Mikroelektrotlar Kullanılarak Üç Boyutlu Gastrointestinal Organoidlerde Luminal pH Profili Oluşturma

Özet

Mevcut protokol, intraluminal fizyolojinin uzay-zamansal karakterizasyonu için mikroelektrotlar kullanılarak insan dokusundan türetilmiş mide organoidlerinde pH ölçümlerini açıklamaktadır.

Özet

Gastrointestinal organoid modellerin optimizasyonu ve ayrıntılı karakterizasyonu, luminal ortamlarını analiz etmek için gelişmiş yöntemler gerektirir. Bu makale, mikromanipülatör kontrollü mikroelektrotlar aracılığıyla 3D insan mide organoidlerinin lümeni içindeki pH'ın hassas ölçümü için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. pH mikroelektrotları ticari olarak temin edilebilir ve 25 μm çapında eğimli cam uçlardan oluşur. Ölçümler için, pH mikroelektrodu, Matrigel içinde süspanse edilmiş bir organoidin (>200 μm) lümenine ilerletilirken, bir referans elektrot kültür plakasındaki çevreleyen ortama daldırılır.

İnsan mide vücudundan türetilen organoidlerin profilini çıkarmak için bu tür mikroelektrotları kullanarak, luminal pH'ın her kültür kuyusu içinde ~ 7.7 ± 0.037'de nispeten tutarlı olduğunu ve en az 15 dakika boyunca sürekli ölçümlerin elde edilebileceğini gösteriyoruz. Bazı büyük organoidlerde, ölçümler epitel yüzeyi ile lümen arasında bir pH gradyanı ortaya çıkardı, bu da organoidlerdeki pH ölçümlerinin yüksek uzamsal çözünürlükle elde edilebileceğini düşündürdü. Önceki bir çalışmada, organoidlerdeki luminal oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için mikroelektrotlar başarıyla kullanıldı ve bu da organoid analizleri için bu yöntemin çok yönlülüğünü gösterdi. Özetle, bu protokol, 3D organoidler içindeki karmaşık luminal boşluğun işlevsel karakterizasyonu için önemli bir aracı tanımlar.

Giriş

Organoidler - kök hücrelerden türetilen minyatür çok hücreli yapılar - insan fizyolojisini inceleme yeteneğimizde devrim yarattı ve düzenleyici ortamlarda bile hayvan modellerinin yerini almaya başladı¹. 2009 yılında Sato ve arkadaşları tarafından bağırsak organoidlerinin ilk tanımından bu yana, organoid teknolojisi son derece popüler hale geldi². Çok sayıda çalışma, organoid modellerin hücresel bileşimini ve işlevini ayrıntılı olarak karakterize etmiştir 3,4,5,6. Bununla birlikte, bu 3D çok hücreli yapıların luminal alanı büyük ölçüde tanımsız kalmaktadır ^7,8. Lümen, polarize epitel hücrelerinin apikal kısımları ile çevrili mukozal dokulardan türetilen organoidlerin merkezi boşluğudur. Hücresel sekresyon ve emilim ağırlıklı olarak apikal epitel yüzeyinde meydana geldiğinden, organoidlerin luminal mikro çevresi bu önemli fizyolojik süreçler tarafından kontrol edilir. Şu anda kullanılan organoid modeller, hücre sinyal modellerinde, genel gövdede, metabolit konsantrasyon gradyanlarında ve çevresel koşullarda farklılıklar göstermektedir⁹. Bu nedenle organoid luminal fizyolojiyi anlamak, organ fonksiyonunun ve patolojisinin doğru modellenmesi için gereklidir. Ne yazık ki, lümenin göreceli olarak erişilemezliği, 3D organoidlerde luminal fizyolojinin fonksiyonel analizlerini önemli ölçüde engellemektedir¹⁰.

PH profillerini inceleme yeteneği, lümende yaklaşık 1-3 arasında değişen, ^11,12,13 epitelinde nötre yakın olana kadar vücuttaki en dik proton gradyanına sahip olmasıyla ünlü midede özellikle önemlidir. Gastrik pH gradyanının mikro ölçekte sürdürülmesi ve organoid modellerin gastrik mukus tabakası boyunca bu dinamik ortamın özetlenmesindeki önemi hakkındaki anlayışımızda önemli bir boşluk bulunmaktadır. Organoid pH analizi için geleneksel yaklaşımlar, floresan veya kolorimetrik indikatörler olabilen pH'a duyarlı boyaların kullanımını içermektedir. McCracken ve ark. histamin tedavisine yanıt olarak luminal pH'daki bir düşüşü analiz etmek için organoidlere SNARF-5F-bir oransal pH indikatörünün luminal enjeksiyonunu kullandı. Bu tür boyalar, pH'ın gerçek zamanlı, invaziv olmayan izlenmesine izin verecek şekilde kültür ortamına dahil edilebilir. pH'a duyarlı boyalar, ölçümlerde düşük güvenilirlik ve doğruluğa katkıda bulunan karmaşık kalibrasyon adımları gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda bu tür boyalar, ilgilenilen mikro ortam^14,15 içindeki tam pH aralığını temsil etmeyebilecek belirli algılama aralıkları içinde çalışma eğilimindedir. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler için gösterge boyalarının kullanılması makul kabul edilebilir. Floresan optod bazlı, pH algılama yaklaşımlarını kullanan optik nanosensörler de geliştirilmiştir; Bununla birlikte, bu tür algılama teknikleri mikroskobik görüntüleme gerektirir ve ayrıca fotoağartma, fototoksisite ve görüntüleme yanlılığına karşı hassastır^16,17. Ek olarak, Brooks ve ark. üzerine organoidlerin kaplanabileceği mikroelektrotlar içeren 3D baskılı çok kuyulu plakalar¹⁸. Ancak bu yaklaşım, doğrudan organoid lümen içinde ölçümlere izin vermez.

Elektrot bazlı pH ölçümleri, diğer yöntemlere kıyasla daha fazla doğruluk sağlayabilir ve gerçek zamanlı pH izleme sağlayabilir. Ek olarak, mikromanipülatörlere monte edilen pH elektrotları, elektrot ucunun hassas konumu hassas bir şekilde kontrol edilebildiğinden, pH ölçümlerinin üstün uzamsal çözünürlüğüne izin verir. Bu, organoid modellerin analizlerinde mümkün olan en yüksek esnekliği ve tekrarlanabilirliği sağlar. Burada kullanılan elektrotlar, ince bir platin teli çevreleyen seçici pH camından protonların difüzyonuna dayalı olarak çalışan minyatür pH mikroelektrotlarıdır. Mikroelektrot, harici bir Ag-AgCl referans elektroduna bağlanır ve daha sonra yüksek empedanslı bir milivolt metreye bağlanır. Aynı çözeltiye daldırıldığında iki elektrot ucu arasındaki elektrik potansiyeli, çözeltinin¹⁹ pH'ını yansıtacaktır. Bu tür mikroprofil oluşturma sistemleri, biyofilmlerin^20,21, planktonik alglerin²², insan balgam örneklerinin²³ ve hatta mezenkimal kök hücre sferoidlerinin²⁴ metabolik analizinde kullanılmıştır. Hem laboratuvarımız hem de Murphy ve ark. daha önce organoidlerin lümen boşluklarındaki oksijen konsantrasyonlarını değerlendirmek için mikromanipülatör kontrollü O₂ mikroelektrotları kullanmışlardır. Murphy ve ark. bu yöntemi matematiksel modelleme ile eşleştirerek sferoidleri içinde bir oksijen gradyanı ortaya çıkardı. Grubumuz, çevredeki hücre dışı matriks²⁵ ile karşılaştırıldığında, doku kaynaklı mide organoidlerinde azalmış luminal oksijen seviyeleri bulabildi.

Burada, karmaşık luminal mikro çevrelerinin daha iyi fizyolojik olarak anlaşılmasını sağlayacak küresel gastrointestinal sistem organoidlerinde luminal pH'ın manuel mikroelektrot profili için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniğin, mikro ölçekte pH seviyelerinin gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü ölçümleri yoluyla organoid fizyolojisinin araştırılmasına yeni bir boyut katacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, aşağıdaki protokol, çeşitli organoid model türlerinde_O2, N₂O, H₂, NO, H₂S, redoks ve sıcaklık analizi için kolayca uyarlanabilir. Fizyolojik profilleme, in vivo ortamları daha iyi taklit etmek için organoid kültür koşullarını optimize etmek için değerli bir araç olarak hizmet eder, böylece biyomedikal araştırmalarda organoid modellerin alaka düzeyini ve faydasını artırır.

Protokol

Bu protokol, farklı bir lümene sahip ve yapay bir hücre dışı matrise (ECM, örneğin Matrigel) gömülü olan en az 200 μm çapında 3D organoidler gerektirir. Organoid türevi için insan mide dokuları, Montana Eyalet Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı ve Bozeman Health'te üst endoskopi yapılan hastalardan bilgilendirilmiş onam (protokol # 2023-48-FCR, D.B.'ye) veya Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi'nden (protokol #DB062615-EX) muaf tam mide veya sleeve gastrektomi örnekleri olarak alındı. Bu çalışma için kullanılan organoid çizgileri ve geçiş numaraları hakkında bilgi Tablo 1'de verilmiştir ve ortam bileşimi Tablo 2'de listelenmiştir. Gastrointestinal organoid hatların oluşturulması ve bakımı için daha önce yayınlanmış protokollere^{bakın 6,26,27}.

1. pH profili oluşturma için insan mide organoidlerinin hazırlanması

1. Standart protokolleri kullanarak mide organoid kültürlerini başlatın ve sürdürün. Organoidleri, oyuk başına 500 μL genleşme ortamında 24 oyuklu plakalarda tutun (Tablo 2). Passage, pH profilleme deneylerine hazırlık olarak her 5-7 günde bir organoid hatları kurdu ve 35 mm'lik bir cam tabanlı tabağa aktardı.
   NOT: Deneylerimiz için organoid kültürler, yukarıda tarif edildiği gibi yetişkin dokusundan elde edilen mide bezi preparatlarından türetilmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi, bu bezleri ECM'de askıya alınmadan önce izole etmek için bir kollajenaz doku sindirim yöntemi kullanıyoruz 25,28,29.
2. 1-15 pasajlarında aktif olarak büyüyen organoid kültürlerden, 3,5 mm'lik Petri kaplarında transfer ve genişleme için çapları 200 ila 700 μm arasında olan en az 100 organoid (yaklaşık 2 milyon hücre) içeren kuyucukları seçin.
3. Organoidleri kaplama için hazırlarken (aşama 1.4-1.8), hücre dışı matris (ECM) alikotlarının buz üzerinde en az 45 dakika çözülmesine izin verin. Jelleşmeyi önlemek için ECM'yi bu protokol boyunca buz üzerinde tutun. Hücre kültürü plakalarını 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın.
4. Ortamı kuyucuklardan çıkarın ve buz gibi PBS'yi her bir ECM damlacığına pipetleyerek ve jeli bir P1000 pipetinin ucuyla çizerek mide organoid kültürlerini hasat edin. PBS'yi organoidler içeren ECM parçalarıyla 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin.
5. Tüpü 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Organoidleri içeren ECM parçaları, tüpün dibinde bir tabaka olarak görünecektir. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve her tüpe 350 μL% 0.25 tripsin-EDTA pipetleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 2-5 dakika inkübe edin.
6. Tripsin-EDTA ile inkübasyonun ardından, her tüpe penisilin / streptomisin içeren 600 μL buz gibi soğuk DMEM ekleyin ve en az 40 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. pH ölçümleri için kültürler oluşturmak için, hücre peletini buz gibi, sıvı ECM'de kaplama için organoid peletin ECM'ye 1:4 v/v oranında yeniden süspanse edin.
7. Her numune için, 35 mm'lik cam tabanlı bir kabın çapı boyunca ince bir yatay çizgi halinde organoidler/organoid parçaları içeren 40 μL sıvı ECM plakalayın.
   NOT: Jeli yuvarlak bir damlacık yerine bir çizgi halinde plakaya dağıtmak, kültürü incelterek tek tek organoidlere daha kolay erişim sağlar.
8. Jelin 15-30 dakika polimerize olmasına izin verin; daha sonra, jeli bozmamak için kuyunun kenarı boyunca pipetleyerek plakaya dikkatlice 2 mL organoid genleşme ortamı ekleyin.
9. Medyayı iki günde bir değiştirin. En az 10 organoidin minimum 400 μm çapa ulaşması için 4-8 gün bekleyin.
10. Bir pH profili oluşturma deneyine devam etmek için, her kültürün aşağıdaki kriterleri karşılayan en az 10 organoid içerdiğinden emin olun: >200 μm çap, sağlıklı görünüm (parlak alan mikroskobu ile gözlemlenen organoidler içinde çok az veya hiç koyu renkli materyal görünmez) ve diğer organoidler tarafından aşırı kalabalık değil.

2. Mikroelektrotların ambalajından çıkarılması ve kalibrasyonu

NOT: Mikro ölçekli ölçümleri etkinleştirmek için, entegre (ve dolayısıyla daha hantal) bir tasarım kullanmak yerine pH sensörü mikro elektroduna ek olarak ayrı bir referans elektrodu kullanılır. Hem pH mikroelektrodu hem de referans elektrodu ıslak olarak saklanmalıdır. Bir seferde 10 dakikadan fazla havaya maruz kalmasına izin vermeyin. Uygulama için uygun uç boyutunu belirleyin. Burada, eğimli uç çapı 25 μm olan potansiyometrik bir pH mikroelektrodu kullandık.

1. Mikroelektrot hala koruma tüpündeyken, uçta herhangi bir hasar olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
2. Referans elektrodu, konektör aracılığıyla pH elektrot kablosuna bağlayın. Ardından, mikroelektrodu amplifikatöre ve amplifikatörü bir USB kablosu aracılığıyla yazılımla birlikte topraklanmış bir PC'ye bağlayın (Şekil 1A).
3. İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 %70 etanol ve deiyonize H₂O (diH₂O) ile doldurun. Mikroelektrodu ve referans elektrodu diH₂O tüpüne yerleştirin ve her iki ucun da sıvıya en az 1 cm batırılmış göründüğünden emin olun.
   NOT: Bu ve benzeri adımlar için uzun beherler de kullanılabilir.
4. Elektrotların ~ 10 dakika dengelenmesine izin verin.
   NOT: Prosedür bu adımda da duraklatılabilir ve elektrotlar diH₂O'da saklanabileceğinden daha sonra devam ettirilebilir.
5. Elektrotlar dengelenirken, bilgisayar iş istasyonundaki yazılımı (kırmızı simge) açın. Ayarlar sekmesi altında, mikroelektrotun yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun, bu da elektrotun doğru şekilde bağlandığını ve yazılım tarafından tanındığını gösterir. Pencerenin sol üst köşesindeki Denemeyi Başlat'a tıklayın ve istediğiniz dosya adını ve hedefini girin. Sensör kalibrasyonu ve deney ayarları penceresinde, yazılımı yeni bir kalibrasyona hazırlamak için Tüm noktaları temizle'ye tıklayın.
6. İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 oranında pH 4.01 ve pH 9.21 kalibrasyon tamponları ile doldurun. Koruyucu hortumu ve referans elektrodu hassas bir laboratuvar mendiliyle nazikçe kurulayın.
7. pH 4.01 tamponundaki elektrotlardan başlayarak, bilinen pH değeri olarak 4.01'i girin. MV okuması stabilize olduğunda, nokta ekle'yi seçin. Sinyalin ~380 mV'de sabit olduğunu onaylayın. Nokta eklendikten sonra, durulamak için her iki elektrodu da diH₂O'ya geri yerleştirin, ardından tekrar kurulayın.
8. Önceki adımı 9.21 arabelleği ile tekrarlayın ve sinyal sabit olduğunda (~83 mV) nokta ekle'ye tıklayın. Mikroelektrotların pH 4.01 ile 9.21 arasında doğrusal olarak yanıt verdiğini kontrol edin; Bu nedenle, sadece iki noktalı bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Bu noktalar arasında ortaya çıkan çizginin 50-70 mV/pH biriminde negatif bir eğime sahip olduğundan emin olun. Kalibrasyonu kaydet ve kullan'a tıklayın.
   NOT: Artık ölçümleri kaydetmeye başlamaya hazırsınız³⁰.

3. İnsan mide organoidlerinin pH profili

NOT: Sağ elini kullanan bir kullanıcı için aşağıdaki protokol açıklanmıştır. DİKKAT: PC'niz uyku moduna girerse devam eden ölçümler kesintiye uğrayacağından, PC'nizdeki tüm güç tasarrufu seçeneklerini devre dışı bırakın.

1. Referans elektrodunu tutmak için stereomikroskobun sol tarafına bir kelepçe ile bir halka standı monte edin. Mikroskobun sağ tarafına ağır bir laboratuvar standına bağlı bir mikromanipülatör yerleştirin (Şekil 1A).
2. Mikroelektrodu bankın üzerine düz bir şekilde koyarak ve kasayı hızlı, hızlı bir hareketle çekerek koruma kılıfından dikkatlice çıkarın.
   DİKKAT: Mikroelektrotlar inanılmaz derecede kırılgandır ve ucun sert, katı malzeme ile temas etmemesine dikkat edilmelidir. En iyi sonuçları elde etmek için, tezgahın titremesine veya elektrotların istenmeyen hareketine neden olabilecek ekipmandan arındırılmış sağlam bir tezgah üzerinde ölçümler yapın.
3. Mikroelektrodu bir mikromanipülatör üzerine monte edin ve stereoskop ve mikromanipülatörü, mikroelektrot objektife veya mikroskobun diğer kısımlarına çarpmadan kültür kabına doğru ilerleyebilecek şekilde düzenleyin.
4. Organoidleri içeren kültür kabını, profili oluşturulacak ilk organoidin yeterli görselleştirmesine sahip olacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B).
5. Referans elektrodu, stereoskopun solundaki halka standı üzerindeki cl'ye hafifçe sabitleyin. Referans elektrodu, ECM'yi çevreleyen ortamda duracak şekilde konumlandırın. Sahne ölçümler arasında hareket ettirilirken organoidleri bozmayacağından emin olun.
6. Doğrudan kültür plakasına bakarak (mikroskoba değil), mikroelektrotun ucunu ortama yeterince daldırılana kadar ilerletin. Yazılımdaki Veri kaydedici sekmesi altında, kayda başlamak için Başlat düğmesine (sağa bakan tek üçgen) tıklayın. Ekranın sağ tarafında Kalibre Edildi onay kutusunun seçili olduğundan emin olun.
   NOT: Bir sonraki bölgeye ilerlemeden önce her okumanın stabilize olması için ~10 saniye bekleyin.
7. ECM'ye girmeden önce, elektrot ucunun mikroskop altında görünür olduğundan ve ilgilenilen ilk organoide doğru doğrusal olarak ilerleyecek şekilde konumlandırıldığından emin olun. Elektrodu, herhangi bir organoid ile temas etmeden yavaşça jelin içine ilerletin. En az üç pH okuması kaydedin ve ortalamayı hesaplayın.
8. Mikroelektrodu, yüzeye dik eksen boyunca ilgilenilen ilk organoide doğru ilerlemeye hazır olacak şekilde konumlandırın. Elektrotun epitel yüzeyine nüfuz etmeden küçük bir girinti yapmasına izin verin (Şekil 1C).
   NOT: Bu adım aynı zamanda organoidin yerinde kalıp kalmayacağı veya ECM'de daha serbestçe hareket edip edemeyeceği konusunda da fikir verecektir.
9. Tek bir hızlı hareketle mikroelektrodu organoidin içine ilerletin. Organoid mikroelektrotun etrafında hareket ederse veya uzaklaşırsa, biraz farklı bir açı deneyin veya başka bir organoide veya tabağın kapak camı tabanını çevreleyen plastik kenara karşı yedekleyin. Her deneysel koşul için 10 farklı organoidin lümen pH'ını (üç ayrı kez) ölçün. Ölçümleri kaydetmeyi bitirdiğinizde, kare dur düğmesine tıklayın.
   DİKKAT: Elektrodu organoid lümene ne kadar ilerleteceğinize karar vermek için organoidin çapını tahmin edin ve onu delmemeye dikkat edin. Daha fazla doğruluk için, varsa mikroskobunuzun kamera yazılımıyla çapı ölçün. NOT: Mikroelektrotun ucu bir veya birden fazla ölçümden sonra gözle görülür şekilde kalıntılarla kaplanırsa, devam etmeden önce mikroelektrodu hücre ayrışma solüsyonu, PBS, EtOH ve ardından diH₂O içinde yıkayın.

4. Motorlu profil oluşturma (isteğe bağlı)

NOT: Bu seçenek, nihai olarak bir motor kontrolörü³¹ aracılığıyla bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilen mekanik bir motor aşamasına monte edilmiş bir mikromanipülatör gerektirir.

1. Profil oluşturma yazılımını (kahverengi simge) açın ve Profil Oluşturma sekmesi altında yeni bir deneme başlatın.
2. Z ekseni ayarları, bir motor aparatı düzgün şekilde bağlandığında Motoru otomatik olarak tanıyacaktır.
   NOT: Bu kurulumda x ve y yönlerindeki hareket hala manuel olarak kontrol edilir.
3. Profil etkileşimi sekmesini^{bulun 30}. Başlatmaya basmadan önce, istenen mesafeden organoid girişini sağlamak için mikroskop merceğine hızlı bir şekilde bakmaya geçmenin mümkün olduğundan emin olun. Profil ayarları'na gidin ve aşağıdakileri yapın:
   1. Başlangıç mesafesinin 0 μm olduğunu belirtin.
      DİKKAT: Epitel kabuğu belirli bir organoid üzerinde özellikle sertse, organoid nüfuz etmek yerine itilebilir veya deforme olabilir. İtme söz konusuysa, elektrodu ilerletmeye devam edin, ancak yazılım bunu otomatik olarak kaydedemediği için girişin gerçekleştiği noktaya dikkat edin.
   2. Profili çıkarılan organoidin boyutuna bakarak, bir organoidin tahmini çapından en fazla 3/4 oranında bir Bitiş mesafesi belirtin.
      NOT: Bu özel adım, elektrot ucunun hasar görmesini önlemek için tasarlanmıştır.
   3. Şekil 2E'de gösterildiği gibi istenen adım boyutunu (100 μm) belirtin. Minimum adım boyutunun elektrot ucunun boyutuyla eşleştiğinden emin olun (örneğin, 25 μm pH-25 elektrot ucu için 25 μm).
   4. Motorun elektrot ucunu profiller arasına geri döndüreceği güvenli bir konumu belirtin.
      NOT: Bu, sensörün manuel mikromanipülatör ile x ve y yönlerinde güvenli bir şekilde yanlara doğru hareket ettirilebileceği numunenin üzerinde (organoidin dışında) rahat bir yükseklik olmalıdır. Sensör açısını varsayılan ayarında bırakın.
   5. Elektrotun dengelenmesini sağlamak için, Ölçüm(ler)den önce bekleyin altında en az 3 saniye belirtin.
   6. Hesaplama dönemlerini en az 1 sn olarak ayarlayın. Bu dönemdeki ölçümlerin ortalaması alınacaktır.
      NOT: Elektriksel gürültünün yüksek olduğu bir ortamda ölçüm yapıyorsanız, daha uzun bir süre belirtmek yardımcı olabilir.
   7. Arasındaki Gecikme(ler)i en az 1 sn olarak ayarlayın.
   8. Her derinlikte ölçülecek tercih edilen Çoğaltma sayısını ayarlayın.
   9. Başlat düğmesine basarak ölçümleri kaydetmeye başlayın.

5. Elektrotların temizlenmesi

1. Temizlenecek elektrodu tekrar koruma tüpüne yerleştirin.
2. Ölçümlerden sonra elektrotları diH₂O ile yıkayın.
3. Elektrotları birkaç dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın.
4. Elektrotları pH 4.01 tamponu ile durulayın.
5. Ölçümlere devam etmeden önce elektrotları diH₂O ile bir kez daha durulayın.

6. Elektrotların saklanması

NOT: Her iki elektrot da oda sıcaklığında, kazara hasara karşı güvenli, düşük aktiviteli bir yerde saklanmalıdır.

1. pH mikroelektrodunu kullandıktan sonra, dikkatlice yatay olarak koruma tüpüne geri kaydırın (yatay destek için laboratuvar tezgahı boyunca kaydırın).
2. Mikroelektrodu dik tutarak (uç yukarı bakacak şekilde), koruma tüpünü nazikçe steril suyla doldurun. Koruma tüpünü, elektrotla birlikte gelen tıpa ile tıka. Koruma borusundaki tüm deliklerin elektrik bandı ile kapatıldığından emin olun. Bir sonraki kullanıma kadar kırılmaz bir kutuda saklayın.
   NOT: Saklandığında elektrotları yerinde tutmak için tasarlanmış koruyucu ekler içereceğinden, elektrotların geldiği orijinal kutunun kullanılması önerilir.
3. Referans elektrodu, 3M KCl çözeltisi ile doldurulmuş bir beher veya dereceli silindirde saklayın. Çözeltinin buharlaşmasını önlemek için beher/dereceli silindiri parafilm ile örtün.
   NOT: Dereceli bir silindir kullanılıyorsa, kazara hareket etmesini önlemek için laboratuvar tezgahına bantla sabitlenmesi önerilir.

7. Metil kırmızı enjeksiyon (isteğe bağlı)

NOT: Metil kırmızısı, mikroelektrot ölçümlerini doğrulamak için kullanılabilen kolorimetrik bir indikatör boyadır.

1. 2 μL'lik bir cam kılcal damarı steril mineral yağ ile doldurun, mikromanipülatör kontrollü bir nL otomatik enjektöre yükleyin ve ardından %0.02 metil kırmızısı ve 150 mM HCl içeren bir çözelti ile doldurun.
   NOT: HCl'nin asitliği nedeniyle çözelti kılcal damar içindeyken kırmızı/pembe görünmelidir.
2. Çapı en az 300 μm olan organoidleri 9.2 μL çözelti²⁵ ile enjekte edin.
3. Stereomikroskoba uyarlanmış bir kamera kullanarak görüntü veya video çekin (Şekil 2G).

Sonuçlar

Asit salgılanması insan midesinin çok önemli bir işlevidir. Bununla birlikte, organoidlerde asit salgılanmasının ne ölçüde modellenebileceği hala bir tartışma konusudur^6,32,33,34. Bu nedenle, mide organoidlerinde asit üretimini doğru bir şekilde ölçmek için yukarıda ayrıntıları verilen protokolü geliştirdik. Özellikle, birkaç kez geçilen standart genişleme koşulları altında kültürlenmiş, uyarılmamış yetişkin kök hücre türevli organoidler kullandık, bu da parietal hücre kaybına yol açtı³⁵. Bu nedenle, model sistemimizde asit salgılayan parietal hücrelerin varlığı ve aktif asit salınımı beklenmemiştir.

Deneylerimiz için, cam tabanlı tabaklara ekilmiş 200 μm ile 1,000 μm arasında çaplara sahip organoidler kullandık. İlk olarak, mikroelektrotlar için iki farklı uç boyutunu test ettik: 25 μm uç çapına sahip bir pH-25 ve 50 μm uç çapına sahip bir pH-50. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, daha büyük uçlara kıyasla daha küçük uçlarla elde edilen ölçümler arasında önemli bir fark yoktu. İlginç bir şekilde, organoidlerdeki başlangıç pH'ı ~ pH 8'de hafif alkali olma eğilimindeydi. 25 μm pH-25 ucunu kullanarak, daha sonra, her bir organoidden elde edilen üç ölçümle, aynı kültür plakası üzerinde tutulan farklı on organoid içindeki luminal pH'daki değişimi değerlendirdik (Şekil 2B). Bir plaka içinde, tek tek organoidlerin luminal pH'ı sadece hafif, anlamlı olmayan değişiklikler gösterdi (8.16 ± 0.12; p ≥0.0445-0.99) (Şekil 2B). Ayrıca, 3 ila 16 arasında değişen geçişlere sahip beş farklı organoid hattı içindeki intraluminal pH ölçümlerini karşılaştırdık (Şekil 2C). Yine, her kültürde tutarlı pH ölçümleri bulduk, ancak organoid çizgiler arasında önemli değişkenlik bulduk. Bununla birlikte, luminal pH genellikle pH 7.3 ile pH 8.2 arasında, bir büyüklük sırası içinde kaldı ve erken ve geç geçiş sayıları karşılaştırıldığında ortalama pH için belirgin bir eğilim yoktu (Şekil 2C). Daha sonra organoid lümenin pH'ının, organoid genleşme ortamının ve hücre dışı matrisin (ECM) pH'ı ile doğrudan ilişkili olup olmadığını sorduk. Ortam, organoidleri çevreleyen ECM ve organoid lümen arasındaki karşılaştırma, organoidlerin luminal pH'ı ECM'ninkinden daha düşük ve ECM pH'ı çevreleyen organoid genleşme ortamınınkinden daha düşük olan pH'da önemli farklılıklar ortaya çıkardı (Şekil 2D), organoidlerin luminal pH'ının doğrudan kültür ortamı tarafından belirlenmekten ziyade fizyolojik olarak ilgili olduğunu düşündürdü. Altı bağımsız deneyde, 7.13 ± 0.09'da nötre yakın bir ortalama luminal pH ölçtük.

Organoid lümenin daha yüksek uzamsal çözünürlükle pH ölçümlerini elde etmek için motorlu bir mikromanipülatör kullanıldı. Bu yaklaşım, mukus dolu organoid lümen²⁹ içindeki pH veya diğer gradyanların kaydedilmesi gerekiyorsa geçerlidir. Şekil 2E , büyük organoidlerde (>1.000 μm çapında) iki temsili pH ölçümü serisini göstermektedir, bu da her bir organoide giriş noktasını gösterir ve ~800 μm derinlikte biter. Profili çıkarılan iki organoid aynı çapa sahip olmadığından, ölçümler hemen karşılaştırılabilir değildir. Ne olursa olsun, epitel yüzeyi ile daha derin organoid lümen arasında Δ0.6'lık hafif bir pH gradyanına dair kanıt gösteriyoruz (Şekil 2E). Tedavi yanıtlarının gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayacak şekilde organoidlerde zaman içinde pH ölçümleri yapmanın fizibilitesini belirlemek için, intraluminal pH'ı temsili bir organoid içinde yaklaşık 20 dakika boyunca kaydettik ve okumanın ilk adaptasyon periyodundan sonra oldukça tutarlı kaldığını bulduk (Şekil 2F). Luminal pH ölçümlerini bağımsız bir yöntemle doğrulamak için, mikromanipülatöre monte edilmiş bir nanolitre otoenjektör kullanarak organoid lümene enjekte ettiğimiz pH'a duyarlı bir kolorimetrik boya (metil kırmızısı) kullandık (Şekil 2G). Boyanın sarı rengi, organoid lümenin, nötre yakın bir pH gösteren mikroelektrot ölçümleriyle tutarlı olarak >6.2'lik bir pH'a sahip olduğunu doğruladı. Genel olarak, bu temsili sonuçlar, organoid kültürlerde mikroelektrot bazlı pH ölçümlerinin fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

Şekil 1: Yönteme genel bakış. (A) Profil oluşturma kurulumunun şematik diyagramı. Şekil 1A'daki mikroelektrot Unisense web sitesinden alınmıştır. ³⁶ (B) Profil oluşturmaya hazır organoid kültürün, çevreleyen ECM'nin ve çevreleyen ortamın temsili görüntüsü (ölçek çubuğu = 5 mm). (C) Organoid problama hazırlığı için doğru mikroelektrot konumlandırma örneği (ölçek çubuğu = 500 μm). Kısaltma: ECM = hücre dışı matris. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İnsan mide organoidlerinde mikrosensör profilinin doğrulanması. (A) 25 μm (pH-25) ve 50 μm (pH-50) mikroelektrot uçları kullanılarak orta lümen pH ölçümlerinin karşılaştırılması. Her biri tek bir temsili deneyden elde edilen 10 ayrı organoidden elde edilen veriler. (B) 10 ayrı organoid için üç tekrarlanan pH ölçümü elde edildi. Çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA (p = 0.1229). (C) Bir pH-25 elektrodu ile elde edilen pH ölçümleri, farklı geçiş sayılarında analiz edilen beş organoid çizgisinin her birinde tutarlıdır; Boyut ve kullanılabilirliğe bağlı olarak hat başına 4-10 organoid ölçülür. Çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA (p < 0.0001). (D) Mide organoidleri ve çevresindeki Matrigel ve ortam içinde pH ölçümleri (n = 6 bağımsız deney). Gastrik epitel organoidlerine pH-25 ile nüfuz ederek elde edilen ölçümler. Her veri noktası, tek bir organoid içindeki 10 ayrı pH ölçümünün ortalamasıdır. Tek yönlü ANOVA (p < 0.0001). (E) Motorlu bir mikromanipülatör kullanan iki temsili organoidin epitelden lümene pH profilleri. (F) Bir temsili organoidde zaman içinde pH stabilitesi (~ 19.8 dakika). (G) Mide organoid lümenine metil kırmızı pH indikatör boyası ve HCl'nin mikroenjeksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

			Donör
Şekil	Satır	Pasaj	Seks	Yaş	Etnik köken
2bir	35	6	F	40	B
2 milyar	7	15	F	26	B
	7	4	F	26	B
	1	16	F	45	C
	34	3	F	44	Bilinmeyen
	35	6	F	40	B
2C	7	15	F	26	B
2D	36	1	Bilinmeyen
	7	5	F	26	B
	37	1	Bilinmeyen
	31	3	F	45	H
	7	9	F	26	B
	7	4	F	26	B
2E	10	15	F	43	Bilinmeyen
2F	34	3	F	33	C
2G Teknolojisi	7	5	F	26	B

Tablo 1.

İnsan Gastrik Organoid Genişleme Ortamı (L-WRN)
L-WRN şartlandırılmış ortam	50%
İleri düzey DMEM/F12	37%
Fetal sığır serumu	10%
Penisilin / streptomisin	1%
L-glutamin	1%
Gentamisin	0.10%
Amfoterisin B	0.10%
HEPES tamponu	0.40%
Y-27632 Serisi	0.10%
SB-431542 Serisi	0.10%

Tablo 2.

Ek Şekil S1: İnsan mide organoidlerinde iyon taşıyıcı ekspresyonu. Bağıl kopya sayıları 18S rRNA'ya normalize edilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: pH mikrosensör probu ile delinme sonrası deforme olmuş mimariye sahip insan mide organoidi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Gastrik organoid kültüründe başarısız profil oluşturma girişimi. 25 μm'lik pH mikroelektrodu, ilgilenilen organoide doğru manuel olarak ilerletilir. Açı yanlış değerlendirmesi nedeniyle başarısız bir denemeden sonra, farklı bir açı denenir ve organoidin profillenecek yapısal bütünlükten yoksun olduğu ortaya çıkar (küresel yapı sağlam değildir ve elektrotla penetrasyon üzerine deforme olur). Kullanıcı daha sonra farklı bir organoid denemek için yönlendirir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Organoidlerin luminal boşluğuna sınırlı erişim, bu mikro çevrenin fizyolojik dinamikleri hakkındaki anlayışımızı ciddi şekilde kısıtlamıştır. Luminal fizyolojinin fonksiyonel analizleri için güvenilir bir araç, fizyoloji, farmakoloji ve hastalık araştırmaları için in vitro modeller olarak organoidlerden yararlanma yeteneğimizi artıracaktır. Organoidler, insan popülasyonu içindeki genetik değişkenliği çoğaltma potansiyeline sahip, son derece ayarlanabilir, fizyolojik olarak ilgili modellerdir. Organoid lümen içinde pH ölçümü için mevcut yöntemler, genellikle floresan mikroskobu veya spektroskopi 16,17,37 ile birleştirilmesi gereken yöntemler olan pH'a duyarlı boyalar veya nanopartiküller kullanmıştır. Açıklanan mikrosensör tabanlı profil oluşturma yöntemi, gastrointestinal organoidlerin intraluminal pH'ını yeni uzamsal hassasiyetle ölçmek için yeni bir yol sağlar. Yöntemimiz, gastrointestinal organoid luminal pH'ın tutarlı ve güvenilir ölçümünün yanı sıra bir pH gradyanının kanıtını göstermektedir. Yayınlanmamış deneylerde, bikarbonat sekresyonundan sorumlu olduğu bilinen SLC ailesi genleri SLC4A2 ve 26A7'nin yanı sıra proton değişiminden sorumlu olan SLC9A3, 9A4 ve 9A8'in ekspresyonunu doğruladık (Ek Şekil S1)38,39,40,41. Çalışmalarımız, organoidlerimizde bikarbonat sekresyonunun baskın olduğunu ve alkaliniteyi açıklayabilecek parietal hücrelerin eksikliğini göstermektedir.

Kullanılan mikroelektrotların organoid mikroprofil oluşturma için çok uygun olduğundan emin olmak önemlidir - buna doğru uç çapının seçilmesi de dahildir. Hem 25 μm hem de 50 μm uçları denedik ve benzer sonuçlar elde ettik (Şekil 2A), ancak daha az invaziv olması ve daha yüksek bir uzamsal çözünürlük sağlaması beklendiğinden, üreticinin tavsiyesine göre daha küçük uç boyutuyla ilerlemeye karar verdik. Bununla birlikte, bir dezavantaj olarak, daha küçük uçlar daha kırılgandır. İstenen uzamsal çözünürlüğün belirlenmesinde organoid boyutu dikkate alınmalıdır.

Protokoldeki kritik bir adım, organoid intraluminal pH ile ECM'deki ve ardından çevredeki kültür ortamındaki pH arasında ayrım yapma yeteneğinin sağlanmasıydı. Organoidlerin içine ve dışına makul miktarda metabolit akışı beklenir⁴². Bir organoidin pH'ının çevresinden etkilenmesini bekliyoruz ve altı bağımsız deneyde organoidlerin çevrelerinden sürekli olarak daha az alkali olduğunu bulduk (Şekil 2D). Ek olarak, sensör kalibrasyonu sırasında olduğu kadar profil oluşturmada da kararlılık önemlidir.

Doku kaynaklı organoidlerin belirli bir derecede donörden donöre değişkenlik göstermesi beklenir, bu nedenle ilaç tedavisi gibi herhangi bir deneysel müdahaleyi uygulamadan önce başlangıçta herhangi bir organoid çizgisinin profilini çıkarmak önemlidir⁴³. Herhangi bir organoid kültür içindeki pH dalgalanmalarının, mikro ölçekte lokal iyon gradyanlarına ve immünofloresan ve immünohistokimyasal boyama (yayınlanmamış veriler) ile belirlenen luminal mukusun heterojen dağılımına bağlı olabileceğini varsayıyoruz. Tek tek organoid çizgileri ve pasajları arasında pH'da gözlenen değişiklikler, hücre bileşimindeki ve organoidlerin salgı aktivitesindeki bireysel farklılıklardan kaynaklanabilir. Ayrıca, bazı organoid çizgilerin doğal olarak nüfuz etmesinin diğerlerinden daha zor olduğunu bulduk. Benzer şekilde, bazıları elektrot girişinde yapısal bütünlüklerini kaybedebilir ve çökebilir (Ek Şekil S2 ve Ek Video S1). Bu, organoid geçişi ile ilişkili görünmemektedir, ancak en yaygın olarak ~ 1.5 mm çapındaki organoidlerde gözlenmiştir. Önceki bir çalışmada, organoidlerin içindeki mukusun heterojen olarak dağıldığını gösterdik²⁹. Bu heterojenlik nedeniyle, mukus dağılımının bir ölçümü etkileyip etkilemediğini (veya ne ölçüde etkilediğini) belirlemek zorlaşır.

Mikrosensörler, organoid intraluminal fizyolojiyi yüksek hız ve yüksek uzamsal çözünürlükle profilleyebilen minimal invaziv araçlardır. Bu tür sensörler ayrıca kimyasal gradyanları bozmaz ve ilgilenilen mikro ortamdaki türbülansa karşı minimum düzeyde hassastır. Küçük tasarım, sensör elektrodunun referans elektrottan ayrılmasıyla mümkün hale gelir: Standart laboratuvar pH probları bu iki elektrotu birleştirerek daha büyük bir boyut elde edilmesini sağlar. Hücre içi ölçümler için optik pH ve O₂ nanosensörleri, Colorado Maden Okulu'ndaki Cash grubu tarafından geliştirilmiştir ve hem fare hem de biyofilm modellerinde metabolitlerin ölçülmesinde başarılı olmuştur. Bununla birlikte, organoid lümendeki heterojenlik nedeniyle, bu tür sensörler yorumlanamayan sonuçlara^{yol açabilir 17}. McCracken ve ark. SNARF-5F enjekte ederek ve pH'a duyarlı boyayı gerçek zamanlı konfokal mikroskopi³⁷ ile görselleştirerek embriyonik kök hücre kaynaklı mide organoidlerinde luminal pH'ı analiz etti. Özellikle, McCracken tarafından bildirilen ölçümler, mevcut çalışmamızda elde edilen pH değerlerine oldukça benzerdi (Şekil 2B, C). Tekniğimiz belki de tek katmanlı bir mimaride, biyofilm profillemede olduğu gibi daha dikey bir kurulumla uygulanabilir, ancak bu, elektrotlara⁴⁴ zarar verme riski oluşturabilir. Gelecekteki çalışmalar, hücre gelişimi ile ilişkili değişiklikleri değerlendirmek için birkaç gün boyunca sıralı pH ölçümlerini de içerebilir. Orta büyüklükteki organoidler genellikle sondalamadan sonra iyileşip iyileştiğinden, kültürlerin sterilitesi korunabildiği sürece bir organoid teorik olarak birden çok kez problanabilir. Organoid modellerdeki pH dinamikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirirken, içindeki karmaşık ve tarihsel olarak erişilemeyen 3B mikro ortamın hassas haritalanması için uzamsal çözünürlük bir öncelik olmalıdır.

Özetle, bu protokol, bir mikromanipülatör ve bir stereomikroskop üzerine monte edilmiş pH mikroelektrotları kullanılarak yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip doğru pH ölçümleri için ayrıntılı bir yöntem sağlar. Bu yöntem, insan yetişkin kök hücre türevli organoidlerle doğrulanmıştır ve belirgin bir lümene sahip en az 200 μm çapındaki epitelyal organoidler için uygundur. Alternatif mikroelektrotlar seçilerek, bu yöntemin diğer organoid türlerine ve NO veya_O2 gibi alternatif bileşiklerin ölçümüne kolayca uyarlanabileceğini tahmin ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 M KCl	Unisense
5 mL Yalpalamayan-Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Torba, Steril	CellTreat	229091B
10 mL Yalpalamayan-Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Çanta, Steril	CellTreat	229092B
15 mL Santrifüj Tüpü - Köpük Raf, Steril	CellTreat	229412
24 Kuyulu Doku Kültürü Plakası, Steril	CellTreat	229124
25 mL Yalpalamayan Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Torba, Steril	CellTreat	229093B
35 mm Tabak | No. 1.5 Lamel | 20 mm Cam Çapı | Kaplamasız	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Santrifüj Tüpü - Köpük Raf, Steril	CellTreat	229422
%70 Etanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μ m Hücre Süzgeci, Ayrı Ayrı Sarılmış, Steril	CellTreat	229483
1.000 ve mikro; L Uzatılmış Uzunluk Düşük Tutma Pipet Uçları, Raflı, Steril	CellTreat	229037
Amfoterisin B (Fungizone) Çözeltisi	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biyogüvenlik Kabini	Nuaire	NU-425-600	Sınıf II Tip A / B3
Sığır Serumu Albümini Fisher	Biyoreaktifleri	BP1605-100
Hücre geri kazanım çözeltisi	Corning	354253	Hücre ayrışma çözeltisi
DMEM / F-12 (Gelişmiş DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco'nun Kartal Ortamının Modifikasyonu (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Sığır Serumu	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sülfat	Corning	30-234-CR
Gentamisin sülfat	IBI Bilimsel	IB02030
HEPES, Serbest Asit	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2'si 1 arada 14" Dizüstü Bilgisayar Intel Core i3	HP	M03840-001
Hidroklorik asit	Fisher Scientific	A144C-212
Kuluçka	Makinesi Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 kamera	Apple
L-glutamin	Cytiva	SH3003401
Büyük Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev Silecekleri, 1 Katlı	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomikroskop	Leica
Corning	CB-40234 MC-40234		354234 Matrigel Membran Matrisi
	Unisense
Metil kırmızı
MM33 Mikromanipülatör	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Sağ elini kullanan
MS-15 Motorlu Sahne	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanolitre otomatik enjektör
Penisilin/Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Mikroelektrotlar	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace yazılımı Apple bilgisayarlarla uyumlu değildir
Referans Elektrot	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace yazılımı aşağıdakilerle uyumlu değildir Apple bilgisayarlar
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Akıllı Telefon Kamera Adaptörü	Gosky
Teknik Özellikler Laboratuvar Standı LS	Unisense	LS-009238
Tripsin-EDTA %0.025, fenol kırmızısı	Gibco	25-200-056
UniAmp Unisense		11632
United Biosystems Inc  MİNİ HÜCRE SIYIRICILAR 200 / PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihidroklorür	Tocris Bioscience	12-541-0
& mikro; Sensör Kalibrasyon Kiti	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 ve 9.21, 20 mL paketler