Çeşitli rizosfer topraklarından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmak için hızlı ve standartlaştırılmış bir prosedür burada sunulmaktadır. Karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasını araştırmak ve simüle etmek için tasarlanmış benzersiz bir protokoldür.
Yöntem makalesi
Rizosfer Toprağından Çok Türlü Biyofilm Toplulukları Oluşturmaya Yönelik Bir Yaklaşım
Bu makalede
Özet
Özet
Çok türlü biyofilm, rizosfer toprağı da dahil olmak üzere doğada doğal olarak oluşan ve baskın bir bakteri yaşam tarzıdır, ancak mevcut anlayışı sınırlıdır. Burada, sinerjik çok türlü biyofilm topluluklarını hızlı bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunuyoruz. İlk adım, diferansiyel santrifüjleme yöntemini kullanarak hücreleri rizosfer toprağından çıkarmaktır. Daha sonra, bu toprak hücreleri, pelikül biyofilmi oluşturmak için kültür ortamına aşılanır. 36 saatlik inkübasyondan sonra, biyofilmin bakteri bileşimi ve altındaki çözelti, 16S rRNA gen amplikon dizileme yöntemi kullanılarak belirlenir. Bu arada, pelikül biyofilminden yüksek verimli bakteri izolasyonu, sınırlayıcı seyreltme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, çok türlü biyofilm topluluklarının oluşturulmasında daha fazla kullanım için 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerinde (pelikül biyofilm örnekleri) en yüksek bolluğa sahip ilk 5 bakteri taksonu seçilir. 5 bakteri taksonunun tüm kombinasyonları, kristal viyole boyama testi ile en güçlü biyofilm oluşturma yeteneği için seçilen ve qPCR ile ölçülen 24 oyuklu bir plaka kullanılarak hızlı bir şekilde oluşturuldu. Son olarak, en sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm toplulukları yukarıdaki yöntemlerle elde edildi. Bu metodoloji, rizosfer çok tür biyofilmi hakkında araştırma yapmak ve bu türler arasındaki etkileşimleri yöneten ilkeleri incelemek için temsili toplulukları belirlemek için bilgilendirici rehberlik sağlar.
Giriş
Biyofilmler, yüzeylere yapıştırılmış veya arayüzlerle bağlantılı karmaşık mikrobiyal toplulukları temsil eder. Doğal yaşam alanları, klinik ortamlar ve endüstriyel bağlamlar gibi çeşitli ortamlarda karşılaşılan bakterilerin çoğunun biyofilm toplulukları içinde devam ettiği geniş bir kabul görmektedir1. Toprakta, kök yüzeyini ve bitişik 2 mm kalınlığındaki bölgeyi kapsayan rizosfer, yüksek besin mevcudiyeti ile ekolojik bir niş oluşturur. Spesifik bakteriler, mikrobiyal çoğalmayı teşvik ederek ve rizosferdebiyofilm topluluklarının oluşumunu teşvik ederek bu nişten yararlanmak için stratejiler geliştirmiştir 2.
Rizosfer mikropları, bitkilerin 'ikinci genomu' olarak kabul edilir3. Bitki büyümesini teşvik eden mikroorganizmalar (PGPM), bitkilerle karşılıklı simbiyoz yaparak önemli büyüme teşviki ve biyokontrol işlevleri sağlar4. Bir yandan, PGPM bitki köklerine besin sağlayabilir, besin alımını artırabilir, patojenlere karşı savunma yapabilir ve rizosfer toprağındaki kirleticileri bozabilir5. Öte yandan, PGPM, bitki kökü eksüdalarını büyüme ve evrim için bir besin kaynağı olarak kullanır ve böylece rizosfer toprağını ve kök sistemini kendi metabolizmaları yoluyla etkiler. Tüm bu işlevler için ön koşulun, PGPM'nin bitki rizosferinde etkili bir şekilde kolonizasyonu ve kararlı biyofilmleroluşturması olduğunu belirtmek gerekir 6.
Rizosfer biyofilmi, rizosfer mikroplarının montaj sürecini etkiler ve rizosfer mikrop montajının zamansal ve mekansal özellikleri, çok türlü biyofilm7'nin etkileşimi ile yakından ilişkilidir. Bitki-mikrobiyom etkileşimlerinin merkezi olarak hizmet eder ve etkili bir şekilde etkileşime girmeleri için istikrarlı ve kontrol edilebilir bir niş sağlar. Bu nedenle, rizosfer biyofilmini incelemek, bitkiler ve mikroplar arasındaki etkileşim hakkında fikir edinmek için de önemli bir yöndür.
Bununla birlikte, şu anda rizosfer çok türlü biyofilmler hakkında çok az araştırma bulunmaktadır. Mikrobiyom bileşiminin yüksek karmaşıklığı, doğal mikrobiyal toplulukları çevreleyen temel ekolojik soruları yanıtlamayı zorlaştırmaktadır8. Deney sürecinde, toprak tipi, bitki türü ve çok sayıda mikrobiyal topluluk gibi birçok koşulun dikkate alınması gerekir. Rizosfer çok türlü biyofilmlerin araştırılmasını çeşitli faktörler sınırlamaktadır.
Türler arası sinerjik etkileşimler veya metabolit çapraz beslemesi8 gibi rizosfer toprağından çok türlü biyofilm topluluklarını daha fazla araştırmak için, laboratuvar koşulları altında basitleştirilmiş, temsili, kararlı ve izlenebilir bir sentetik mikrobiyal topluluğun yapay olarak oluşturulması arzu edilir 9,10. Burada, standartlaştırılmış bir protokol, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik tekniklerin birkaçını birleştirir.
Protokol
Bu protokol genellikle çeşitli bitkilerden elde edilen rizosfer toprak mikrobiyotasına uygulanabilir. Burada örnek olarak salatalık kullanılmıştır. Çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Bakteri izolasyonu
- Rizosfer toprak izolasyonu
- Salatalık kültürü
- Salatalık tohumlarını% 75 etanol ve% 2 sodyum hipoklorit (NaClO) çözeltisi ile dezenfekte edin, ardından steril sudadurulayın 11.
- Tohumları steril koşullar altında çimlendirin ve iki yapraklı aşama12'ye ulaşanları seçin. Daha sonra, sürekli olarak filizlenen salatalık fidelerini 2 kg kara toprak içeren saksılara nakledin.
NOT: Sistematik hataları azaltmak için Kuzeydoğu Çin'in farklı yerlerinden iki tür kara toprak kullanılmaktadır.
- Toprak süspansiyonu hazırlığı
- Aşağıdaki formülasyonu kullanarak PBS-S tamponunu hazırlayın: 6.33 g NaH2PO4 · H2O, 16.5 g Na2HPO4·7H2O, 200 μL Silwet L-77 ve 1 L damıtılmış su.
- Fideler dört yapraklı aşama12'ye ulaştığında, saksıyı ters çevirin ve sterilize edilmiş eldivenler kullanarak kökleri 2 mm kalınlığındaki rizosfer toprağı ile birlikte izole edin.
- Kökleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 30 mL PBS-S tamponuna yerleştirin. 20 dakika çalkaladıktan sonra, kökleri ve büyük tortuları çıkarmak için süspansiyonu 100 μm'lik bir naylon hücre filtreden süzün.
- Süzüntüyü başka bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3200 x g'da santrifüjleyin ve geçici olarak 4 °C'de saklayın.
- Salatalık kültürü
- Rizosfer toprak bakteri hücrelerinin ekstraksiyonu.
NOT: Bu metodoloji, diferansiyel santrifüjleme yöntemini13 benimser, ancak Nycodenz yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemi14 bu adım için de geçerlidir.- Toprak süspansiyonunu %0.2 Na4P2O7 çözeltisiile 500 mL'ye seyreltin ve başlangıçta organizmaları topraktan ayırmak için 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Çökeltiyi yeniden homojenize edin, aynı düşük hızda 60 saniye santrifüjleyin ve işlemi üç kez tekrarlayın. Süpernatanları birleştirin, 20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
- Çökeltiyi, rizosfer toprak bakteri hücresi süspansiyonunu oluşturan 50 mL PBS-S tamponunda yeniden süspanse edin.
2. Rizosfer biyofilm mikrobiyotasının dizilimi ve tanımlanması
- Medya hazırlığı
NOT: Triptik soya suyu (TSB) ve Minimal tuzlar gliserol glutamat (MSgg) ortamları ticari olarak temin edilebilir. Aşağıdaki formülasyonlar sadece referans amaçlıdır.- Aşağıdaki formülasyonu kullanarak TSB ortamını hazırlayın: 15 μg/mL tripton, 5 μg/mL soya peptonu, 5 μg/mL NaCl, pH = 7.
- Aşağıdaki formülasyonu kullanarak MSgg ortamını hazırlayın: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3- (N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM tiamin,% 0.5 gliserol,% 0.5 glutamat, 50 μg / mL triptofan, 50 μg / mL fenilalanin, pH = 7 olur.
- TSB-MSgg ortamını hazırlamak için, TSB ortamını MSgg ortamıyla 1:1 oranında (v/v)15 karıştırın.
- Pelikül biyofilm kokültürü
- Bakterileri aktive etmek için hücre süspansiyonunu TSB ortamında gece boyunca (genellikle 12 saat) 30 ° C'de inkübe edin.
- 100 μm naylon hücre filtrelerini 24 oyuklu plakalara yerleştirin. Bakterileri TSB ortamında inkübe edin ve üç tekrar ayarlayın. Pelikül biyofilmini 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun.
NOT: Son adımdaki pelikül biyofilmi iyi işlenmemişse, TSB-MSgg besiyeri, TSB besiyeri için etkili bir ikamedir. - Pelikül biyofilmini içeren filtreyi çıkarın. Yeni bir 24 oyuklu hücre plakasına 2 mL PBS-S tamponu ekleyin, biyofilmi yıkamak için 24 oyuklu filtreyi içine yerleştirin ve serbest hücreleri çıkarın. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.
- Pelikül biyofilm DNA'sının ekstraksiyonu
- Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA kiti kullanarak biyofilm genomunu çıkarın.
- Yüksek verimli sıralama
NOT: Biyoteknoloji şirketleri, çoğu laboratuvar için sıralama deneylerinin tamamlanmasına yardımcı olabilir. Kalan çözeltide mikrobiyal bileşime ihtiyaç duyulursa, bu adımda sıralayın. Sıralama adımı, aletlere bağlı olarak değişir. Lütfen üreticinin talimatlarına uyun. Adım 2.4.1 sadece referans içindir.- Tam uzunlukta 16S rRNA gen dizileri ile veri tabanına dayalı olarak 16S rRNA geninin V3-V4 bölgelerini amplifiye edin. Örnek başına minimum dizi sayısına göre tür OTU'ları oluşturun16. Tür sınıflandırma ek açıklamalarını kümeleyin ve her örnekten toplulukların kompozisyonlarını elde edin.
- Sıralama verilerine dayanarak, nispi bollukları açısından ilk beş suşu seçin.
- Yüksek verimli bakteri izolasyonu ve kültürü
NOT: Bu adım, en son mikrobiyolojik ve biyoinformatik metodolojiyegöre tasarlanmıştır 17. Seyreltme kaplı plaka yöntemi, yüksek verimli tekniklere kıyasla daha fazla zaman alıcı ve daha az hedefli olmasına rağmen, burada bakteri izolasyonu için mevcuttur.- Ekili biyofilmi karıştırın. 24 oyuklu plakadaki oyukların %30'undan fazlasının bakteri üremesi göstermemesini sağlamak için sınırlayıcı seyreltme kullanın.
NOT: En uygun seyreltmeyi belirlemek için, çok çeşitli seyreltme oranları kullanarak ön deneyler yapın. Optimal seyreltme, kuyucukların% 30'undan daha azında bakteri inkübasyonunu temsil eden mililitre başına ikiden fazla kültürlenebilir bakteri içermemelidir. - Kuyucuklar ve plakalar için etiketler eklerken bakterilerin 16S rRNA genini amplifiye edin ve bunları yüksek verimli Illumina platformu17 kullanarak sıralayın.
- Her kültür için saflık ve tür taksonomik bilgileri elde etmek için ticari olarak mevcut yazılımları kullanarak biyoinformatik analizler yapın.
- Sürekli hat kültürü ile en bol miktarda bulunan beş saf bakteriyi yetiştirin ve bakterileri -80 ° C'de korumak için gliserol kullanın.
- Ekili biyofilmi karıştırın. 24 oyuklu plakadaki oyukların %30'undan fazlasının bakteri üremesi göstermemesini sağlamak için sınırlayıcı seyreltme kullanın.
3. Sentetik mikrobiyal toplulukların inşası
- Yeniden yapılandırılmış biyofilm kültürü
NOT: Ayrıntılar için lütfen Ren ve ark.18'e bakın. 5 suş, 5 tek tür, 10 iki tür, 10 üç tür, 5 dört tür ve 1 beş tür konsorsiyum dahil olmak üzere 31 sentetik kombinasyona karşılık gelir.- 5 suşu, etkinleştirmek için OD600'leri 1'e ulaşana kadar TSB ortamında inkübe edin.
- TSB besiyeri ile birkaç 24 oyuklu plaka hazırlayın ve üzerlerine 100 μm naylon hücre filtreleri yerleştirin.
NOT: Son adımdan gelen biyofilm iyi işlenmemişse, TSB-MSgg ortamı, TSB ortamı için etkili bir ikamedir. - Ortamdaki sentetik toplulukların 31 kombinasyonunu inkübe edin. Bakteri aşılama sayısının her kuyucukta tutarlı olduğundan emin olun. Her kombinasyon için üç tekrar ayarlayın.
- Biyofilmi 30 °C'de 36 saat boyunca kurutun.
- Pelikül biyofilminin miktar tayini
- Adım 2.2.3'teki prosedürün aynısını izleyin.
- Biyofilmi 180 μL kristal viyole çözeltisi içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve 20 dakika boyunca boyayın.
- Lekeli numuneyi 200 μL %96 etanol içeren 24 oyuklu başka bir plakaya aktarın, 30 dakika boyunca elüte edin ve OD590'ı ölçün.
4. Pelikül hücre sayısı ölçümü
NOT: Her bir türün oranını ve pelikül ve kalan çözeltideki hücre sayılarını belirlemek için kantitatif PCR gereklidir. Ayrıntılar için Sun ve ark.16'ya bakın.
- Seçilen sentetik mikrobiyal topluluklar için suşa özgü primerler tasarlayın.
- Genom karşılaştırmaları yapmak ve her bir izolatın suşa özgü tek kopya genlerini bulmak için Roary'yi kullanın. Primerlerin bu genleri hedeflediğinden emin olun.
- Amplifiye edilmiş fragmanları PMD19T plazmitlerine ligazlayın. Karşılık gelen parçaları içeren plazmitleri şablon olarak kullanarak standart eğriler oluşturun.
- Adım 2.2'de belirtilen adımların aynısını izleyin.
- Reaksiyon bileşenlerini şu şekilde hazırlayın: 7.2 μL H2O, 10 μL 2x qPCR Master karışımı, her bir primerden 0.4 μL 10 μM ve 2 μL şablon DNA.
- PCR'yi aşağıdaki koşullar altında Gerçek Zamanlı PCR Cihazı ile gerçekleştirin: 10 dakika boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 45 saniye boyunca 60 °C, ardından standart bir erime eğrisi segmenti.
- Her tedavi için altı biyolojik kopya gerçekleştirin.
Sonuçlar
Söz konusu prosedürü takiben, salatalık rizosfer toprak mikrobiyotasından biyofilm oluşturma kapasitesinde önemli gradyanlar gözlenir (Şekil 1). Biyofilm amplikon dizilimi, peliküldeki türü doğruladı (Şekil 2). Sıralama verilerinin ısı haritalamasına dayanarak, peliküldeki bolluğu kalan çözeltidekinden daha büyük olan ilk beş bakteri türü seçildi (Şekil 3). Burada, tipik bir sentetik topluluk grubu örnek olarak alınmıştır. Kristal viyole boyama ve kantitatif PCR, pelikül biyokütlesindeki farklılıkları ve topluluklardaki her bir türün nispi bolluğunu doğrudan görselleştirir. Artan kokültür biyokütlesi, rizosfer toprağından sinerjik çok türlü biyofilm toplulukları oluşturmanın başarısını gösterir (Şekil 4 ve Şekil 5).
Sonuçlar, Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 ve Burkholderia cenocepacia XL-2'nin, üç türden de oluşan en sağlam toplulukla belirgin sinerjik konsorsiyumlar oluşturabileceğini göstermektedir. Biyofilm oluşumunda güçlü bir sinerji sergileyecekleri tahmin edilmektedir. XL-1'in bir 'adanmış' olarak hizmet etmesi de dikkat çekicidir. Konsorsiyumdaki zayıf büyümesine ve minimum bolluğuna rağmen XL-2 ve SQR9'un biyofilm oluşumunu teşvik eder (Şekil 5). Bir dizi çok türlü kokültür biyofilmi sinerjik bir fenotipi temsil ederken, Chryseobacterium sp. gibi bazı türler, sentetik biyofilmin biyokütlesini azaltarak diğer suşlarla her zaman negatif ilişkilidir (Şekil 2). Bu fenomen, bu protokolün hedefiyle ilgili olmasa da, gelecekte daha fazla araştırmaya değer olabilir.
Şekil 1: Farklı sentetik toplulukların biyofilm oluşumu (SynComs). Burada, numuneler standart 24 oyuklu plakalardadır. Fotoğraflar herhangi bir büyütme olmadan çekilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pelikül ve çözeltideki bakteri bileşimi. Grafikler, protokol adımı 2.3'te belirtilen 16S rRNA gen amplikon dizileme verilerine dayanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pelikül ve çözeltideki biyofilm oluşturma kapasitesinin ısı haritası. Kırmızı, çözeltiden daha yüksek olan biyofilmdeki bolluğu temsil eder ve mavi, bunun tersini temsil eder. Cins farkı gösterilmemiştir. En üstteki 5 bolluğun türleri solda işaretlenmiştir. BB: Siyah biyofilm; BS: Siyah çözüm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Şekil 1'deki sentetik toplulukların biyofilm biyokütle miktar tayini. Veriler, OD = 590 nm ile kristal viyole miktar tayininden alınmıştır. Sunulan veriler ortalama ± SD, n = 5'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Şekil 1'deki sentetik toplulukların hücre sayıları ve türlerin göreceli bolluğu. Veriler kantitatif PCR'den alınmıştır. Sunulan veriler ortalama ± SD, n = 6'dır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Protokolü takiben, farklı bitkilerden elde edilen rizosfer toprağındaki mikrobiyotaya dayalı olarak bir dizi sağlam sentetik çok türlü biyofilm topluluğu oluşturulur. Kantitatif PCR teknikleri kullanılarak, her topluluğun bileşimi net bir şekilde deşifre edilir. Biyofilmin biyokütlesi, potansiyel metabolik etkileşimlerinin gücünü gösterir, ancak işbirliğinin arkasındaki çeşitli özellikler ve mekanizmalar burada ortaya çıkarılamamıştır19. Doğal mikrobiyal toplulukların büyüklüğü ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, sentetik topluluklar (SynCom'lar) mevcut engellerin üstesinden gelmek için model bir sistemi temsil etmektedir14. Bu protokol, karmaşık rizosfer toprak mikrobiyotasından sentetik biyofilm toplulukları oluşturmanın sistematik ve temel metodolojisini vurgulamaktadır.
Son kısımdan SQR9, XL-1 ve XL-2'nin gerçek rizosferde stabil kolonizasyon için güçlü bir potansiyel gösterdiği açıktır. Araştırmacılar, bu suşlara dayalı metabolik ilişkileri ve ko-kolonizasyon mekanizmalarını araştırmaya başlayabilirler. Salatalık için mikrobiyal aşılayıcılar üzerine daha sonraki araştırmalara da bundan sonra erişilebilir.
Bahsedilen avantajlara rağmen, protokolün dezavantajlarını göz ardı etmemek önemlidir. Laboratuvar kültürü ve in situ koşullar arasındaki farklılıklar nedeniyle, her bir sentetik topluluğun sonuçları, gerçek rizosfer toprağındaki mikrobiyotayı doğru bir şekilde temsil etmeyebilir20. Daha fazla rizosfer aşılaması yoluyla onay gereklidir. Ek olarak, bu sonuçların tekrarlanabilirliği nispeten zayıftır. Laboratuvardaki pelikül biyofilm türleri, topraktaki yabani türlere kıyasla birçok nesil boyunca mutasyona uğramış olabilir ve bu da kontrol edilemeyen bazı yanlışlıklara yol açabilir.
Protokoldeki belirli adımlara birkaç alternatif vardır. Örneğin, adım 1.2'de, Nycodenz yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemi, toprak hücresi örneklerini toplamak için nispeten daha verimlidir13. Ek olarak, adım 2.4'te, bakterilerin en son yüksek verimli yetiştirilmesi ve tanımlanması, daha yüksek bir maliyetle de olsa deneysel verimliliği önemli ölçüde artırır. Bu nedenle, geleneksel seyreltme kaplı plaka yöntemi, birkaç türün seçilmesi için uygun olmaya devam etmektedir. Son olarak, adım 3.2'de, ekili biyofilmin biyokütlesi hem kristal viyole boyama ile hem de doğrudan analitik bir terazide tartılarak değerlendirilebilir.
Bu protokol, yalnızca mikrobiyal ve çevresel araştırmalar için temel deneysel materyaller oluşturmanın ötesine uzanır. En sağlam sentetik bakteri çok türlü biyofilm topluluklarını tanımlamak, açık ve karmaşık rizosfer ekosistemini çözmenin sadece ilk adımıdır. Araştırmacılar, SynCom'ların temel türlerine odaklanarak, gerçek yerinde durumları daha hedefli ve hızlı bir şekilde kavrayabilirler. Bu yaklaşım aynı zamanda rizosfer toprak agregaları gibi biyofilmleri daha büyük ölçekte keşfetmek ve bitki büyümesi ve sağlığı için rizosfer mikrobiyal topluluklarının hassas yönetimi için yeni bir bakış açısı sunabilir21.
En önemlisi, bu metodoloji, rizosfer toprak mikrobiyotasının topluluğunu ve dinamiklerini yöneten türler arası etkileşimler hakkında daha fazla araştırmaya ışık tutacaktır. Örneğin, karmaşık bir rizosfer topluluğuyla uğraşırken, birlikte oluşum ağı analizi veya genom ölçeğinde metabolik modelleme15 gibi diğer analitik yöntemler, temsili bir biyofilm topluluğunu yapay olarak oluşturmak için genellikle bu temel adımlarla birleştirilir. Bu, türler arası ilişkilerin dikkate alınmasını içerir.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (42307173 ve 42107328) ve Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFD1500202 ve 2022YFF1001800) tarafından mali olarak desteklenmiştir. P.W, Z.X çalışmayı tasarladı. P.W, B.X, Z.C, J.X ve N.Z verileri analiz etti ve rakamları oluşturdu. P.W el yazmasının ilk taslağını yazdı. Z.X., R.Z. ve Q.S. el yazmasını gözden geçirdiler.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.2 Na4< / sub>P2< / sub>O7< / sub> çözeltisi | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd. | 20041418 | Toprak süspansiyonunu seyreltmek için kullanılır. |
| 100 ve mu; m Naylon Hücre Filtresi | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F613463-0001 | Kültür çözeltisini filtrelemek ve pelikül biyofilmini ayırmak için kullanılır. |
| % 2 NaClO çözeltisi | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd. | L03336903 | Tohumları sterilize etmek için kullanılır. |
| 24 kuyulu Plaka | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Mekobiyal yetiştirme ve pelikül biyofilm ayrımı için kullanılır. |
| 3-(N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS) | Bioolook Scientific Research Special | 2360010 | MSgg besiyeri hazırlamak için kullanılır. |
| 50 mL Santrifüj Tüpü | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Protokolümüz için uygun boyutta santrifüj tüpleri. |
| % 75 C < > 2 < / alt > H < altı > 5 < / alt >OH çözeltisi | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 801769680 | Tohumları sterilize etmek için kullanılır. |
| Acinetobacter baumannii XL-1 | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Rizosfer toprağından izole edilen suşlar. |
| Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Rizosfer toprağından izole edilen suşlar. |
| Bakteri DNA Kiti | Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. | D3350020000K04U021 | Bakteri DNA'sını çıkarmak için kullanılır. |
| Kara Toprak I | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Jilin Eyaletinden kara toprak. |
| Kara Toprak II | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Heilongjiang Eyaletinden kara toprak. |
| Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Rizosfer toprağından izole edilen suşlar. |
| CaCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 10035048 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Santrifüj | Sangon Biotech (Şangay) Co., Ltd. | G508009-0001 | Yüksek hızlı santrifüj. |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q311-02 | qPCR'de DNA amplifikasyonu için kullanılır. |
| Temiz Tezgah | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Aseptik çalışma için kullanılır. |
| Sabit Sıcaklık İnkübatörü | ShangHai CIMO Medical Instrument Co., Ltd | GNP-9080BS- | Mikrobiyal yetiştirme için kullanılır. |
| Kristal Menekşe Boya | Sangon Biotech (Şangay) Co., Ltd. | A600331 | Pelikül biyofilm boyama ve miktar tayini için kullanılır. |
| Salatalık Tohumu | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | , "Jinchun I" salatalık tohumu. |
| Culturome v 1.0 | Çin Bilimler Akademisi Genetik ve Gelişim Biyolojisi Enstitüsü | N/A | Yüksek verimli rizosfer toprağı bakteri yetiştirme ve tanımlama için kullanılır |
| FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011918 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Buzdolabı | Hefei Midea Buzdolabı Co, Ltd | BCD-556WKPM(Q) | Gerinim koruması için kullanılır. |
| Glutamat | Bioolook Bilimsel Araştırma Özel | 2180020 | MSgg besiyeri hazırlamak için kullanılır. |
| Gliserol | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd | 10010618 | MSgg ortamı hazırlamak için kullanılır. |
| Hidroponik Dikim Sepeti | Yulv Mobilya Mağazası | 6526262626 | Salatalık hidroponiği için kullanılır. |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Xilong Scientific Co., Ltd. | 10017618 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| MgCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 7791186 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| MnCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 10400101 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Msgg Orta | Şangay Bioesn Biyoteknoloji Co, Ltd | BES20791KB | Pelikül biyofilm kültür ortamı. |
| Na2HPO4&orta nokta; 7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| NaCI | Chinasun Özel Ürünler co., Ltd. | HS0416 | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| NaH2PO4· H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| PBS-S Tampon | Sangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd. | E607008-0001 | Canlı dokular için temel tampon. |
| Fenilalanin | RYON | RT3486L005 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Pipet | Pekin Labgic Technology Co., Ltd. | BS-1000-T | Suş aşılaması için kullanılır. |
| PMD19T Plazmid Takara Biyomedikal | Teknolojisi (Pekin) Co., Ltd. | D102A | qPCR standart eğrileri oluşturmak için kullanılır. |
| Pot | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd. | YHHWS2401 | Salatalık toprak kültürü için kullanılır. |
| qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | qPCR'de DNA amplifikasyonu için kullanılır. |
| Gerçek Zamanlı PCR Cihazı | : Thermo Fisher Scientific (Çin) Co.,Ltd. | 4484073 | Seçilen pelikül biyofilmi üzerinde qPCR gerçekleştirmek için kullanılır. |
| Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Ltd'nin primerlerini tasarlamak için kullanılır |
| ZQTY-50S | Çözelti karıştırma ve mikrobiyal yetiştirme için kullanılır. | ||
| Silwet L-77 | Cytiva Biyo-teknoloji (Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Soya pepton | Qingdao Hi-tech Endüstri Parkı Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Spektrofotometre | Şangay Yidian Analiz Cihazı Co., Ltd. | 76713100010 | Pelikül biyofilm kristal menekşe kantitivasyonu için kullanılır. |
| Steril Su | Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd. | SW150302 | Pelikül biyofilmini yıkamak için kullanılır. |
| Sterilize Nitril Eldivenler | Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. | 223016852LLZA | Temel deneysel işlemler için kullanılır. |
| Şablon DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | N/A | qPCR'de DNA amplifikasyonu için kullanılır. |
| Tiamin | Bioolook Bilimsel Araştırma Özel | 2180020 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Tripton | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | TSB ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| Triptofan | Bioolook Bilimsel Araştırma Özel | 2190020 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
| TSB Orta | Guangdong Huankai Mikrobiyal Sci. & Tech. Co., Ltd. | 024048 | Geniş spektrumlu bakteri ortamı. |
| TSB-Msgg Meidium | Nanjing Ziraat Üniversitesi | N/A | Daha geniş uygulanabilirliğe sahip pelikül biyofilm kültürü için karışık ortam. |
| ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | C0310520123 | MSgg ortamını hazırlamak için kullanılır. |
Kaynaklar
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
- Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
- Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
- Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
- Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
- Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
- Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
- Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
- Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).
- Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
- Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
- Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
- Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).
- Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
- Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).
Yeniden basım ve izinler
