Yöntem makalesi

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

DOI:

10.3791/66889

⸱

21 Haziran 2024

 ,  , 
1Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, 2Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sisteminden (CNS) türetilenler gibi doku kesitlerinde bağışıklık hücresi çeşitliliğini araştırmak için histolojinin kullanımı, tek bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısı ile kritik bir şekilde sınırlıdır. Çoğu bağışıklık hücresi alt kümesi, protein belirteçlerinin karmaşık kombinasyonları kullanılarak akış sitometrisi kullanılarak tanımlanmıştır, bu genellikle kesin olarak tanımlamak için dört veya daha fazla parametre gerektirir, bu da çoğu geleneksel mikroskobun yeteneklerinin ötesindedir. Akış sitometrisi dokuları ayrıştırdığından ve uzamsal bilgiyi kaybettiğinden, karmaşık hücre tiplerinin rollerini sorgularken uzamsal bilgiyi koruyabilen tekniklere ihtiyaç vardır. Bu sorunlar burada, spektral olarak örtüşen floroforların sinyallerini toplayarak ve her bir ayrı floroforun sinyallerini ayırmak için spektral karıştırma kullanarak görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişletmek için bir yöntem oluşturularak ele alınmaktadır. Bu görüntüler daha sonra yüksek parametreli histoloji görüntüleri almak ve bu görüntülerden tek hücreleri çıkarmak için bir analiz hattı kullanılarak işlenir, böylece her hücrenin benzersiz floresan özellikleri tek hücre düzeyinde analiz edilebilir. Akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanılarak, hücreler daha sonra alt kümelere ayrılabilir ve yalnızca bolluklarını ölçmekle kalmayıp aynı zamanda doku ortamıyla nasıl etkileşime girdiklerini belirlemek için histoloji bölümlerine geri eşlenebilir. Genel olarak, histoloji bölümlerinde karmaşık immün popülasyonları incelemek için histoflow sitometri kullanmanın basitliği ve potansiyeli gösterilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık sistemi hücreleri ve glial hücreler tarafından yönlendirilen iltihaplanma, her bir popülasyonun diğer 1,2,3'ün aktivitesini teşvik edebileceği CNS'nin kronik bozukluklarına katkıda bulunabilir. Bağışıklık sisteminin, CNS inflamasyonunu teşvik etmek için CNS'nin bu unsurları ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak şu anda önemli bir ilgi konusudur ve tek hücreli RNA dizilimi gibi yüksek parametreli tekniklerle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi sayesinde, çeşitli CNS bozukluklarındaglial hücreler ve bağışıklık sistemi arasında geniş bir iletişim olduğunu keşfettik 4,5,6. Bu etkileşimlerin bu bozuklukları nasıl etkilediğini anlamak, bu hastalıkların biyolojisini aydınlatmak için çok önemli olacaktır.

Tek hücreli dizileme analizleriyle ilgili bir sorun, bu tekniklerin tek hücreler veya çekirdekler elde etmek için dokunun bozulmasını gerektirmesi ve bunun da tam bir uzamsal bilgi kaybına neden olmasıdır. Bir hücrenin bir dokuda nerede bulunduğunu bilmek, hücrenin iltihabı yönlendirmedeki rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, B hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, nöroinflamasyon sırasında CNS'de konsantre olabilir; bununla birlikte, nadiren CNS parankimine girerler ve bunun yerine CNS bariyerlerine7 konsantre olurlar. Lokalizasyonları göz önüne alındığında, bu hücrelerin CNS parankimindeki glial hücrelerle fiziksel olarak etkileşime girerek CNS inflamasyonuna katkıda bulunmaları olası değildir, bu da glial hücrelerle sahip olabilecekleri herhangi bir etkileşimin salgılanan faktörler yoluyla gerçekleşeceğini düşündürür. Ek olarak, CNS bozukluklarında ortaya çıkan patoloji genellikle 8,9 yapısına sahiptir, öyle ki bir hücrenin dokudaki lokalizasyonu, bozukluğa aktif olarak katkıda bulunup bulunmadığını veya bir seyirci olup olmadığını kritik olarak belirleyebilir. Bu nedenle, bir hücrenin patolojideki rolünü değerlendirmek için uzamsal yönelimin kullanılması esastır.

Dokudaki hücrelerin incelenmesi tipik olarak immünohistokimya veya immün floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniklerle ilgili bir sorun, tipik olarak aynı anda en fazla dört parametreyi görüntüleyebilmeleridir. Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme analizlerinden bildiğimiz gibi, birçok hücre popülasyonunun tanımlanması için iki veya daha fazla parametreye ihtiyaç duyduğunu bildiğimiz için, bu teknikler için önemli bir sınırlamadır; Ayrıca, bir hücre tipi10'un belirli alt kümelerini ararken gereken parametrelerin sayısı tipik olarak artar. Bu nedenle, hücre alt kümelerinin bir doku içinde nasıl etkileşime girebileceğini incelemek için standart görüntüleme tekniklerini kullanmak pratik değildir.

Bu sorun, uzamsal RNA dizilimi11 ve görüntüleme kütle sitometrisi12 gibi uzamsal bilgileri koruyabilen daha yeni yüksek parametreli yöntemlerle kısmen aşılmıştır. Bu teknikler değerli olsa da, yaygın olarak bulunamama, üç boyutlu verileri iki boyuta indirgeme ve yürütme konusunda önemli uzmanlık gerektirme gibi çeşitli sorunları vardır. Dokuların bir antikor seti ile boyandığı ve ardından başka bir antikor seti ile boyanmadan önce önceki antikor setinin inaktive edildiği sıralı boyama olarak bilinen başka bir teknik, özel ekipman veya uzmanlığa ihtiyaç duymadan yüksek parametreli histoloji elde edebilir 13,14,15. Bununla birlikte, sıralı boyama son derece emek yoğun olabilir ve büyük miktarda mikroskopi süresi gerektirir, bu da kişisel mikroskobu olmayan laboratuvarlar için pratik olmayabilir. Bu nedenle, yaygın olarak bulunan mikroskoplarda bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını ve zamanında genişletilebilen tekniklere ihtiyaç vardır.

Yüksek parametreli veriler elde edildikten sonra, başka bir sorun ortaya çıkar: geleneksel görüntü analizi yöntemlerinin verileri başarılı bir şekilde analiz etmesi pek olası değildir. Manuel sayma veya eşikleme gibi teknikler, yalnızca analiz tek bir parametreden oluşuyorsa veya yalnızca çakışan sinyallerin sayıldığı birden fazla işaretleyici aynı lokalizasyona sahipse geçerlidir. Bu sınırlama, geleneksel analizi yüksek parametreli veri kümeleriyle çalışmak için yetersiz hale getirir. Bu veri kümelerinin başarılı analizi, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin bölümlere ayrılması ve ardından hücre tiplerini tanımlamak için akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yürütülmesiyle elde edilmiştir16,17. Bununla birlikte, bu analizleri etkileyen bir diğer konu da, yalnızca ilgilenilen tüm hücrelerin fiziksel olarak birbirinden ayrıldığı veri kümeleri için çalışmalarıdır, çünkü bu teknikler fiziksel temas halinde olan hücreleri doğru bir şekilde ayırabilecek yöntemler kullanmaz. Bu nedenle, hücreler fiziksel temas halinde olsa bile histoloji kesitleri üzerinde tek hücreli analizler yapabilen daha yeni bir yöntem gereklidir.

Bu makalede, daha önce tanıtılanve yaygın olarak bulunan mikroskoplar kullanılarak aynı anda görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişleten histoflow sitometri adı verilen basit bir protokol açıklanmaktadır 18. Bu protokol, dokuları spektral olarak örtüşen boyalarla boyayarak ve daha sonra net tek lekeler elde etmek için üst üste binen kanallardan kanamayı gidermek için spektral kompanzasyon kullanarak çalışır. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin analizini kolaylaştırmak için, akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanarak hücreleri farklı popülasyonlara ayırmak amacıyla doku bölümlerinden tek hücreleri çıkaran ayrıntılı bir analiz hattı açıklanmaktadır. Bu protokol, hücrelerin yaygın olarak bulunduğu dokularda ve hücrelerin birbirine sıkı sıkıya sıkıştırıldığı dokularda çalışır ve bu tekniği hem homeostaz hem de nöroinflamasyonda CNS gibi dokuların incelenmesi için çok yönlü hale getirir. Bu nedenle, histoflow sitometri, uzamsal bilgileri korurken hücreleri tanımlamak için birden fazla hücre işaretleyicisi gerektiren karmaşık hücre tipleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı bir tekniktir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol histoloji için dokuların kesitini kapsamaz; histoloji için dokuların nasıl kesileceğine dair açıklamalar için lütfen Jain ve ark.18 veya19'a bakınız. Bu protokol, cam slaytlar üzerindeki herhangi bir kesitli doku ile kullanılabilir. Bu makale, daha önce tarif edildiği gibi aşılanmış bir hayvandan izole edilen kasık lenf nodlarını kullanır18. Bu protokolün prosedürü ve zaman çizelgesi Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Boyama dokusu bölümleri

NOT: Araştırmacının ilgilendiği tüm antikor etiketleriyle dokuları boyamaya ek olarak, araştırmacı ayrıca bitişik veya başka bir şekilde aynı doku slaytları üzerinde tek renk kontrolleri (kullanılması amaçlanan her floresan parametresi için bir tane) hazırlamalıdır, burada her bir renk kontrolü, bir floresan parametresinin sinyalini üretmek için gereken reaktiflerle boyanır.

  1. Perma ve blokaj tamponu ve Perma ve boyama tamponu hazırlayın (kompozisyon için Tablo 1'e bakınız).
  2. Cam slaytlardaki doku bölümlerini oda sıcaklığında çözün ve bir mendil kullanarak yoğuşmayı silin. Lekelenmesi gereken doku(lar)ın sınırını belirlemek için hidrofobik bir işaretleyici kullanın ve işaretlerin kurumasını bekleyin.
  3. Doku bölümlerini 1 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bekleterek dokuları yeniden sulandırın. PBS'yi sallayın ve dokuya doğrudan dokunmadan fazla PBS'yi çıkarmak için bir mendil kullanın.
  4. Dokuyu tamamen kaplayacak kadar %4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek dokuları sabitleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
    DİKKAT: PFA toksik olabilir ve çeker ocak içinde kullanılmalıdır.
    NOT: Bu adım yalnızca taze donmuş doku için gereklidir. Doku zaten sabitse, bu adımı göz ardı edin. PFA fiksasyonu burada açıklanmıştır, ancak doku, deneyin ihtiyaçlarına bağlı olarak diğer yöntemler kullanılarak sabitlenebilir.
  5. Mendilleri bir PBS banyosunda 1 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın ve ardından slaytı banyodan çıkarın. PBS'yi değiştirin ve yıkamayı 3 kez daha tekrarlayın.
  6. Fazla PBS'yi silkeleyin ve dokuya doğrudan dokunmadan fazla PBS'yi çıkarmak için bir mendil kullanın.
  7. Protokolün 1.12. adımında hangi ikincil antikorların kullanılması gerektiğini ve ikincil antikorların türetildiği hayvan türlerini belirleyin. Bu hayvanlardan Perm'e serum ekleyerek ve tamponu her tür için% 5'lik bir nihai konsantrasyona kadar bloke ederek Perma'yı ve bloke edici tamponu güçlendirin.
    NOT: İkincil antikorların kullanılması, sinyal yoğunluğunu yükseltmeye yardımcı olur. Bu nedenle, zayıf sinyaller üreten birincil antikorların, sinyallerini yükseltmek için ikincil antikorlarla eşleştirilmesi önerilir. Boyanan tüm antikor hedefleri ikincil antikorlara ihtiyaç duymayacak kadar parlaksa, adım 1.7-1.12 ve adım 1.15 atlanabilir.
  8. Her dokuyu kaplayacak kadar güçlendirilmiş Perm ve bloke edici tampon ekleyerek antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin. Slaytları ışıktan korunan nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1-8 saat inkübe edin.
  9. Deneysel olarak belirlenen seyreltmelerde Perm ve boyama tamponuna konjuge olmayan birincil antikorlar ekleyin (birincil antikorların türleri veya immünoglobulin izotiplerinin tümü farklı olmalı ve araştırmacının adım 1.12'de kullanmayı planladığı ikincil antikorlar tarafından ayırt edilebilir olmalıdır).
  10. Perma ve bloke edici tamponu boşaltın ve dokuya doğrudan dokunmadan fazla tamponu çıkarmak için bir mendil kullanın. Dokuyu kaplayacak kadar Perma ve primer antikorlar içeren boyama tamponu ekleyin ve slaytı 4 ° C'de 12-48 saat inkübe edin.
    NOT: Araştırmacının antikor inkübasyonu için en uygun zamanı belirlemesi gerekecektir.
  11. Engelleme tamponunu ve boyama tamponunu hazırlayın (Tablo 1).
  12. Deneysel olarak belirlenen seyreltmelerde adım 1.11'de hazırlanan boyama tamponuna ikincil antikorlar ekleyin. Kullanılan ikincil antikorlar, adım 1.9'da kullanılan aynı türleri veya antikor izotiplerini hedeflemelidir.
  13. Söndürme tamponunu hazırlayın ( Tablo 1'deki gibi).
    NOT: Bu adım, dokudaki otofloresanı azaltmaya yardımcı olur. Bu gerekli değilse, 1.13 ve 1.14 adımları atlanabilir.
  14. Mendilleri adım 1.5-1.6'da anlatıldığı gibi yıkayın. Daha sonra slaytların üzerindeki dokuları kaplayacak kadar su verme tamponu ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 1-2 dakika inkübe edin.
  15. Mendili 1.5-1.6 adımlarında anlatıldığı gibi yıkayın. Daha sonra, adım 1.12'de hazırlanan boyama tamponunda seyreltilen ikincil antikorları, dokular tamamen boyama tamponu ile kaplanacak şekilde dokulara ekleyin. Slaytları 4 ° C'de 2-8 saat inkübe edin.
  16. Adım 1.18'de kullanılacak antikor türlerinden (her türün %5'i) 50 μL normal serumu, adım 1.11'de hazırlanan bloke edici tampona ekleyerek blokaj solüsyonunu hazırlayın.
  17. Mendilleri adım 1.5-1.6'da anlatıldığı gibi yıkayın. Daha sonra, adım 1.16'da hazırlanan normal serum ile blokaj solüsyonunu dokulara tamamen boyama tamponu ile kaplanacak şekilde ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 1-8 saat inkübe edin.
  18. Adım 1.11'de hazırlanan boyama tamponuna deneysel olarak belirlenmiş seyreltmelerde florofor konjuge primer antikorlar ekleyerek boyama solüsyonunu hazırlayın. Ayrıca, deneysel olarak belirlenmiş bir seyreltmede boyama çözeltisine nükleer sarı gibi bir nükleer leke ekleyin.
    NOT: Adım 1.18-1.19, yalnızca araştırmacının sinyal amplifikasyonu için ikincil antikorlar gerektirmeyen ek antikor etiketleri kullanması gerekiyorsa gereklidir. Birincil konjuge antikorlar kullanılmıyorsa, adım 1.12'de çekirdek boyaları eklenebilir.
  19. Bloke edici tamponu sallayın ve dokuya doğrudan dokunmadan fazla tamponu çıkarmak için bir mendil kullanın. Adım 1.18'de hazırlanan boyama solüsyonunu dokuya kaplayacak kadar ekleyin ve 4 ° C'de 12-48 saat inkübe edin.
  20. Mendilleri adım 1.5-1.6'da anlatıldığı gibi yıkayın. Kabarcıklar oluşturmadan her slayta 5 damla mountant ekleyin ve dokuyu tamamen mountant ile kaplamak ve tüm hava kabarcıklarını dışlamak için dokunun üzerine nazikçe ve yavaşça bir cam lamel eğin. Slaytları görüntülenmeye hazır olana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.

2. Doku kesitlerinin görüntülenmesi

NOT: Bu aşamada, doku kesitleri, görüntülenmesi amaçlanan tüm durumlar için ilgilenilen tüm antikorlarla boyanır ve tek renkli kontroller, her bölümde bir floresan parametre ile boyanır. Görüntüleme, belirli ışık aralıklarını tespit etmek için ayarlanabilen birden fazla dedektöre sahip bir mikroskopta yapılmalı ve ideal olarak, uyarma için mümkün olduğunca çok sayıda lazer çizgisine erişimi olmalıdır.

  1. Tamamen lekeli slaytlardan birini mikroskoba yerleştirin ve mikroskobu, veri toplamak için kullanılması amaçlanan hedefi kullanarak bölümü görüntüleyecek şekilde ayarlayın.
  2. Dokunun boyandığı floroforlara dayanarak, bu floroforları uyarmak için gereken uyarma lazer çizgilerini belirleyin ve en fazla miktarda sinyal içeren her bir florofor için emisyon aralıklarını belirleyin.
    NOT: Çevrimiçi floresan spektrum görüntüleme araçları (örneğin, Malzeme Tablosuna bakın), floroforların en uygun uyarma dalga boylarını belirlemek ve florofor tespiti için en uygun aralıkları belirlemek için yararlı olabilir. Histoflow sitometrisi için kullanılan floroforlar, her bir floroforun, floroforun uyarıldığı optimal lazer hattında farklılık göstereceği veya optimum emisyon dalga boyları aralığına göre farklılık göstereceği şekilde seçilmelidir. Daha yakın uyarma/emisyon dalga boylarına sahip floroforların ayrılması daha zor olacaktır. Bu çalışma için kullanılan floroforlar sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır.
  3. Yazılım 1'i (Malzeme Tablosuna bakın) konfokal mikroskopta açın ve üst kısımdaki konfigürasyon sekmesini seçin. Ardından sol taraftaki donanım düğmesini seçin ve bit derinliğini 16 bit olarak değiştirin.
    NOT: Spektral telafisinin doğruluğunu artıracağı için veri toplama için 16 bit veri gibi daha yüksek bit derinliklerinin kullanılması önerilir. Ek olarak, daha yüksek piksel yoğunlukları, satır ortalamaları için daha büyük sayılar ve z-yığınında daha fazla adım, spektral ayrımın kalitesini artıracaktır.
  4. Ekranın üst kısmındaki Al sekmesini seçin ve görüntünün piksel yoğunluğunu dahil etmek için biçim ayarını girin (genellikle daha yüksek çözünürlükler daha iyi sonuçlar verir).
  5. Varsa, bu özelliğin yeterince kalibre edilmiş olması koşuluyla, görüntüleme süresini hızlandırmak için çift yönlü X alımını seçin.
  6. Konfokal mikroskop için bir iğne deliği değeri seçin (tipik olarak 400-600 nm arasında), daha küçük değerlerin tipik olarak daha yüksek kaliteli histoflow sitometri sonuçları üreteceği yerde, daha küçük iğne deliği değerleri görüntü elde etmeyi zorlaştıracak ve ek görüntüleme süresi gerektirebilecek veya daha yüksek uyarma yoğunlukları üretebilir.
  7. Sıralı tarama seçeneğini açmak için sol menünün üst kısmındaki Sıralı Tarama Panelini Göster'i seçin. Ek diziler oluşturmak için '+' işaretini kullanın, burada her bir dizi, adım 2.2'de kararlaştırılan bir uyarma dalga boyunu içerecektir.
  8. Ekranın ortasındaki ilgilenilen lazerlerle ilişkili AÇIK düğmelerine tıklayarak ihtiyaç duyulan tüm lazerleri AÇIK duruma getirin. Her bir özel diziye gidin ve ekranın ortasındaki lazer gücünü, her dizinin bir uyarma dalga boyunun kullanılacağı istenen değere yükseltin.
  9. Bu lazer çizgisinde görüntülenecek tüm floroforları görüntülemek için her dizide ekranın alt kısmında gerektiği kadar dedektör açın . Dedektörlerin aralıklarını , aralıklarına çift tıklayarak ve toplanması gereken üst ve alt dalga boyu aralıklarını girerek ayarlayın.
    NOT: Mümkün olduğunda yüksek hassasiyetli dedektörlerin kullanılması önerilir ve ideal olarak, bu gerekli olmasa da tüm kanalların aynı tip dedektörlerde toplanması gerekir.
  10. Canlı düğmesine basın, ardından örneğe odaklanın. Kanalların sinyale yeterince doygun olup olmadığını değerlendirmek için yazılımdaki görüntünün solundaki Otomatik Ölçek düğmesini kullanın. Kullanıcı, otomatik ölçeklendirme maksimum değere (16 bit veriler için 65535) ulaşmayana ancak tüm kanallar için doygunluğa çok yakın olana kadar her dizideki kazanç değerlerini ve lazer yoğunluklarını ayarlamalıdır.
    NOT: Farklı floroforların parlaklıkları ve farklı antikor hedefleri bollukları açısından farklılık gösterebileceğinden, her iki florofor da aynı lazer tarafından uyarılırsa, dedektörlerin hassasiyetinin parlak sinyaller için düşük hassasiyet ve loş sinyaller için yüksek hassasiyet olacak şekilde ayarlanması gerekecektir (bu senaryoda her iki florofor da etkileneceğinden lazer yoğunluğu değişemez). En iyi sonuçlar için, deneydeki her kanaldan gelen floresan sinyali, her kanalın kabaca eşdeğer miktarda sinyale sahip olması için dengelenmelidir, bu da diğer kanallara spektral sızıntıyı azaltacak ve daha güçlü sinyallerle sonuçlanacaktır. Farklı numuneler, boyanan ilgilenilen belirteçlerin bolluğu açısından farklılık gösterebileceğinden, deney koşullarının hiçbirinde ağartmanın meydana gelmediğini doğrulamak için mikroskop ayarlarının birden fazla deney koşulunda test edilmesi önerilir.
  11. Mikroskop ayarları tamamlandıktan sonra, mikroskobu tek renk kontrol slaytlarıyla yükleyin ve her florofor için temsili boyama bulun. Örneğin altına odaklanarak ve z yığını menüsündeki başlat düğmesine basarak, ardından örneğin üzerine odaklanarak ve sonlandır düğmesine basarak bir Z yığını ayarlayın.
  12. Adım sayısını ve adımlar arasındaki mesafeyi seçin (ve tamamen lekeli slaytları görüntülemek için kullanılacak piksel yoğunlukları ve bit derinliği gibi aynı sayıda adım ve parametre kullanın), ardından başlat düğmesine basın.
    NOT: İdeal olarak, bu görüntüler slaytta bulunabilecek gerçek boyamadan gelen en parlak sinyalleri içermelidir.
  13. Tek renk kontrolleri görüntülendikten sonra, tamamen lekeli tüm numuneleri görüntülemek için aynı mikroskop ayarlarını kullanmaya devam edin.

3. Floresan telafisi

  1. Yazılım 1'de .lif dosyalarını açın ve işlem sekmesine tıklayın.
  2. Boya Ayırma modülünü seçin ve ardından Otomatik Boya Ayırma seçeneğini seçin. Boya Ayrımı için El ile yöntemini seçin ve yeniden ölçeklendirme yok'u seçin.
  3. Tek renkli kontrol görüntülerinden birini açın. Uygun olmayan kanallarda bir sinyal kanıtı olup olmadığını görmek için her kanal için gri tonlamalı pencereleri gözlemleyerek bir kanaldan diğerine spektral taşma için tek renk kontrollerini manuel olarak inceleyin. Zayıf taşmayı görmek için gerekirse Otomatik Ölçeklendir düğmesini kullanın.
  4. Ekrandaki matrise manuel olarak sayılar girerek (genellikle 0-1, burada 0 taşma olmamasını ve 1 %100 taşma payını temsil eder) taşma payını kaldırmaya başlayın ve ardından taşma payının yeterince kaldırılıp kaldırılmadığını test etmek için uygula düğmesine basın. Bu, ilgilenilen kanal dışındaki diğer tüm kanallardaki sinyaller arka plan seviyelerine düşürülene kadar tekrarlanmalıdır.
    NOT: Aşırı kompanzasyon yanlış sonuçlara yol açacaktır, bu nedenle floresan arka plan seviyelerine düşürülmeli, ancak bunların altına düşürülmemelidir. Aşırı kompanzasyonlu veriler, bir kanalın bir sinyale sahip olması ve diğer kanalların ilgilenilen sinyalin olduğu yerde kara deliklere sahip gibi görünmesi olarak görünecektir (Şekil 2).
  5. Tek renkli denetimlerden biri tamamlandığında, değerleri matrise kaydedin ve ardından matrisi sıfırlayın ve bir sonraki tek renkli denetime geçin. Her bir renk kontrolü için bu işlemi tekrarlayın.
    NOT: İlk boya Boya 1 satırında olacak ve Boya 1'den çıkarılması gereken floresan miktarı bitişik sütunlarda olacaktır.
  6. Her kontrolden elde edilen tüm değerleri tek bir matriste birleştirin ve bu matrisi tamamen lekeli bir numuneye uygulayın . Renk ayrımı doğru görünüyorsa, ayarları deneydeki tüm görüntülere uygulayın, aksi takdirde tek renk kontrollerini yeniden değerlendirin.
    NOT: Etkili kompanzasyon, Şekil 3'te özetlendiği ve gösterildiği gibi, kanallar arasındaki taşma payının çoğunu ortadan kaldırmalıdır.
  7. Telafi edilen tüm dosyaları ayrı bir .lif dosyasına kaydedin.

4. ilastik kullanarak çekirdek ve hücrelerin tanımlanması

  1. Telafi edilmiş .lif dosyalarını FIJI20'de açın. Yığınları bir hiper yığında görüntülemeyi etkinleştirin ve bir görüntü seçin.
  2. (İsteğe bağlı) Görüntünün analiz edilecek kısımlarını dahil etmek ve analiz edilmeyecek alanlarını dışarıda bırakmak için dikdörtgen aracı gibi bir seçim aracı kullanın. Görüntü > kırpma işlevini kullanarak görüntüyü kırpın.
    NOT: Görüntünün boyutunu küçültmek, rasgele erişimli bellek (RAM) tüketimini azaltmak ve işlem hızını artırmak için sonraki adımlarda yararlıdır.
  3. Görüntüyü .tif dosyası olarak kaydedin. Ayrıca, ilastik > Eklentiler > Dışa Aktar hdf5'e tıklayarak FIJI için ilastik eklentisini kullanarak görüntüyü bir hdf5 dosyası olarak kaydedin. Dosyayı 0 sıkıştırma ile "tercih edilen ad".h5 olarak kaydedin.
  4. Ilastik21'i açın ve bir piksel sınıflandırma projesi yapın. Yeni giriş verileri eklemeye giderek en az 3 temsili görüntü eklemek için Yeni Ekle > Ayrı Görüntü Ekle işlevini kullanın.
  5. Görüntülerden birine sağ tıklayın, Özellikleri düzenle'yi seçin ve Görüntü Modunu gri tonlamalı olarak değiştirin.
  6. Ekranın sol tarafında, özellik seçimi sekmesini seçin. Özellikleri seç'e tıklayın ve programın kullanmanıza izin vereceği en yüksek sigma değerine kadar olan tüm özellikleri seçin, ardından Tamam'a basın.
  7. Şimdi Eğitim sekmesini seçin. İlgilenilen hücreleri (Şekil 4) iç kısım (sitoplazma ve çekirdek) ve hücre zarı vurguya dahil edilecek şekilde vurgulamak için boya fırçası aracını (birinci etiket seçiliyken) kullanın.
  8. Bunu, ilgilenilen tüm hücre tiplerinin seçildiği tüm eğitim örneklerinde tekrarlayın ve her örnekten dokuda farklı yoğunluklarda, morfolojilerde ve lokalizasyonlarda birden fazla hücre seçilmelidir.
    NOT: Tek bir leke seti için seçilen belirteçlere bağlı olarak, ilgilenilen hücreler için hücre içi lekeler veya hücre zarı lekeleri olabilir veya olmayabilir. Hangi işaretleyiciler kullanılırsa kullanılsın, vurgunun ilgilenilen hücreler üzerindeki en dıştaki lekeyi içerdiğinden ve hücre içi bir leke kullanılıp kullanılmadığına bakılmaksızın hücre içini içerdiğinden emin olun.
  9. Ardından, ilgilenilen hücreler olmayan her şeyi vurgulamak için ikinci etiketi kullanın (Şekil 4). Bu, boş alanı, etiketlenmemiş çekirdekleri veya ilgilenilen belirteçleri olmayan dokuları içerebilir. Kesin hücre sınırlarının öğrenilmesini teşvik etmek için ilgilenilen hücrelerin hemen yanındaki alanı dahil ettiğinizden emin olun.
  10. İlgilenilen görüntülerle ilgili eğitimin kalitesini değerlendirmek için Canlı Güncelleme işlevini kullanın. Eğitim yetersizse, 4.7 ila 4.9 arasındaki adımlarda eğitime devam edin. Aksi takdirde, tatmin ediciyse, Tahmin Dışa Aktarma sekmesine tıklayın.
  11. Kaynağı olasılıklar olarak ayarlayın. Görüntü Ayarlarını Dışa Aktar Seç düğmesine tıklayın, ardından c parametresini 0-1'i dışa aktaracak şekilde ayarlayın (etiket 1'in ilgilenilen parametreleri vurguladığı varsayılarak).
  12. Veri türünü 16 bitlik bir Tamsayıya dönüştürün ve ilgilendiğiniz adla ilgilendiğiniz dizine bir hdf5 dosyası olarak dışa aktarın ({takma ad} mask.h5 kullanmanızı öneririz), ardından Tamam'a basın.
  13. Toplu İşleme sekmesine tıklayın. Ham Veri Dosyalarını Seç düğmesine basın, işlenmesi gereken tüm .h5 dosyalarını seçin ve ardından Aç'a basın. Tüm dosyaları işle'ye tıklayın.
  14. 4.4 ila 4.13 arasındaki adımları tekrarlayın, ancak hücreleri tanımlamak yerine, şimdi çekirdekleri tanımlayın ve diğer her şeyi hariç tutun (Şekil 4). Bunu, hücre çekirdeklerini tanımlamak için ayrı bir tahmin olarak dışa aktarın.
  15. İlastik'i açın ve yeni bir Veri Dönüştürme projesi oluşturun. Yeni Ekle > Ayrı Görüntü Ekle işlevini kullanarak Giriş verileri sekmesine temsili bir hdf5 dosyası ekleyin.
  16. Veri Dışa Aktarma sekmesine tıklayın ve Kaynak giriş olarak ayarlanmış olarak Görüntü Ayarlarını Dışa Aktar Ayarlarını Seç düğmesini seçin. Formatı çok sayfalı tiff olarak değiştirin, select işleviyle bir kaydetme konumu seçin ve dosyanın adını {nickname} olarak ayarlayın. Tamam'a basın.
  17. Toplu işleme sekmesine tıklayın ve Giriş Veri Dosyalarını Seç düğmesini kullanarak tüm hdf5 dosyalarınızı seçin ve Tüm dosyaları işle düğmesine basın.
  18. Yazılım 2'yi açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve Dosya Ekle düğmesini kullanarak adım 4.3 ve 4.17'de oluşturulan tüm tif/tiff dosyalarını ekleyin. Dosya çıktıları için bir konum seçin ve tüm dosyaları .ims dosyalarına dönüştürmek için Tümünü Başlat düğmesine basın. Dosyalar artık Yazılım 3'te analiz için hazırdır (bkz. Malzeme Tablosu).

5. Yazılımda Analiz 3

  1. Tüm floresan lekelerini içeren resimlerden birini açın. Düzenle-> Kanal Ekle'yi seçin ve çekirdekler ve hücre gövdeleri üzerinden yapılan maskelere karşılık gelen .ims dosyalarını ekleyin. Bunu tüm numuneler için tekrarlayın.
  2. Yeni Hücre Ekle düğmesini seçin. Çekirdeği ve hücreyi algıla seçeneğini seçin ve ilerleyin.
  3. Çekirdekleri tespit etmek için kaynak kanal olarak çekirdekler üzerindeki maskeyi seçin ve çekirdekleri tohum noktalarına bölmek için gelişmiş seçeneği belirleyin. Çekirdek çapı için bir değer seçin) ve ilerleyin.
    NOT: Çekirdek çapı için en uygun değerin, simülasyonu çalıştırarak ve programın yeterince çekirdeği bölmediğini (birden fazla çekirdek birlikte gruplandırılmıştır) veya aşırı bölünme olup olmadığını (bir çekirdek birden fazla parçaya bölünmüş) manuel olarak değerlendirerek test edilmesi gerekecektir.
  4. Kalite değerlendirmesi için bir değer seçin ve devam edin. Tipik olarak, tüm çekirdekleri dahil etmek en iyisidir, çünkü çekirdeklerin ihmal edilmesi birden fazla hücrenin tek bir hücrede kaynaşmasına yol açabilir.
  5. Nükleer yüzeyler oluşturmak için bir eşik değeri seçin ve ardından devam edin. Daha sönük olanlar da dahil olmak üzere tüm çekirdeklerin hala eşiğe dahil edildiğinden emin olun. Eşiği çok düşük yapmayın, çünkü bu, çekirdeğin boyutunu abartabilir veya potansiyel olarak nükleer lekelenme olarak döküntü içerebilir.
  6. Çekirdek başına minimum Voksel sayısı için bir değer seçin ve devam edin. Tipik olarak, bu parametre kullanılarak enkaz veya çekirdek olmayanlar hariç tutulmadıkça her şeyi saklamak en iyisidir.
  7. Hücre sınırı ve sitoplazma seçeneğini seçin, hücre gövdelerini algılamak için kaynak kanal olarak hücreler üzerindeki maskeyi seçin ve ardından devam edin.
  8. İlgilenilen tüm hücreleri doğru bir şekilde yakalayan, ancak arka planı veya hücrelerin spesifik olmayan herhangi bir algılamasını içerecek kadar düşük olmayan bir Hücre eşiği seçin. Dokunan hücreleri, hücre başına bir çekirdek olacak şekilde bölme seçeneğini belirleyin ve bunlar çekirdeğe olan mesafeye göre ayrılır. Ayrıca, çekirdeklerdeki hücreleri genişletmeyi seçin ve ardından devam edin.
  9. Hücre başına minimum voksel sayısı için bir değer seçin ve devam edin. Tipik olarak, bu parametre kullanılarak enkaz veya hücre olmayanlar hariç tutulmadıkça her şeyi saklamak en iyisidir.
  10. Birden çok hücrenin birbirine kaynaşıp kaynaşmadığına veya hücrelerin eksik olup olmadığına bakarak hücrelerin üzerinde oluşturulan yüzeylerin doğru olup olmadığını değerlendirin. Yüzeyler yetersizse, adım 5.2'ye geri dönün ve en uygun ayarlar belirlenene kadar yeni parametreler deneyin.
  11. En iyi ayarlar oluşturulduktan sonra, soldaki menüden oluşturulan hücre nesnesine tıklayın, oluşturma sekmesine tıklayın ve kullanılan ayarları kaydetmek için Toplu İş için Parametreleri Sakla düğmesine tıklayın.
  12. Yazılım 3'ün birden çok penceresini açın ve her pencerede ayrı görüntüler açın. Her pencerede yeni Hücreler düğmesine basın, Favori Oluşturma Parametreleri menüsünde kaydedilen ayarları seçin ve her pencereye tamamlanana kadar çalışmasını söyleyin. Tüm numuneler analiz edilene kadar bunu gerektiği kadar tekrarlayın.
    NOT: Yazılım 3'ün birden çok örneğini çalıştırmak bu analizin daha hızlı ilerlemesini sağlar, ancak paralel olarak çalıştırılabilecek pencere sayısı, merkezi işlem birimi (CPU) işlem hızına ve analizin çalıştırıldığı bilgisayarın RAM miktarına bağlı olacaktır.
  13. Tüm örnekler tamamlandıktan sonra, her görüntüde sol menüde oluşturulan hücre nesnesine tıklayın ve İstatistikler sekmesine tıklayın. Görünür İstatistik Değerleri listesini yapılandır düğmesini tıklayın, 'Hücre Yoğunluğu Ortalaması' değeri dışındaki tüm istatistiklerin seçimini kaldırın ve ardından Tamam'a basın.
  14. Analiz edilmesi gereken her görüntü için, istatistikler sekmesindeki Tüm istatistikleri dosyaya aktar düğmesini tıklayın ve dosyaları bir konuma kaydedin.

6. Histoflow sitometri analizi ve popülasyonların doku kesitlerine haritalanması

  1. Anaconda ve JupyterLab'ı Anaconda içinde açın. Ardından, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanan komut dosyasını açın. Çalıştır menüsünü kullanarak kodu çalıştırın ve Tüm Hücreleri Çalıştır'ı seçin veya Seçili Hücreleri Çalıştır'ı seçerek hücreleri sırayla tek tek çalıştırın.
  2. Kaynak dosyayı girmeniz istendiğinde, adım 5.14'te oluşturulan dışa aktarılan floresan değerleri için dosya dizinini girin. Dosya dizini, dışa aktarılan .csv dosyalarından birinin özelliklerine bakılarak ve dosya yolunu komut istemine kopyalayarak elde edilebilir.
  3. Ardından, program işlenen dosyalar için bir çıktı konumu isteyecektir. İşlenen dosyaları kaydetmek için uygun olan herhangi bir konum için dosya dizinini girin. Program, klasörde bulunan floresan kanallarının sayısını otomatik olarak algılayacaktır.
  4. Verilere her kanalın adlarıyla açıklama eklemek için kodun sonraki bölümünü çalıştırın. Bu kod, "numberOfChannels" parametresini adım 6.3'te algılanan kanal sayısıyla eşleşecek şekilde değiştirmek için gerektiği gibi değiştirilebilir. Ek olarak, kanalların adları, 'ChX':'Marker' satırını gerektiği kadar tekrarlayarak ve işaretçilerin adlarını değiştirerek gerektiği kadar kanal için değiştirilebilir.
  5. Sonraki kod satırını çalıştırmak, belirtilen konumda açıklamalı ve veri kümesindeki tüm floresan parametrelerini içeren bir .csv dosyası oluşturur. Tüm veriler için .csv dosyaları oluşturmak üzere her Yazılım 3 dışa aktarma kümesi için 6.1-6.5 arasındaki adımları yineleyin.
  6. Yazılım 4'ü açarak (Malzeme Tablosuna bakın) ve .csv dosyalarını program penceresine sürükleyerek .csv dosyalarını .fcs dosyalarına dönüştürün. Yazılım 4, dosyaları otomatik olarak .fcs dosyalarına dönüştürmeye başlayacaktır.
  7. Yazılım 4'teki örneklerden birine çift tıklayarak bu örnekte bir pencere açın. Bir geçit stratejisi oluşturmak için Yazılım 4'teki geçit araçlarını kullanın. İlgilenilen tüm hücreleri içeren soy tanımlayıcı bir işaretleyici üzerinde geçit oluşturarak başlamanız, ardından önce daha nadir alt kümeleri kaldıran kapılara ilerlemeniz ve ardından daha bol hücre tiplerinde bitirmeniz önerilir.
  8. Bir geçit stratejisi oluşturulduktan sonra, menüde o popülasyona sağ tıklayarak ve dışa aktarmayı seçerek geçitin doğruluğunu test edin. Tüm parametreleri, başlıklar dahil olmak üzere bir .csv dosyası olarak dışa aktarın.
  9. Anaconda'da JupyterLab'ı açın. Ardından, Ek Kodlama Dosyası 2'de sağlanan komut dosyasını açın ve kodu çalıştırın. Yazılım 4 dosyasının konumunu girmeniz istendiğinde, önceki adımda oluşturulan dışa aktarılan .csv dosyasının dosya dizinini girin. Dosya dizini, dışa aktarılan .csv dosyasının özelliklerine bakılarak ve dosya yolunu komut istemine kopyalayarak elde edilebilir.
  10. Çıktı konumunu eklemeniz istendiğinde, tercih ettiğiniz herhangi bir dosya dizinini seçin ve dosya dizininin sonunda dosya adını içerdiğinden emin olun ('dosya dizini'\filename.txt). Kodun geri kalanını çalıştırın.
  11. .txt dosyasındaki metni kopyalayın ve dışa aktarılan verilerin temel aldığı aynı örnek için ilgili .ims dosyasını Yazılım 3'te açın. Dosyadaki Hücre nesnesine tıklayın, istatistikler sekmesine geçin, metni arama çubuğuna yapıştırın ve aramayı başlatın. İlgilenilen tüm hücreler vurgulanacaktır.
  12. İlgilenilen tüm hücrelerin geçit stratejisi kullanılarak yakalanıp yakalanmadığını manuel olarak inceleyin. Hücre sayıları az veya fazla tahmin ediliyorsa ( Şekil 5'te gösterilen örnekler), adım 6.7'ye geri dönün, geçidi ayarlayın ve hücrelerin yeni geçitle doğru bir şekilde yakalanıp yakalanmadığını yeniden değerlendirin. Bunu geçit stratejisindeki tüm kapılarla tekrarlayın ve geçitlemeyi birden fazla örnek üzerinde değerlendirin.
  13. Tüm geçitler doğrulandıktan sonra, tablo düzenleyici işlevini kullanarak verileri Yazılım 4'ten dışa aktarın ve tercih edilen analiz yöntemini kullanarak verileri analiz edin.
    NOT: Hücre popülasyonları, 6.8-6.11 adımlarındaki gibi kapılı popülasyonu tanımlayarak ve ardından seçilen hücrelere dayalı bir yüzey oluşturarak Yazılım 3'teki doku bölümlerine geri eşlenebilir. Bu, Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterildiği gibi, her bir kapılı nüfus için yapılabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Histoflow sitometri iş akışı. Doku kesitleri spektral olarak örtüşen boyalarla boyanır (adım 1). Görüntüler, floroforlar arasındaki spektral sızıntıyı en aza indirmek için ayarlanabilir bant geçiren filtrelerle eşleştirilmiş bireysel uyarma lazerleri arasında toplanır (adım 2). Kanallar arasındaki spektral kanama, tek renk lekeli doku kontrolleri kullanılarak oluşturulan bir kompanzasyon matrisine dayalı olarak düzeltilir (adım 3). Görüntülerdeki çekirdekler ve hücreler daha sonra ilastik (adım 4) kullanılarak tanımlanır ve Yazılım 3'te (adım 5) tek hücrelere bölünür. Akış sitometrisi analizi yapmak için tüm verileri Yazılım 3'ten Yazılım 4'e aktarmadan önce ek parametreler dahil edilir. Hücre kimlikleri daha sonra Yazılım 4'ten dışa aktarılır ve doku bölümlerindeki hücrelerin uzamsal lokalizasyonunu çözmek için orijinal dokudaki hücre kimliklerine geri eşlenir (adım 6). Para işaretleri, satın alınması gereken ticari yazılımları temsil eder ve bilgisayar işaretleri, özgür yazılımı temsil eder. Her adım için yaklaşık süre kum saatinin yanında belirtilmiştir. Ticari yazılım, Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3'te, lenf nodu dokuları, bir eşek anti-sıçan Dylight 405 ikincil antikoru ile eşleştirilmiş bir sıçan anti-fare CD138 antikoru, Alexa Fluor 488'e konjuge bir sıçan anti-fare CD4 antikoru, PerCP-eF710'a konjuge bir sıçan anti-fare IgD antikoru, bir Eşek anti-tavşan Alexa Fluor 546 ikincil antikoru ile eşleştirilmiş bir tavşan anti-fare Iba1 antikoru ile boyandı, PE-eF610'a konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare CD3ε antikoru, Alexa Fluor 647 ile konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare B220 antikoru ve APC-R700'e konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare CD45 antikoru. Dylight 405 ve Nuclear sarı boyalarını uyarmak için mor 405 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 408-438 nm ve 460-530 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 488 ve PerCP-eF710 boyalarını uyarmak için yeşil bir 488 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 495-545 nm ve 682-750 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 546 ve PE-eF610 boyalarını uyarmak için sarı-yeşil 552 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 557-600 nm ve 615-652 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 640 ve APC-R647 boyalarını uyarmak için kırmızı bir 700 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 647-682 nm ve 700-750 nm aralıklarında tespit edildi.

figure-results-2
Şekil 2: Düşük ve kaliteli tazminat örnekleri. Boncuklar, PE-eFluor 610'a konjuge edilmiş bir antikor ile boyandı ve PE-eFluor 610 (PE-eF610) ve Alexa Fluor 546 (A546) kanallarına karşılık gelen kanallarda görüntülendi. PE-eF610 florofordan sızıntıyı gidermek için A546 kanalında aynı görüntüye farklı derecelerde telafi uygulandı (eksik telafi için azalma, doğru telafi için ( azalma ve fazla telafi için ` azalma), bu da farklı derecelerde ayırma ile sonuçlandı. Telafi derecelerini daha iyi görselleştirmek için, taşma payı görüntülerinin aydınlatılmış bir versiyonu sağlanır. Sarı ok, PE-eF610 kanalında gerçek lekelenmenin olduğu bir alana karşılık gelen her görüntüdeki aynı alanı gösterir. Ölçek çubukları: 4 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Lekeli doku kesitleri kullanılarak floresan telafisi. (A-C) Lenf nodu doku kesitleri, listelenen floroforlara konjuge edilmiş tek Abs ile boyandı. Telafi edilmemiş tek lekeli numuneler daha sonra tüm kanallarda (A, üst) görüntülendi ve tek renkli kontrollere (A, alt) kompanzasyon uygulandı. (B) (A)'daki kanallar arasındaki hava kaçağı nicelleştirildi (mevcut görüntünün ortalama floresan yoğunluğunun mevcut floroforun kanalının ortalama floresan yoğunluğuna bölünmesi) ve ısı haritalarında sunuldu. Beyaz kareler, 0 taşma payını aşan değerleri temsil eder. (C) Spektral örtüşme, tamamen boyanmış numunelerde Iba1-A546 ve CD3-PEeF610'un spektral ayrımı karşılaştırılarak telafi edilmemiş ve hücre bazlı kompanzasyon koşullarında değerlendirilir. Ölçek çubukları: 30 μm. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokolü izleyerek (Şekil 1'de özetlenmiştir), spektral olarak örtüşen floresan boyalar, Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi etkili bir şekilde ayrılmalıdır. Boyaların tamamen ayrılması mümkün olmasa da, ayırma farklı hücre tiplerini açıkça ayırt etmek için yeterli olmalıdır (Şekil 3C). Başka bir kanalda hala spektral olarak örtüşen hücrelerin gölgeleri varsa, bu hala sızıntı olduğunu ve görüntülerin yeniden işlenmesi gerekebileceğini gösterebilir (Şekil 2). Ek olarak, telafi edilen alan arka plan boyamasıyla ilişkili floresan seviyelerinin altına düşerse ve taşmanın bir kez olduğu yerde siyah alanlar olarak görünürse aşırı telafi belirgin olacaktır (Şekil 2). Aşırı kompanzasyon, kompanzasyonun uygulandığı kanalda gerçek sinyalin kaybına yol açabilir ve bundan kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, bu protokol doğru bir şekilde takip edilmişse, tazminatla ilgili herhangi bir sorun olmamalıdır ve bu nedenle araştırmacı, herhangi bir belirgin kanamanın yapay mı yoksa biyolojinin bir parçası mı olduğunu düşünmelidir.

figure-results-4
Şekil 4: İlastik tabanlı çekirdek ve hücre tespiti örneği. Nükleer sarı boyama (sol üst), çekirdekleri (sağ üst sarı renkte) ve çekirdek olmayanı (mavi renkte) tanımlamak için kullanıldı. Temsili CD45 boyama (sol altta gösterilmiştir) hücreleri (sağ altta sarı renkte) ve hücre olmayanı (mavi renkte) tanımlamak için kullanılır. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Boyalar doğru bir şekilde ayrıldıktan sonra, dokuyu tek tek hücrelere bölmek, tek hücreli analizlerin yürütülmesi için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol, Şekil 6'da gösterilen lenf düğümlerinde gösterildiği gibi, hücreleri birbirine yakın bir şekilde sıkıştırıldıklarında bile ayırmak için kullanıcı tanımlı makine öğrenimini (Şekil 4) kullanır.

figure-results-5
Şekil 5: Bir kapının doğru ayarlanıp ayarlanmadığının değerlendirilmesi. Bir lenf nodunda temsili CD138 boyaması (camgöbeği renkli) gösterilmiştir ve dokudaki CD138 + hücrelerini tanımlamak için üç ayrı kapı (soldaki nokta grafiği) yapılmıştır. CD138 + hücrelerinin aşırı muhafazakar bir tahmini mavi kapı olarak gösterilir ve mavi dokuya eşlenir. CD138 + hücrelerinin dengeli bir tahmini yeşil kapı olarak gösterilir ve dokuya yeşil renkte eşlenir. CD138 + hücrelerinin aşırı izin verilen bir tahmini, kırmızı kapı olarak gösterilir ve kırmızı dokuya eşlenir. Sarı daire, CD138+ hücrelerinin aşırı muhafazakar kapı tarafından tanımlanmadığı bir alanı tanımlar ve macenta daire, aşırı izin veren kapı tarafından CD138+ hücreleri içerdiği iddia edilen CD138+ hücrelerinin olmadığı bir alanı tanımlar. Ölçek çubukları: 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış sitometrisi analizinde ( Şekil 5'te gösterilmiştir) kapıların kesin konumlarını belirlerken, bu kapıların hücre bolluğunu fazla tahmin etmediğinden veya küçümsemediğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Bu, ilgilendiğiniz belirteçleri ifade eden hücrelerin analizde yakalanıp yakalanmadığını görmek için, Şekil 5'te olduğu gibi, hücrelerin dokuya geri eşlenmesiyle belirlenmelidir. Çok fazla hücre seçiliyorsa (örneğin, CD138'i ifade etmeyen hücreler CD138+ olarak seçiliyorsa), kapılar daha az izin verilecek şekilde kaydırılmalı ve çok az hücre seçiliyorsa, kapılar daha izin verilebilir hale getirilmelidir. Kapılar, seçicilik için optimize edilmelidir, böylece önce yukarı akış kapıları optimize edilir, ardından zincirdeki sonraki her kapı daha sonra optimize edilir. Sonuç olarak, bir geçit stratejisinin etkili optimizasyonu, ilgilenilen hücre alt kümelerini çözebilmelidir (Şekil 6 ve Şekil 7).

figure-results-6
Şekil 6: Doku bölümlerindeki hücrelerin akış sitometrisine dayalı tanımlanması. (A) Lenf nodu kesitlerinde Yazılım 3'ten tek hücrelerden dışa aktarılan floresan değerleri, gösterilen geçit stratejisine dayalı olarak belirtilen hücre popülasyonlarını tanımlamak için Yazılım 4'te analiz edildi. (B) Yazılım 4'te tanımlanan popülasyonlar aynı doku bölümüne tekrar eşlendi ve her popülasyon için yüzeyler oluşturuldu. CD45 lekesi gösterilmemiştir. Ölçek çubuğu: 30 μm. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Fare lenf düğümlerindeki bireysel lekelerin ve popülasyonların dağılımı. İmmün hücre belirteçleri için bireysel lekeler üst panellerde gösterilmiştir ve Şekil 6A'da tanımlanan ilişkili kapılı popülasyonları her bir lekenin altında gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 30 μm, sol üst panelde gösterilmiştir. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu teknik daha öncenöroinflamasyon sırasında omuriliklere bağışıklık hücresi infiltrasyonlarını karakterize etmek için kullanılmış ve histoflow sitometrisi ve akış sitometrisi kullanılarak eşdeğer oranlarda sızan immün hücrelerin bulunduğunu doğrulamıştır. Teknik ayrıca, fare dalaklarında ve beyinlerinde çalıştığını ve aynı akış sitometrisi deneylerinde (yayınlanmamış) yeniden üretilen tedavi koşulları arasındaki farkları belirleyebildiğini göstererek doğrulanmıştır. Bu teknik aynı zamanda CNS modellerinin stereotaktik enjeksiyonlarını alan farelerin omuriliklerini analiz etmek için de kullanılmıştır.

figure-results-8
Şekil 8: Bir insan bademcik bölümünde 8 boyanın ayrılması. İnsan bademcik kesitleri B hücrelerini tanımlamak için CD20 ve plazma hücrelerini tanımlamak için IgM, IgA ve IgG ile boyandı. Plazma hücresi kimliklerini daha fazla doğrulamak için Blimp1 ve CD38 boyaları ve çoğalan hücreleri tanımlamak için Ki67 dahil edildi. Nükleer sarı leke birleşik görüntüde gösterilmemiştir. Ölçek çubuğu: 22 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu teknik, insan dokusu kesitlerini analiz etmek için de uygulanabilir. İnsan dokularındaki lekelenmeye bir örnek olarak, insan bademcik bölümleri 8 işaretleyici ile boyandı: Dylight 405'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgM antikoru, Alexa Fluor 488'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgA antikoru, PerCP-eFluor 710'a konjuge edilmiş bir keçi anti-fare F(ab')2 fragmanı ile eşleştirilmiş bir fare anti-insan CD20 antikoru, Cy3'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgG, PE-Alexa Fluor 610'a konjuge edilmiş bir keçi anti-tavşan antikoru ile eşleştirilmiş bir tavşan anti-insan Ki67 antikoru, Alexa Fluor 647'ye konjuge edilmiş bir eşek anti-sıçan antikoru ile eşleştirilmiş bir sıçan anti-insan Blimp1 antikoru ve APC-R700'e konjuge edilmiş bir fare anti-insan CD38 antikoru. Kompanzasyon sonrası bademcik bölümünde bu belirteçlerin ayrılması görülebilir (Şekil 8). Bu, bu tekniğin farklı doku ve türlerde faydasını göstermektedir.

Çözüm adıKompozisyonNasıl yapılır
Engelleme tamponuPBS'de At Serumu, %1 BSA ve %0.1 soğuk balık lekesi jelatini45 mL PBS'ye 5 mL at serumu, 0.5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
Perma ve engelleme tamponuPBS'de At Serumu, %1 BSA, %0.1 soğuk balık lekesi jelatini, %0.1 Triton X-100, %0.05 Tween-205 mL at serumu, 0.5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini, 50 μL Triton X-100 ve 25 μL Tween-20 ila 45 mL PBS ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
Perma ve boyama tamponuPBS'de %1 BSA, %0.1 soğuk balık lekesi jelatini, %0.5 Triton X-1000,5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ve 250 μL Triton X-100 ila 50 mL PBS ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
Söndürme tamponu%5 Trueblack, f,5 etanol, (,5 suTrueblack solüsyonunu 70 °C'de 5 dakika önceden ısıtın. Daha sonra Trueblack tamponunu yapmak için 950 μL p etanole 50 μL Trueblack ekleyin. Bunu her seferinde taze yapın. Slayt başına ~ 500 μL'ye ihtiyacınız olacak, ancak belirli miktarlar dokularınızın doğasına bağlı olacaktır.
Boyama tamponuPBS'de %1 BSA ve %0.1 soğuk balık lekesi jelatini50 mL PBS'ye 0,5 g BSA ve 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.

Tablo 1: Doku kesitlerini boyamak için gerekli çözeltilerin ve bileşimlerinin bir listesi.

Ek Kodlama Dosyası 1: Her kanaldan floresan değerlerini toplayan ve bir özet dosyası oluşturan bir Python betiği. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 2: Geçitli hücrelerin tüm kimlik numaralarının bir listesini bir metin dosyasında oluşturan bir Python betiği. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, daha önce doğrulanmış bir teknik olan histoflow sitometrisinin kullanımı açıklanmaktadır18. Doku kesitlerini spektral olarak örtüşen boyalarla boyarken, kanallar arasındaki kanamanın spektral kompanzasyon kullanılarak giderilebileceği ve bunun sonucunda normalde geleneksel yöntemlerle mümkün olandan daha fazla sayıda floresan parametresinin net bir şekilde çözüldüğü gösterilmiştir. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin geleneksel yöntemler kullanılarak analiz edilmesi zor olduğundan, bu görüntülerden tek tek hücreleri segmentlere ayırmak için bir analiz hattı sağlanır. Floresan imzaları bu tek tek hücrelerden dışa aktararak, akış sitometrisinde yapılanlar gibi tek hücreli analizlerin benzer şekilde histoloji görüntülerine uygulanabileceği gösterilmiştir. Akış sitometrisi mekansal analizi içermezken, histoflow sitometrisinin, mekansal lokalizasyonlarını değerlendirmek için doku kesitlerine geri dönme stratejileri ile tanımlanan popülasyonları haritalayabildiği gösterilmiştir. Genel olarak, histoflow sitometrinin akım sitometrisi ve histolojinin güçlü yönlerini birleştirdiği gösterilmiştir.

Histoflow sitometri, uzamsal bilgiyi tutma avantajına sahip olsa da, geleneksel histolojinin sahip olduğu aynı sınırlamaların çoğuna da sahiptir. Akış sitometrisi, tüm bir dokudaki hücreleri ölçmek için harika olsa da, histoloji tipik olarak, dokuyu temsil etmek için alınan küçük bir doku kesiti örneğinin analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Histolojinin bir dokudaki hücre sayısını doğru bir şekilde ölçmesi için, dokudan alınan her doku diliminin görüntülenmesi ve her birindeki hücre sayısının ölçülmesi gerekir ki bu pratik olmayacaktır. Diğer bir konu ise, dokunun kesitlenmesi sırasında bazı hücrelerin ikiye bölünmesi ve bu hücreleri yeniden yapılandırmanın bir yolu olmamasıdır. Aslında, burada listelenen protokolün bir sınırlaması, dokunun kenarlarındaki hücreleri dışlamak için herhangi bir yöntem içermemesidir. Bu sınırlamalara rağmen, histoflow sitometrisinin akış sitometrisine göre bir avantajı, dokuları tek hücreli süspansiyonlara ayırmaya gerek olmamasıdır, bu da izole edilmiş veya yetersiz yakalanmış popülasyonlara önyargılar getirebilir22. Bu nedenle, histoflow sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre çeşitli avantajları olsa da, tüm doku boyunca ölçüm elde etmek zor olmaya devam edecektir.

Burada, spektral olarak örtüşen sekiz floresan parametresinin ayrılabileceği gösterilmiştir; Bununla birlikte, diğerleri 13 floresan boyayı17 başarıyla ayırmıştır. Ayrılabilen boyaların sayısı, verilerin toplandığı mikroskobun özelliklerine bağlıdır. Floresan boyalar, optimal uyarma dalga boylarına ve en yaygın emisyon dalga boylarına göre farklılık gösterir. Floroforların optimal uyarma dalga boylarını daha hassas bir şekilde eşleştirmek için çok çeşitli uyarma dalga boyları kullanarak ve emisyon dedektörlerini en sık yayılan dalga boylarına tam olarak uyacak şekilde ayarlayarak bu özelliklerden yararlanan mikroskoplar, floresan boyaların ayrılmasını en üst düzeye çıkaracaktır. Spektral örtüşmeyi en aza indirmek, yüksek kaliteli veri üretmek için çok önemlidir, çünkü kanallar arasındaki sızıntıyı telafi etmek, birbiriyle etkileşime giren floroforların dinamik algılama aralığını potansiyel olarak etkileyebilir ve bu nedenle, emisyon ve uyarmaya dayalı ayırma, floroforların ayrılmasında kritik bir ilk adımdır. Mikroskobunuzun özelliklerine ve görüntülenmesi gereken floresan parametrelerinin sayısına bağlı olarak, aynı uyarma dalga boylarını paylaşan ancak emisyon dalga boylarında farklılık gösteren birden fazla floroforun aynı lazer çizgilerine yerleştirilmesi gerekebilir. Bu tipik olarak, konjuge boyaların daha uzun dalga boylarında yayıldığı ve böylece emisyon dalga boylarına göre ayırt edilebildiği konjuge floresan boyalarla kombinasyon halinde baz floresan boyaların kullanılmasıyla elde edilir. Genel olarak, boyalar, etkili bir şekilde ayrılma için uyarma veya emisyon frekansları ile ayırt edilmelidir.

Mükemmel tazminat elde etmek, tazminatın mekansal yönü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle karmaşıktır. İlk olarak, bir floroforun bir foton yayıp yaymadığı, kısmen, her görüntüde toplanan fotonların yoğun lekelenme yerlerine doğru önyargılı olduğuşans 23'e dayanmaktadır. Bununla birlikte, daha az yoğun lekeli alanlar, şans eseri, üst üste binen kanallardan birinde görünen ancak ana kanalda görünmeyen bir foton yayabilir. Kompanzasyon voksel bazında uygulandığından, uzamsal kolokalizasyon eksikliği nedeniyle kompanzasyon sırasında spektral örtüşme kaldırılmayacaktır. Bu, kompanzasyonun yoğun lekelenme konumlarının azalmasına (boncukların kenarları) neden olduğu, ancak boncukların merkezinin değil, minimum lekelenmenin olduğu ve kanamalı kanallarla zayıf örtüşmenin olduğu Şekil 2'de görülebilir. Boncukların merkezindeki bu lekelenme, muhtemelen telafiyi etkileyebilecek başka bir sorundan kaynaklanmaktadır, bu da odak düzleminin dışında üretilen fotonların, hem ana kanalda hem de telafi edilmesi gereken kanalda yeniden üretilmesi muhtemel olmayan odak düzlemindeki voksellerde görünebilmesidir24. Sonuç olarak, bu 'gürültü', aşırı tazminat getirilmeden tazminat yoluyla etkili bir şekilde ortadan kaldırılmayacaktır. Bu sorunlar, bir çizgi ortalaması kullanılarak, tek bir vokselin floresan değerlerini birden çok kez ölçerek ve rastgele şans olaylarının etkisini sınırlamak için ortalamayı kullanarak kısmen ele alınabilir. Konfokal bir mikroskop kullanılıyorsa, odak dışı fotonların görüntüleredahil edilmesini önlemek için iğne deliği boyutu da küçültülebilir 25,26. Bu düzeltmeleri kullanmak, kapsamlı hale gelebilen ek görüntüleme elde etme sürelerinin pahasına gelir.

Bu teknik, konfokal bir mikroskoptan alınan görüntüler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, diğer mikroskop türleriyle de çalışacaktır. Benzer yöntemler kullanan diğerleri, bu metodolojileri iki fotonlu mikroskoplardan17 alınan görüntülere büyük bir başarı ile uyguladılar. Bu teknik, geniş alan mikroskoplarından alınan görüntülere uygulanabilirken, bir fotonun odak düzleminden kaynaklanıp kaynaklanmadığını çözmeyi geliştiren konfokal mikroskoplarla ilişkili çeşitli avantajlar vardır. Fotonların konumunun doğru bir çözünürlüğü (yani, optik kesitleme) kompanzasyon kalitesini iyileştirdiğinden, kompanzasyon kalitesinin nispeten düşük olması beklenir. Bu, geniş alan görüntülerinin27 çözünürlüğünü iyileştirmek için odak dışı fotonları çıkarmak için evrişim giderme kullanılarak potansiyel olarak ele alınabilir. Dekonvolüsyonun bu protokolle uyumlu olup olmadığını belirleyecek önemli bir uyarı, her kanaldaki floresan değerlerinin analiz edilen tüm görüntülerde birbiriyle orantılı kalıp kalmadığıdır. Evrişimden sonraki floresan değerleri keyfi hale gelirse, bir görüntüde oluşturulan aynı telafi matrisinin diğer görüntülere başarılı bir şekilde uygulanması olası değildir. Genel olarak, bir mikroskobun bu iş akışını kullanıp kullanamayacağını belirleyen en önemli faktör, bu mikroskobun algılama aralığı esnek bir şekilde ayarlanabilen dedektörlere sahip olup olmadığıdır. Bu mevcutsa, aynı uyarma yoluyla uyarılan birden fazla florofor, farklı algılama pencereleri içinde emisyon spektrumlarının tespiti yoluyla çözülebilir.

Floresan parametrelerinin sayısı, aynı dokuyu IBEX 14,15 gibi birden çok kez seri olarak boyama teknikleriylebirleştirilirse daha da artırılabilir13. Seri boyama kullanılarak, etkili bir şekilde sınırsız sayıda parametre ölçülebilir; Ancak, bu çok zaman alıcı olabilir. Burada tartışılan kompanzasyon yöntemlerinin ve seri boyamanın bir kombinasyonunun kullanılması, her boyama turu için aynı anda daha fazla kanal görüntülenebildiğinden, bu görüntüleri almak için gereken süreyi önemli ölçüde azaltabilir. Burada açıklanan analiz hattı, istendiği kadar çok işaretleyici için ölçeklenecek ve seri olarak boyanmış doku bölümleriyle uyumlu olacaktır.

Bu analiz hattındaki kritik bir adım, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin segmentasyonudur. Histoloji görüntülerinden hücreleri doğru bir şekilde segmentlere ayırmak için etkili stratejiler bulmak yaygın bir konudur28 ve sürekli olarak yeni yöntemler geliştirilmektedir. Bu yöntem, tek hücreleri yakından paketlenmiş hücrelerden etkili bir şekilde ayırabilirken, hücrelerin kesin sınırları genellikle kusurludur. Bu nedenle, kullanıcıların analizi yalnızca ilgilendikleri hücre popülasyonlarıyla sınırlamaları önerilir, çünkü ayrılması gereken hücreler ne kadar az olursa, hücre sınırları o kadar doğru olacaktır. Kullanıcılar ayrıca ilastik'te birden fazla popülasyon tanımlayarak hücrelerin daha iyi ayrılmasını sağlayabilir ve programın farklı hücre popülasyonlarını bölümlere ayırmasına olanak tanır. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili bir sorun, bu şekilde tanımlanan hücrelerin Yazılım 3'te aynı 'hücre' nesnesinde birleştirilememesi ve muhtemelen hücrelerin iki kez sayılmasına yol açabilmesidir. Bununla birlikte, bir deney için daha doğru hücre sınırları kritikse, bu yaklaşım kullanılabilir. Kullanıcıların, geliştirildikçe daha yeni segmentasyon algoritmalarını denemeleri ve daha da iyi sonuçlar için bunları bu boru hattına dahil etmeleri teşvik edilir.

Yeni bir histoflow sitometri paneli geliştirirken çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. İlk olarak, farklı floresan belirteçlerin kabaca benzer miktarlarda floresan üretmesi çok önemlidir. Bir florofor diğerinden çok daha parlaksa, bu florofor başka bir florofora sızarsa bu sorunlu olabilir, çünkü kanama o kanaldaki gerçek lekelenmeyi geçebilir. Bu, Alexa Fluor 546'nın PE-eFluor 610'a ciddi şekilde sızdığı Şekil 3'te görülmektedir. Kompanzasyon bu taşmayı yine de ortadan kaldırabilse de, odak dışı ışığın kaldırılmaması nedeniyle genellikle hala bir miktar floresan olacaktır ve bu da telafiyi eksik hale getirebilir. Ayrıca, mikroskoplarda kullanılan çoğu dedektör, akış sitometrelerindekiler gibi geniş dinamik aralıklara sahip değildir. Sonuç olarak, bir kanaldaki sızıntı arttıkça, o dedektördeki dinamik aralığın daha fazlası diğer floroforlardan gelen sinyallerle doygun hale gelecek ve ilgilenilen florofordan daha az olacaktır. Kompanzasyon, geniş bir sızıntı ile böyle bir kanaldan çıkarıldığında, gerçek sinyal çözülebilir; Bununla birlikte, bu işaretleyici için pozitif olan hücreler ile onun için negatif olan hücreler arasındaki fark daha küçük hale gelecektir ve ara durumları çözememe veya potansiyel olarak negatiflerden pozitifleri çözememe ile sonuçlanabilir. Bu nedenle kanallar arası çakışmalardan kaçınılmalıdır. İkincisi, işaretleyicilerin parlaklığı farklı dokular arasında değişebilir. Örneğin, lenf düğümleri üzerinde çalışan bir belirteç paneli, dalak veya merkezi sinir sistemi üzerinde kullanıldığında artık çalışmayabilir, çünkü bir belirteç çok parlak veya sönük hale gelebilir, bu da o kanalın diğer kanallara çok fazla kanamasına veya diğer kanallardan gelen kanama nedeniyle boğulmasına neden olabilir. Böyle bir durumda, floroforların markörler üzerindeki değişimine geçmek veya primer konjuge antikorların kullanımını sekonder antikorların kullanımına geçirmek gerekebilir. Son olarak, kanallar arasında aşırı örtüşme olduğunda işaretçilerin lokalizasyonundaki farklılıklardan yararlanmak değerli olabilir. İki kanal birbiriyle yoğun bir şekilde örtüşüyorsa, ancak biri nükleer bir işaretleyici ve diğeri bir hücre yüzeyi işaretleyicisiyse, spektral örtüşme birbirini minimum düzeyde etkileyecektir çünkü telafi aynı vokselleri etkilemeyecektir. Mümkünse, paneller, çakışan kanalların lokalizasyonlarında farklılık göstermesini veya işaretleyicilerin ayrı hücrelerde ifade edilmesini sağlayacak şekilde tasarlanmalıdır.

Genel olarak, histoflow sitometrinin histoloji görüntülerini tek hücre düzeyinde analiz etmek için çok yönlü bir teknik olduğu gösterilmiştir. Daha eski teknikler, doğrudan hücre-hücre teması halinde olmayan hücrelerin analizi ile sınırlı olabilirken, bu analiz boru hattı, temas halindeki hücreleri ayırabilir, bu da onu homeostazdaki dokulardaki hücrelerin incelenmesi için veya bağışıklık hücrelerinin hasar bölgelerinde kümelendiği iltihaplanma sırasında uygun hale getirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme altyapısı ve uzmanlığı için Hotchkiss Beyin Enstitüsü Gelişmiş Mikroskopi Platformu'na teşekkür ederiz. RWJ, Calgary Üniversitesi Göz Lisesi programından doktora sonrası burs fonu ve Kanada Multipl Skleroz Derneği ve Roche Kanada sınırsız eğitim bursu tarafından desteklendi. VWY, Kanada Araştırma Koltuğu Tier 1 programından maaş desteği aldı. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri Hibe 1049959, Kanada Multipl Skleroz Derneği Hibe 3236 ve Kongre Tarafından Yönetilen Multipl Skleroz Araştırma Programı ABD Savunma Bakanlığı'nın işletme fonları ile desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu yayında uyarlanan rakamlar ilk olarak The Journal of Immunology'de yayınlandı. Rajiv W. Jain, David A. Elliott ve V. Wee Yong. 2023. Histoflow Sitometri Kullanılarak Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Tek Hücre Analizi. J. İmmünol. 210: 2038-2049. Telif Hakkı © [2023]. Amerikan İmmünologlar Derneği, Inc.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 100 EtanolSigma676829-1L%
4 PFAElektron Mikroskobu Bilimleri157-4
AnakondaN/AN/A
Sığır Serumu AlbüminSigmaA4503-50G
Soğuk balık lekesi jelatin SigmaG7765
Imaris.ipynb komut dosyasından çok kanallı verileri harmanlamaN/AN/A
komut dosyasında Hücre seçimi için FlowJo çıkışını txt dosyasına dönüştürünN/AN/Ahttps://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Eşek
sıçan önleyici Alexa Fluor 647JacksonImmunoResearch712-605-1531:300 konsantrasyon
Eşek anti-sıçan DyLight 405Jackson ImmunoResearch712-475-1531:200 konsantrasyon
Eşek SerumuJacksonImmunoResearch017-000-001
F(ab')2-Keçi anti-Fare IgG PerCP-eFluor 710Thermofisher46-4010-821:25 konsantrasyon
FIJIN/AN/Ahttps://imagej.net/software/fiji/
FlowJoFlowJo LLCYazılımı 4
Floresan spektratörühttps://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Taze dondurulmuş insan bademcik bölümleriamsbioHF-707
Cam lamelVWR48393 106
Keçi anti-insan IgA Alexa Fluor 488JacksonImmunoResearch109-546-0111:400 konsantrasyon
Keçi anti-insan IgG Cy3JacksonImmunoResearch709-166-0981:400 konsantrasyon
Keçi anti-insan IgM Dylight 405JacksonImmunoResearch109-476-1291:300 konsantrasyon
Keçi anti-tavşan A546Thermo Fisher BilimselA-110351:250 konsantrasyon
Keçi anti-tavşan IgG PE-Alexa Fluor 610ThermofisherA-209811:250 konsantrasyon
At SerumuSigmaH1138
IlastikN/AN/A
Ilastik FIJI eklentisiN/AN/A
Imaris Dosya DönüştürücüOxford InstrumentsYazılımı 2
Hücre modüllü ImarisOxford InstrumentsYazılımı 3
kimwipeKimtech34155
LasX Yaşam Bilimleri yazılımıLeicaYazılımı 1
Fare anti-insan CD20 VWRCA95024-3221:40 konsantrasyon
Fare anti-insan CD38 APC-R700BD Biosciences5649801:20 konsantrasyon
Normal Keçi SerumuJacksonImmunoResearch005-000-001
Normal Fare SerumuJacksonImmunoResearch015-000-001
Normal Tavşan SerumuJacksonImmunoResearch011-000-001
Normal Sıçan SerumuJacksonImmunoResearch012-000-120
Nükleer SarıAbcamab138903DMSO'da 2 mg / ml konsantrasyonda çözün ve 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C
PAP kalemiCedarlaneMU22
PBSGibco10010-023
Tavşan anti-insan Ki67Abcamab155801:500 konsantrasyon
Tavşan anti-fare Iba1Wako019-197411:500 konsantrasyon
Sıçan anti-insan Blimp1Thermofisher14-5963-821:40 konsantrasyon
Sıçan anti-fare B220 Alexa Fluor 647BioLegend1032261:250 konsantrasyon
Sıçan anti-fare CD138Biolegend1425021:200 konsantrasyon
Sıçan anti-fare CD3 PE-eFluor 610Thermo Fisher Scientific61-0032-821:40 konsantrasyon
Sıçan anti-fare CD4 Alexa Fluor 488BioLegend1005291:200 konsantrasyon
Sıçan anti-fare CD45 allofikosiyanin-R700BD Biosciences5654781:50 konsantrasyon
Sıçan anti-fare IgD PerCP-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-5993-821:50 konsantrasyon
SP8 Konfokal mikroskopLeica
Triton X-100SigmaX100-500ml
TrueblackBiotium23007
Tween-20SigmaP7949-500ml
Ultracomp EmiciThermofisher01-2222-42
https://www.anaconda.com/download https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Imaris.ipynb https://www.ilastik.org/ https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
  2. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  3. Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
  4. Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
  5. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  6. Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
  7. Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
  8. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
  9. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  10. Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner's view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
  11. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
  12. Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, e48051(2019).
  13. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  15. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  16. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  17. Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
  18. Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
  19. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  22. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  23. Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627(2020).
  24. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 1-25 (2017).
  25. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  26. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  27. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
  28. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Spektral Ayr t rmamm n H cre e itlili iFloresan MikroskopiMultipleks HistolojiTek H cre AnaliziDoku G r nt lemeMakine renmesi SegmentasyonuMerkezi Sinir Sistemi

İlgili makaleler