Gerekirse, yaprak döken şişliğin mezometriyal ucu boyunca daha küçük kesikler yapın.
  8. Embriyo ortaya çıktıktan sonra, bağlı olan ekstraembriyonik dokuları çıkarın.
    1. Parietal endodermal kese ve ektoplasental koni, açığa çıkarma işlemi sırasında embriyodan kendiliğinden çıkabilir, ancak değilse, bir çift forseps kullanın ve bunları ilişkili herhangi bir maternal kanla birlikte çıkarın. Daha sonra, iki forseps kullanarak, embriyoyu bir çiftle tutun ve diğer seti kullanarak viseral yumurta sarısı kesesini embriyodan yavaşça soyun.
    2. Bir P20 pipeti kullanarak, aynı gün genotipleme için kullanılacağından, tabaktan en fazla 10 μL DPBS-/- içeren yumurta sarısı kesesini buz üzerinde 8 şeritli bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne yerleştirin.
      NOT: Yolk kesesi örneğinin gebe barajından alınan doku ile kontamine olmaması çok önemlidir. Kontaminasyon, embriyonun yanlış genotip atamasına yol açabilir.
  9. Littermatların evrelemesinin benzer olduğundan emin olmak için yeni izole edilmiş embriyoların parlak alan resimlerini çekin. Bir P200 pipeti ile embriyoyu 50 μL DMEM /% 10 FBS ile yavaşça pipetleyin ve buz üzerinde 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Genotipler doğrulanana kadar embriyoların buz üzerinde kalmasına izin verin.
    NOT: Embriyolar belirgin bir bozulma olmadan 3-4 saat buz üzerinde tutuldu, ancak hücre canlılığında bir azalma olacağı için bu süreyi aşmayın. Embriyoları ve genotipleme tüplerini buna göre etiketleyin. Embriyolar arasındaki brüt fenotipik farklılıkları tanımlamak ve açıklamak için parlak alan görüntüleri almak teşvik edilir.
  10. Kalan tüm yaprak döken şişlikler için bu adımları tekrarlayın. Önceki izolasyonlardan kontaminasyon olmamasını sağlamak için tüm diseksiyon aletlerini temizleyin ve her izolasyon için yeni plastikler kullanın.
    NOT: Diseksiyon prosedürlerinin, implantasyon yerinin hamile barajından alındığı andan itibaren 1 saat ile sınırlı olduğundan emin olun.
  11. Aynı gün genotipleme adımına geçmeden önce embriyoları bir sonraki hamile barajdan (birden fazla senkronize gebelik tespit edilmişse) izole etmeye devam edin.

3. Aynı gün genotipleme (Şekil 4)

  1. Her bir viseral yumurta sarısı kesesini 8 şeritli bir PCR tüpünde sindirin. Bir P20 pipeti kullanarak, her bir yumurta yolu kesesi örneğine 19.3 μL PCR şablonu DNA lizis tamponu ve 0.7 μL 0.2 μg/mL Proteinaz K ekleyin.
  2. Numuneyi 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 10 saniye boyunca 1.000 x g'da bir şerit adaptörlü mini santrifüj kullanarak numuneleri tüpün dibine yerleştirmek için aşağı döndürün. 8 şeritli PCR tüpünü 45 dakika boyunca 85 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir 5 saniye girdap yapın.
    NOT: Hücre lizizini 45 dakikada en üst düzeye çıkarmak için sindirirken numuneleri vortekslemek önemlidir.
  3. 45 dakika sonra, tüp şeridini 10 saniye boyunca 1.000 x g'da bir şerit adaptörlü bir mini santrifüj kullanarak döndürün ve istenen genetik tanımlama için PCR ile devam edin. Referans olarak, bir Cre-lox sistemi için örnek bir protokol sağlanmıştır. Aşağıda, Cre genotiplemesi için PCR koşullarına bir örnek verilmiştir. Hedeflenen Cre bölgesinin 5' ve 3' bölgelerini güçlendirmek için astarlar tasarlayın.
  4. Cre genotiplemesi için PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 10 μL Taq DNA polimeraz karışımı, 0.5 μL 0.5 μM ileri Cre primeri, 0.5 μL 0.5 μM ters Cre primeri, 5 μL PCR sertifikalı su ve 4 μL yolk kesesi genomik DNA.
    NOT: Fare kuyruğu genotiplemesi için optimize edilmiş bir protokol kullanıyorsanız, daha temiz sonuçlar için tipik olarak kullanılan DNA miktarının iki katını ekleyin.
  5. PCR ana karışımı yapıldıktan sonra, PCR termal döngü amplifikasyon programını çalıştırın. Cre genotipleme için döngü şu şekildedir: (1) 3 dakika boyunca 95 °C, (2) 30 saniye boyunca 95 °C, (3) 30 saniye boyunca 55 °C, (4) 30 saniye boyunca 72 °C, 34 döngü için tekrarlanan adım 2-4, (5) 10 dakika boyunca 72 °C, (6) 4 °C tutun. Genotipleme sonuçları çıkarmak için PCR ürünlerini %1'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın.
    NOT: Genetik tanımlama için birden fazla PCR gerekiyorsa, zamanlamayı optimize etmek için PCR reaksiyonlarını aynı anda çalıştırın. İşlemi hızlandırmak için, agaroz jeli deney günü bir gün önceden hazırlayın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Net genotipleri olmayan hiçbir örneği dikkate almayın. Numuneler için hem genotipi hem de gelişim aşamasını dikkate alın, çünkü littermatlar gastrulasyonun farklı aşamalarında olabilir ve potansiyel olarak sonuçları çarpıtabilir. LoxP alellerinin genotiplemesi yapılırken, jelde beklenen PCR bantları, kullanılan Cre-sürücüsüne bağlı olarak değişebilir. Örneğin, Cre sürücüsü viseral yumurta sarısı kesesinde eksprese edilirse, Loxp bandı, Cre-negatif (Cre-) ile karşılaştırıldığında, Cre-pozitif (Cre+) embriyolarda kaymış görünecektir. Bununla birlikte, Cre viseral yolk kesesinde eksprese edilmezse, Loxp bandının boyutu Cre+ ve Cre- embriyolarında aynı boyutta olacaktır (yani, Loxp alelleri yolk kesesi soyunda floklanmayacaktır). Bir Cre + aleli ve iki Loxp aleli taşıyan bir embriyo, koşullu bir KO embriyosu olarak kabul edilir. Bununla birlikte, floklanmış genin silinmesini doğrulamak için, ya genotipleme protokolünü tekrarlayarak ya da floklanmış genin mRNA seviyelerinin qPCR analizi ile Cre sürücüsünü eksprese eden hücreler üzerinde genin nakavtının doğrulanması önerilir (Şekil 4D, E).
  6. Kalan sindirilmiş yumurta sarısı kesesi örneklerini uzun süreli saklama için -20 °C dondurucuda saklayın.

4. Embriyoların hücre ayrışması ve hücre canlılığı

  1. Genotipler onaylandıktan sonra, bir P200 pipeti alın ve 50 μL DMEM /% 10 FBS pipetleyin. Aynı genotipe sahip embriyoları 1.5 mL'lik yeni bir tüpe koyun ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Grup başına en az 5 embriyo (E7-E7.5) veya 3 (E7.75-E8) yoksa deneye devam etmeyin, çünkü hücre sayısı ve canlılığı büyük ölçüde azalacaktır.
  2. Embriyolar genotiplere göre toplandıktan sonra, tüpün dibine yerleşmelerine izin verin. Havuzlanan embriyoları 50 μL DPBS-/- ekleyerek yıkayın, ardından embriyoları tüpten çıkarmadan mümkün olduğunca fazla DPBS-/- çıkarmadan önce embriyoların oturmasını bekleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
    NOT: 1.5 mL'lik tüpü bir ışık kaynağına veya bir pencereye doğru tutmak, tüpün dibine yerleşen embriyoları görmeyi kolaylaştıracaktır.
  3. Havuzlanan embriyolara 100 μL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca bir ısı bloğunda inkübe edin. Hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için her 30 saniyede bir 1,5 mL'lik tüpleri hafifçe vurun.
    NOT: Hücrelere zarar verdiği için tripsinizasyon işlemi sırasında girdap veya pipet kullanmayın. 5'ten fazla embriyo (E7-E7.5) veya 3 embriyo (E7.75-E8) toplanırsa, eşdeğer miktarda tripsin (1 embriyo başına ~ 20 μL) içeren başka bir tüpte tripsin sindirimi gerçekleştirin. Embriyo başına ~ 20 μL tripsin (E6.5-E7.5), embriyo başına 35 μL (E7.75) ve embriyo için 40 μL (E8) kullanın.
  4. 5 dakika sonra, tripsini 300 μL DMEM /% 10 FBS ile nötralize edin. Havuzlanan embriyoları oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüm numuneler için küçük bir pelet görünecektir. Peletleri 40 μL DMEM/%10 FBS'de yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Peletin boyutu, toplanan embriyo sayısına bağlı olarak değişecektir. Peletin görünmemesi mümkündür, ancak bir sonraki adıma geçin. Tripsini nötralize etmek için gereken DMEM /% 10 FBS miktarı, eklenen tripsin miktarına bağlı olacaktır. Tripsin miktarına DMEM miktarının 3 katını /% 10 ekleyin.
  5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak yeniden askıya alınan hücrelerin konsantrasyonunu (40 μL) belirleyin. 5 μL hücreyi 5 μL tripan mavisi ile 1.5 mL'lik yeni bir tüpte karıştırın. Pipet iyice karıştırın ve hücre sayısını ve hücre canlılığını belirlemek için bir slayta pipetleyin. Optimal hücre konsantrasyonu 700-1200 hücre/μL'dir ve hücre canlılığı %90 veya daha yüksektir.
    NOT: Konsantrasyon 200 hücre/μL'den düşükse ve canlılık %50'den düşükse deneye devam etmeyin. Hücre konsantrasyonu çok yüksekse, hücre süspansiyonunu seyreltin ve hücreleri tekrar sayın. Hücre kümeleri gözlenirse, tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için bir hücre süzgeci kullanın.
  6. Mikroakışkan bir çip kullanarak tek hücreli bölümlemeye devam edin ve mikroakışkan çip üreticilerinin11 protokolünü izleyin.

5. Çekirdek izolasyonu fare embriyoları (E8'den itibaren daha büyük embriyonik zaman noktaları için seçenek)

  1. Tablo 1'de belirtilen taze lizis ve yıkama tamponlarını hazırlayın ve bunları buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Çekirdek izolasyonu, taze veya donmuş numuneler üzerinde gerçekleştirilebilir. Numuneler donmuşsa, buz üzerinde 2-5 dakika çözülmelerine izin verin.
  2. Deneye başlamadan önce, tüm genotipleri onaylayın ve sadece net genotiplere sahip embriyoları bir araya getirin.
  3. Bir P200 pipeti kullanarak, mutant grup başına en az 3 embriyo hedefleyerek 1.5 mL'lik bir tüpte toplanan embriyolara 50 μL çekirdek lizis tamponu ekleyin. Numunelerin lizis tamponu ile 5 dakika buz üzerinde oturmasına izin verin ve her 30 saniyede bir girdap yapın.
  4. 5 dakikalık inkübasyondan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Bir P200 pipeti kullanarak, süpernatanı çıkarın ve peleti 50 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alındıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı çıkarın ve 40 μL DPBS-/- içinde yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. 5 μL çekirdeği 5 μL tripan mavisi ile 1.5 mL'lik yeni bir tüpte karıştırın. Karışımı iyice pipetleyin ve hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için bir slayt üzerine yükleyin.
    NOT: Nükleer zar tripan mavisi geçirgendir; Bu nedenle, izole edilmiş çekirdek boyası tripan mavisi için pozitiftir. Otomatik bir hücre sayacında, izole edilmiş çekirdeklerin yüzdesini tahmin etmek için ölü hücrelerin yüzdesi kullanılır (Şekil 5A).
  6. Sağlam çekirdeklerin yüzdesi %90'dan büyükse (yani çekirdeklerin en az %90'ı tripan mavisi ile boyanmış ve yuvarlak bir şekil ve kabarık bir görünüm sergiliyorsa; Şekil 5B, C'ye bakın), bir mikroakışkan çip kullanmaya devam edin ve mikroakışkan çip üreticilerinin protokolünü takip edin11.

6. Tek hücreli bölümleme (cDNA amplifikasyonu ve kütüphane yapımı dahil)

  1. En optimum sonuçlar için mikroakışkan çip üreticisinin protokolünü11 takip ederek tek hücreli RNA dizileme protokolüne hemen devam edin. Hedef hücre kurtarmayı 6000 hücre veya daha büyük olarak ayarlayın.

7. Sıralama

  1. Kitaplıklar oluşturulduktan sonra, otomatik bir elektroforez analizörü kullanarak numunelerin parça boyutu dağılımını ve konsantrasyonlarını ölçün.
    NOT: Optimum parça boyutu dağılımları 300-1000 bp arasındadır.
  2. Numuneler sıralayıcıya yüklenmeye hazırdır. Farklı örneklerdeki kitaplıkları bir araya getirin. Havuzlanmış kitaplıkların son yükleme konsantrasyonu, toplam 24 μL'lik bir hacimde 750 pM'dir. Havuzlanan kitaplıkları, sıralama üreticisinin protokolünü12 izleyerek reaktif kartuşuna yükleyin.
  3. Önceden monte edilmiş akış hücresine ve kartuşa yüklenen kütüphaneleri, çift uçlu, çift indeksleme ile istenen sıralama derinliğine göre sıralayın. Mikroakışkan çip üreticileri tarafından özetlenen protokole bağlı kalan sıralama okumaları aşağıdaki gibidir:11: Okuma 1: 28 döngü, i7 İndeksi: 10 döngü, i5 İndeksi: 10 döngü ve Okuma 2: 90 döngü. Dizilemenin tamamlanmasının ardından veriler biyoinformatik analize tabi tutulur.
  4. Kalite kontrollerini gerçekleştirmek için biyoinformatik yöntemleri kullanır. Bu, dizilenmiş hücrelerin sayısının, hücre başına okumaların ve hücre başına eşlenen gen sayısının değerlendirilmesini içerir.
    NOT: En iyi sonuçlar için, sıralanan hücrelerin sayısı hedeflenen hücrelerin en az %80'idir. Hücre başına okuma sayısının en az 30.000 olması ve tespit edilen gen sayısının 3000'den yüksek olması önerilir (fare örnekleri için).

Sonuçlar

Bu yazıda tasarlanan metodoloji, özellikle E6.5'ten E8'e kadar tek hücreli omikler için embriyo örneklerinin hazırlanmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu sağlam boru hattı beş ana adımdan oluşur: senkronize zamanlanmış gebelikler, embriyo izolasyonları, aynı gün genotipleme, hücre ayrışması ve hücre canlılığının değerlendirilmesi (Şekil 1A). Sunulan veriler E7'den E7.5'e kadar olan zaman noktalarına odaklanırken, prosedürde küçük değişikliklerle (protokol boyunca notlara atıfta bulunulan) E8'e (Şekil 1B) kadar olan embriyolara uygulanabilir. Senkronize zamanlı gebelikler, iki dişi farenin bir erkek fare ile bir kafese yerleştirilmesiyle elde edildi. Vajinal tıkaçlar her sabah saat 10:00'dan önce kontrol edildi ve bir tıkaç gözlenirse, o gün öğlene kadar E0.5 olarak kabul edildi (Şekil 2A). Bu çalışmada, tıkaçlar için en uygun koşullar, kızgınlık veya proöstrus aşamasındaki bir dişi farenin, önceki üreme sırasında birkaç tıkaç başarıyla yerleştirme geçmişi olan bir erkekle eşleştirilmesini gerektirmiştir (Şekil 2B). Embriyo izolasyonları için sadece belirgin tıkaçlar düşünüldü (Şekil 2C).

Gelişimsel zamanlama, Şekil 2A'daki zaman çizelgesine göre tahmin edilmiştir. E7.5 için embriyo diseksiyonu, tıkaç tespit edildiği günü takip eden 7. günde saat 12'de başladı. Şekil 3 , E7.5'te başarılı bir embriyo izolasyonunu örneklemektedir. Gebe damına ötenazi uygulandıktan sonra uterus boynuzu diseke edildi, yaprak döken şişlik tek tek kesilerek embriyo ortaya çıkarıldı ve yumurta sarısı kesesi genotipleme için izole edildi (Şekil 3).

Aynı gün genotipleme, Şekil 4A'daki adımlar izlenerek embriyo izolasyonundan sonraki 3 saat içinde gerçekleştirildi. Embriyolar, bütünlüklerini korumak için genotipleme işlemi sırasında buz üzerinde tutuldu. Embriyo başına canlı hücre sayısını azaltacağı için embriyoları dondurmayın. Şekil 4B,C, viseral yumurta sarısı kesesini, parietal endodermal keseyi ve ilişkili maternal kanı ile ektoplasental koniyi göstermektedir. Genotipleme için viseral yolk kesesi kullanıldı (Şekil 4C). Yumurta sarısı kesesi sindirildikten sonra PCR karışımı hazırlandı ve PCR reaksiyonu çalıştırıldı. Elde edilen PCR ürünü daha sonra bir agaroz jeli üzerinde ayrıldı. Şekil 4D, LoxP ve vahşi tip aleller (sırasıyla 597 bp ve 498 bp) ve Cre aleli (650 bp) için beklenen parça boyutlarını göstermektedir. Şekil 4E'de, Cre ve LoxP (flox) alellerini taşıyan üreme çiftlerinden elde edilen 6 embriyodan yolk kesesi genotiplemesinin bir örneği sunulmuştur. Jeller, analiz edilen 6 embriyoda Cre ve LoxP alellerinin PCR ürünlerini göstermektedir. 2 ve 5 numaralı embriyolar 2 flox aleli ve 1 cre aleli taşır; bu nedenle, koşullu KO embriyoları olarak kabul edilirler (Şekil 4E, kırmızı noktalar). Embriyo 1 ve 3'ün 2 flox aleli vardır ancak Cre için negatiftir; Bu nedenle, flox kontrolleri olarak kabul edilirler. Embriyo 4, 2 flox aleline ve Cre aleli için soluk bir banda sahiptir, bu da "belirsiz" bir genotiple sonuçlanır. Bu embriyo daha fazla işlenmedi (alternatif olarak, deneyci, genotiplemeyi tekrarlamayı veya Cre eksprese eden hücreleri kullanarak koşullu KO'nun ikincil bir doğrulamasını gerçekleştirmeyi düşünebilir). Bu deneyde kullanılan Cre sürücüsünün viseral yolk kesesi15'te ifade edilmediğine dikkat etmek önemlidir; bu nedenle, LoxP alelleri, Cre-negatif olanlara kıyasla Cre-pozitif embriyoların jeli üzerinde kaymış görünmez.

Başarılı bir tek hücreli deney için hücre sayısı ve iyi canlılık gereklidir. Düşük hücre canlılığına, yüksek oranda ölü hücreye, topaklanmaya veya önemli kalıntılara sahip süspansiyonlar, daha sonraki işlemler için uygun değildir. En uygun koşullar, mikrolitre başına 700-1200 canlı hücre ve% >90 canlılıktır. Şekil 5A , hem iyi hem de optimal olmayan hücre canlılığını gösteren bir panel sunmaktadır. Aynı kriterler, Şekil 5B'de gösterildiği gibi çekirdek izolasyonu için de uygulanabilir. Bununla birlikte, tripan mavisinin değerlendirilmesinin hücrelerden ve çekirdeklerden farklı olduğuna dikkat etmek çok önemlidir: canlı hücreler tripan mavisi içermezken, canlı çekirdekler içerir. Hücreler/çekirdek süspansiyonu optimalse (%>90 canlılık), üreticinin prosedürlerini11 izleyerek mikroakışkan bir çip kullanarak tek hücreli bölmeye devam edin. Şekil 5C'de

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

Tartışma

Bu yazıda, gastrulasyon yapan fare embriyolarından yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları elde etmek için, erken gelişimde hücre kaderi spesifikasyon mekanizmaları üzerine çalışmaları kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış sağlam bir boru hattı sunulmaktadır. Bu yöntem, cinsiyet veya somatik genler gibi genotipler gerektiren embriyoların analizini optimize ederek gastrulasyon alanındaki çok önemli bir boşluğu giderir. Genetik mutasyon fare modellerini kullanarak ve tüm fare embriyoları üzerinde yüksek çözünürlüklü tek hücreli dizileme kullanarak, bu boru hattı erken fare gastrulasının gen ekspresyon profillerinin anlaşılmasını daha da artırabilir. Bu yöntem, tek hücreli omikler için erken gelişimsel zaman noktalarında yüksek kaliteli hücreler ve çekirdekler elde etmek için bir Cre rekombinaz sistemi ile bir genetik mutasyon fare modelinin kullanılmasının fizibilitesini göstermektedir. Bu yöntem, örneklerin kütüphane hazırlığı ve sıralaması için gerekli kalite standartlarını karşılamadığı çok sayıda denemeyle gelişti. Açıklanan metodoloji, üç kritik adımın optimizasyonu yoluyla E8'den daha genç embriyolardan yeterli hücre/çekirdek üretir: (1) embriyo sayısını artırmak için senkronize zamanlanmış gebelikler, (2) donmayı/çözülmeyi önlemek için aynı gün genotipleme ve (3) ölmekte olan hücrelerin dizilenmesini önlemek için hücre/çekirdek canlılığının değerlendirilmesi. Bu protokol, tek hücreli RNASeq ile başarılı sonuçlar verir, ancak bu protokolde elde edilen hücre veya çekirdek süspansiyonları, smart-seq, drop-seq ve cel-seq16 gibi hücre canlılığının sınırlayıcı faktör olduğu diğer dizileme platformlarında işlenebilir.

E7 embriyosunda, hücre sayısı suş ve mutant genotipe bağlı olarak değişebilir. Tipik olarak, bir E7 embriyosu yüzlerce ila birkaç bin hücre arasında değişebilir ve istenen genotipe sahip embriyoların elde edilmesi zordur, kriterleri karşılayan hamile baraj başına sadece 1 veya 2 embriyo vardır. Bu protokol, tek hücreli analiz için E7 embriyosu başına yaklaşık 300 canlı hücrenin yakalanmasına izin verir. Farklı günlerde hamile barajlardan embriyoları dondurarak embriyo havuzu boyutunu artırma girişimleri başarısız oldu, çünkü kriyoprezervasyon ajanlarının eklenmesiyle bile çözüldükten sonra hücre canlılığı ciddi şekilde tehlikeye girdi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gebe barajların üreme stratejisi ve senkronizasyonu optimize edildi. Çoklu izolasyon şansını artırmak için, daha büyük çöp boyutlarına sahip olma olasılıkları daha yüksek olduğundan, izolasyon için üremeden önce 1-2 kez doğum yapmış dişi farelerin kullanılması önerilir. Dişinin kızgınlık döngüsünün izlenmesi çok önemlidir; Çiftleşmenin proöstrus ve östrus aşamalarında meydana gelme olasılığı daha yüksektir. Üreme zorlukları ortaya çıkarsa, dört gün sonra üreme ortaklarının değiştirilmesi, fiş üretilmemesi durumunda da yardımcı olacaktır.

Bu yöntemin bir sınırlaması olduğuna dikkat etmek önemlidir: gözlemlenen fişlere dayanır ve bir tıkaç gözlense bile, hamileliği garanti etmez, sadece cinsel aktiviteyi gösterir. Bu nedenle, bir günde gözlenen tıkaç sayısının arttırılması, bir günde birden fazla gebe dam ve daha pozitif genotiplere sahip olma olasılığını artıracaktır. Bu protokol, gastrulasyon sırasında E7 ile E7.75 arasında değişen embriyonik aşamaların bir kavram kanıtı olarak kullanılmasının fizibilitesini göstermiştir. Ancak bu boru hattı E6.5'ten E8 embriyolara kadar uygulanabilir. E6.5 embriyoları için, istenen genotipe sahip en az 7 embriyonun havuzlanacak şekilde senkronize gebelik sayısının artırılması önerilir. Bunun yerine, E8 embriyoları için, her embriyoyu ayırmak için kullanılan tripsin miktarını 20 μL yerine ~ 40 μL'ye yükseltin. Amaç, bölmeye devam etmeden önce μl başına 700-1200 hücre konsantrasyon aralığında bir hücre/çekirdek süspansiyonu elde etmektir.

Tek hücreli dizilemenin başarısı için iyi hücre canlılığına sahip olmak çok önemlidir. Üreticiler tarafından sağlanan mikroakışkan çip tasarımında, tek hücreler, bilinen barkodlu jel boncukları içeren bir çip içinde jel boncuklara (GEM'ler) bölünür11. Bununla birlikte, bu işlemin dikkate değer bir sınırlaması, hem yüksek kaliteli hem de düşük kaliteli tek hücrelerin bölünebilmesidir. Yeterli sayıda canlı hücre (yani 1000 hücre / μL) ile bile, süspansiyonun canlılığı düşükse (yani, 1000 hücre canlı ve 1000 hücre ölü, bu da %50 canlılık ile sonuçlanır), sıralama deneyi muhtemelen başarısız olacaktır. En iyi sonuçlar için, yaklaşık% 90'lık bir canlılığın hedeflenmesi önerilir. Hücre canlılığı yaklaşık% 60 -% 89 arasındaysa, deneyin canlılığını artırmak için özel önlemler alınabilir. Bununla birlikte, hücre canlılığı %60'tan azsa, deneye devam edilmemesi şiddetle tavsiye edilir. Bunun nedeni, ölmekte olan hücrelerin bölme jelinde 'yakalanması' ve müteakip kütüphane hazırlığı ve kalite kontrollerinin gözle görülür bir sorun olmadan geçmesidir. Bununla birlikte, gerçek dizileme deneyi tamamen başarısız olabilir, çünkü sıralama okumalarının çoğu mitokondriyal, ribozomal veya apoptoz genlerini haritalayacak ve bu da başlangıçtan itibaren zayıf hücre canlılığının belirtilerini gösterecektir. Bu yazıda sunulan veriler, yüksek kaliteli hücrelere sahip gastrulasyon yapan fare embriyolarının tek hücreli dizilimi için bir boru hattını göstermektedir. Bu metodoloji, geliştirme sırasında birçok farklı genetik mutasyon fare modelinin anlaşılması için uygulanabilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Fox Chase Kanser Merkezi'ndeki Genomik Çekirdeği'ne ve dizileme deneyleri için teknik destek için Dr. Johnathan Whetstine laboratuvar üyeleri Zach Gray, Madison Honer ve Benjamin Ferman'a teşekkür ederiz. Dr. Estaras'ın laboratuvar üyelerine ve tek hücreli çalışmaların ilk analizine katkıda bulunan bir rotasyon yüksek lisans öğrencisi olan Alex Morris'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri tarafından finanse edilmektedir R01HD106969 ve Conchi Estaras'a R56HL163146. Ek olarak, Elizabeth Abraham, T32 eğitim hibesi 5T32HL091804-12 tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm Petri kabıGenesee Scientific25-202
1000 & mikro; L Reach Bariyer UcuGenesee Scientific23-430
20 & L Reach Bariyer UcuGenesee Scientific24-404
300 & L Reach Bariyer UcuGenesee Scientific24-415
37 & mikro; m Ters Çevrilebilir Süzgeç, küçükKök Hücre27215
6 cm Petri kabıGenesee Scientific25-260
8 şeritli PCR tüpleriGenesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch Product20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Kuru BanyoGenesee31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle SoğutmalıMikrosantrifüj Genesee33-759R
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA2153
Krom Kontrol Cihazı10XPN-1000127
Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3 'Reaktif Kitleri v3.110XPN-1000269
Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacıİnvitrojen
Kontes Hücre Toplama Odası SlaytlarıInvitrogenC10283
D1000 ReaktiflerAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR yumurta sarısı kesesiViagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tüpü 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco'nun Eagle's Medium'un Modifikasyonu (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco'nun PBSGenClone'u25-508
Dumont #5 İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları11254-20
Dumont #5SF ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-00
EtanolKoptecV1401
EVOS M7000 Görüntüleme SistemiInvitrogenAMF7000
İnce Makas - SharpFine Science Tools14060-11
GoTaq G2 Green Master MixPromegaM7823
Graefe ForsepsGüzel Bilim Araçları11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Termal DöngüleyiciUygulamalı BiyosistemlerA37834
NaClFisher KimyasalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reaktifleri (100 Döngü) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo MikroskopNikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
Nükleaz İçermeyen SuGenClone25-511
Optik Tüp 8x Şerit (401428)Agilent401428
Optik Tüp Kapağı 8x Şerit (401425)Agilent401425
Poseidon 31-511, HS24 Mikrosantrifüj, 24 x 1.5/2.0 mL rotorlu, 1 Santrifüj/BirimGenesee31-511
Proteinaz KSigma-AldrichP6556
Qubit dsDNA Kantifikasyon Test KitleriInvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
RNase inhibitörüFisher Scientific12-141-368
Standart Desen ForsepsGüzel Bilim Araçları11000-12
Teyp İstasyonu Yükleme ipuçlarıAgilent5067-5598
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Tris-HCL (Ph7)Kalite Biyolojik351-007-101
Tripan Mavi Leke %0.4Theromo Fisher ScientificT10282
Triple ExpressGibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vorteks karıştırıcı IKA MS3, 96 oyuklu numune plakası adaptörüIKA3617000
AMQAX2000 ile

Kaynaklar

  1. Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
  2. Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond. Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).
  3. Pijuan-Sala, B., et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).
  4. Mittnenzweig, M., et al. A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation. Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).
  5. Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate. Mech Dev. 163, 103617(2020).
  6. Argelaguet, R., et al. Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution. Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).
  7. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  8. Mohammed, H., et al. Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation. Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).
  9. Lescroart, F., et al. Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq. Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).
  10. Scialdone, A., et al. Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling. Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).
  11. Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2024).
  12. NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm (2024).
  13. Dai, H. Q., et al. TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling. Nature. 538, 528-532 (2016).
  14. Li, Q., et al. editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation. Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).
  15. Saga, Y., et al. MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube. Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Embriyosu Gastr lasyonuEmbriyo zolasyonuH cre Disosiasyonuekirdek zolasyonuGenotipleme ProtokolSoy Ba l lMikroak kan B l mlemeH cre Kader KararlarEmbriyonik K k H creler
Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.