Yöntem makalesi

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

DOI:

10.3791/66945

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokolleri açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Timik epitel hücreleri (TEC'ler), T hücrelerinin gelişimini ve repertuar seçimini teşvik etmede önemli bir rol oynar. Timik korteksteki kortikal TEC'ler (cTEC'ler) erken T hücresi gelişimini ve kortikal timositlerin pozitif seçimini indükler. Buna karşılık, timik medulladaki medüller TEC'ler (mTEC'ler) korteksten pozitif seçilmiş timositleri çeker ve T hücrelerinde öz tolerans oluşturur. cTEC'lerde eksprese edilen DLL4 ve beta5t'nin yanı sıra mTEC'lerde eksprese edilen Aire ve CCL21 dahil olmak üzere çeşitli moleküller, T hücresi gelişimini ve seçimini destekleyen timus fonksiyonuna katkıda bulunur. cTEC'lerde ve mTEC'lerde fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin akış sitometrik analizi, TEC'lerin biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için yararlıdır, ancak TEC'lerin tek hücreli süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut yöntemler genç yetişkin fare timusundan TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmını (cTEC'ler için yaklaşık %1 ve mTEC'ler için yaklaşık %10) elde edebilir. TEC'lerdeki bu fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin çoğu hücreler içinde lokalize olduğundan, fare TEC'lerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokollerimizi açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Timus, T lenfositlerinin gelişimini ve repertuar seçimini destekleyen epitelyal bir mezenkimal organdır. Timus içindeki kortikal ve medüller mikroortamlarda, timik epitel hücreleri (TEC'ler) T hücresi gelişimini ve seçimini yönlendirmede çok önemli bir rol oynar. Timik korteksteki kortikal TEC'lerin (cTEC'ler) öncelikle erken T hücresi gelişiminin indüksiyonuna ve yeni üretilen T hücresi antijen reseptörü (TCR) eksprese eden timositlerin pozitif seçimine katkıda bulunduğu iyi kabul edilmektedir. Buna karşılık, timik medulladaki medüller TEC'ler (mTEC'ler), korteksten pozitif olarak seçilmiş timositlerin çekilmesi ve kendi kendine reaktif T hücrelerini ortadan kaldırarak ve düzenleyici T hücreleri üreterek merkezi öz toleransın kurulması için gereklidir1,2. TEC'lerin T hücresi gelişimini ve seçimini desteklemedeki bu işlevlerine, cTEC'ler ve mTEC'lerde ifade edilen çeşitli moleküller aracılık eder.

Bunlar, lenfoid progenitörlerin T hücresi soy spesifikasyonu için önemli olan Delta benzeri ligand 4'ü (DLL4) içerir)3,4, beta5t (Psmb11 olarak da bilinir, CD8 T hücrelerinin pozitif seçimi için önemlidir)5,6 ve Prss16 (timus spesifik serin proteaz veya TSSP olarak da bilinir, CD4 T hücrelerinin pozitif seçimi için önemlidir)7,8 cTEC'lerde ifade edilir ve Otoimmün düzenleyici (Aire, öz genlerin rastgele ifadesi için önemlidir)9,10, Fez ailesi çinko parmak 2 (Fezf2, Aire'den bağımsız öz genlerin rastgele ekspresyonu ve timik tutam hücrelerinin oluşumu için önemlidir)11,12,13,14ve C-C motif kemokin ligandı 21 (CCL21, medüller migrasyon ve pozitif seçilmiş timosit birikimi için önemlidir)14,15,16 mTEC'lerde ifade edilir. Akış sitometrisi, TEC'lerde fonksiyonel olarak önemli olan bu molekülleri kantitatif olarak tespit etmek için bir araç sağlar ve cTEC'lerin ve mTEC'lerin hem gelişiminin hem de işlevinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. TEC'lerdeki moleküllerin çoğu, sitoplazma (örneğin, proteazom bileşeni beta5t) ve çekirdek (örneğin, transkripsiyonel düzenleyici Aire) gibi hücreler içinde esas olarak eksprese edildiğinden, akış sitometrisi kullanarak cTEC'lerde ve mTEC'lerde hücre içi molekülleri kantitatif olarak analiz etmek avantajlıdır.

TEC'ler timusta nadirdir. 5 haftalık bir dişi farede yaklaşık 1 × 106 cTEC ve yaklaşık 2,5 × 106 mTEC bulunurken, timik korteks yaklaşık 3 × 108 CD4+CD8+ timosit ve timik medulla yaklaşık 5 × 107 CD4+CD8- ve CD4-CD8+ timositler17 içerir. Bu nedenle, timustaki hücrelerin büyük çoğunluğu (% >99), genç yetişkin farelerde TEC'lerden ziyade timositler de dahil olmak üzere hematopoietik hücrelerdir. Ayrıca, TEC'ler, timus içindeki komşu hücreler (örneğin, timositler) ve mimari hücre dışı bileşenler (örneğin, kollajen) ile sıkı bir şekilde ilişkilidir, bu nedenle TEC'lerin hücre süspansiyonuna salınması, timusun proteaz sindirimini gerektirir. Enzimatik sindirim için geleneksel yöntemler, TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmını verir; cTEC'ler ve mTEC'ler için sırasıyla yaklaşık %1 (1 × 104) ve %10 (2 × 105), 5 haftalık fare thymus17,18,19. Timustan TEC salınımının düşük verimliliği, muhtemelen TEC'lerin proteolitik enzimlere ve mekanik strese duyarlılığından ve TEC'lerin komşu hücrelerle, özellikle cTEC'ler ve CD4+CD8+ timositler20 arasındaki sıkı ilişkisinden kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, mevcut enzimatik sindirim aracılı hücre hazırlama yöntemlerine dayanan akış sitometrik analizi ve tek hücreli RNA dizileme analizi dahil olmak üzere fare TEC'lerinin tek hücreli analizinin sonuçları, TEC'lerin yalnızca küçük bir bölümünü temsil etmektedir ve bu nedenle kapsamlı olmaktan uzaktır. Bununla birlikte, TEC'lerin enzimatik alımındaki bu tür sınırlamalara rağmen, tek hücreli süspansiyondaki fare TEC'lerinin akış sitometrik analizi, cTEC'lerde ve mTEC'lerde işlevsel olarak ilgili moleküllerin kantitatif analizi için hala yararlıdır. Hücre süspansiyonunda TEC'ler, epitelyal yüzey molekülü EpCAM (CD326) için pozitif ve hematopoietik yüzey molekülü CD45 için negatif hücreler olarak tanımlanmıştır. EpCAM+CD45-TEC'ler içinde, Ly51 moleküllerinin (BP-1 ve CD249 olarak da bilinir) ve Ulex Europaeus aglütinin I (UEA1) bağlanma kapasitesinin hücre yüzeyi ekspresyon seviyeleri (esas olarak α bağlı fukoz içeren glikoproteinlere ve glikolipidlere bağlanma) cTEC'leri (Ly51yüksekUEA1düşük) ve mTEC'leri (Ly51düşükUEA1yüksek) fenotipik olarak işaretlemek için kullanılmıştır). Burada, yeni hazırlanmış fare TEC'lerinde hücre içi moleküller beta5t, CCL21 ve Aire'nin kantitatif analizine odaklanarak, fare TEC'lerinin tek hücreli süspansiyonunun konvansiyonel hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için deneysel protokollerimizi açıklıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fare deneyleri, Ulusal Kanser Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (ASP21-431, ASP21-432 ve EIB-076-3) onayı altında gerçekleştirilmiştir.

1. Timus hücresi süspansiyonunun hazırlanması

NOT: Fare ontogenezi, TEC'lerin timustan enzimatik serbestleşmesinin etkinliğini etkiler. Fare yaşına bağlı olarak üç yöntem aşağıdaki gibi tarif edilmiştir.

  1. 3 haftadan eski doğum sonrası fareler için
    1. Bir fareden timusu (iki timus lobu) hasat edin. Timusu buz üzerinde 60 mm'lik plastik bir tabağa 10 mM HEPES içeren 5 mL RPMI1640 koyun.
    2. Kanı, timus olmayan dokuları ve yağları diseksiyon mikroskobu altında kavisli ince uçlu cımbızla çıkarın. Timusu diseksiyon makası ile küçük parçalar halinde (yaklaşık 1-2 mm boyutunda) kesin.
    3. Timus parçalarını% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren RPMI1640 içinde 3 mL 1 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 20 dakika inkübe edin.
    4. 3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 20 dakika daha inkübe edin.
    5. 3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 10 dakika daha inkübe edin.
    6. 3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 5 mL 5 mM EDTA ekleyin.
    7. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. Hücre süspansiyonunu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    8. Hücre peletini 10 mL FACS tamponunda (% 1 sığır serum albümini [BSA] ve% 0.1 NaN3 içeren 1x HBSS) yeniden süspanse edin.
    9. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.
  2. 1 ila 2 haftalık yenidoğan fareler için
    1. Adım 1.1.1'i gerçekleştirin.
    2. Diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon cımbızıyla kan ve timus olmayan dokuları çıkarın. Timusu 10 mM HEPES ile 200 μL RPMI1640 içeren 1,5 mL'lik plastik bir tüpe aktarın ve timusu diseksiyon makası ile küçük parçalar halinde (yaklaşık 1-2 mm boyutunda) kesin.
    3. Timus parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin, ardından süspansiyonu 200 μL'lik bir mikropipetle nazikçe çıkarın.
    4. Timus parçalarını% 2 FBS içeren RPMI1640 içinde 2 mL 0.5 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi içeren 5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.
    5. 3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak nazikçe karıştırın ve ardından daha fazla homojenizasyon için plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet ile karıştırın.
    6. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 2 mL 5 mM EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 16 mL RPMI1640 ekleyin.
    7. Hücre süspansiyonunu 350 × g sıcaklıkta 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    8. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.
  3. Embriyonik fareler ve 1 haftaya kadar olan yenidoğan fareler için
    1. Bir fareden timusu (iki timus lobu) hasat edin. Timusu 60 mm'lik plastik bir tabağa koyun ve kanı, timus olmayan dokuları ve yağları diseksiyon mikroskobu altında kavisli ince uçlu cımbızla alın.
    2. Timusu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mM HEPES içeren 0,2 mL RPMI1640 yerleştirin. Sıvıyı 200 μL'lik bir mikropipet ile atın.
    3. % 2 FBS içeren RPMI1640 0.5 mL 0.5 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi ekleyin. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin. Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın.
    4. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 0,5 mL 5 mM EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan geçirin ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 9 mL RPMI1640 ekleyin.
    5. Hücre süspansiyonunu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 1-3 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    6. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.
  4. Alternatif yöntem: Liberaz sindirimi
    1. 1.1.1 ve 1.1.2 adımlarını gerçekleştirin.
    2. Timus parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin; daha sonra süspansiyonu 200 μL'lik bir mikropipet ile nazikçe çıkarın. Timus parçalarını 1 mL 0.5 U/mL Liberaz ve 10 mM HEPES içeren RPMI1640 1 U/mL DNaz içeren 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 15 dakika inkübe edin.
    3. Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 15 dakika daha inkübe edin.
    4. Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 1 mL 5 mM EDTA ekleyin.
    5. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 18 mL RPMI1640 ekleyin.
    6. Hücre süspansiyonunu 350 × g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 10 mL FACS tamponunda (% 1 BSA ve% 0.1 NaN3 içeren 1x HBSS) yeniden süspanse edin.
    7. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.

2. Timus hücrelerinin antikor boyaması

  1. 16 × 106 hücreyi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe yerleştirin. Hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  2. Boyama IgG'nin hücre yüzeyi Fc reseptörüne spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için FACS tamponuna 10 μL anti-Fc reseptörü monoklonal antikor (mAb, klon 2.4G2) ekleyin. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
  3. Anti-CD45 mAb (hematopoietik hücreye özgü; örneğin, BV421 etiketli), anti-EpCAM mAb (epitel hücresine özgü; örneğin, PE-Cy7 etiketli), anti-Ly51 mAb (cTEC algılama; örneğin, AF647 etiketli) ve Ulex europaeus aglütinin I (UEA-1) (mTEC algılama; örneğin, AF594 etiketli) çalışma konsantrasyonlarının her birine 40 μL ekleyin. Paralel olarak, bir akış sitometresi kurmak için tek renkli lekeli hücreler ve lekesiz hücreler için tüpler hazırlayın.
  4. 4 ° C'de 45 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir iyice karıştırın. 2 mL FACS tamponu ekleyin.
  5. Hücreleri 350 × g 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  6. 1 μL Ghost Dye Violet 510 ekleyin (sabit ve geçirgen hücrelerin akış sitometrik analizinde canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için). Seyreltilmemiş Hayalet Boya reaktifi kullanın; İyice karıştırın. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin; Her 10 dakikada bir iyice karıştırın.
  7. 2 mL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri 350 × g 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  8. PBS'ye 1 mL %2 paraformaldehit (PFA) ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.
  9. Tüpe 3.5 mL PBS ekleyin ve hücreleri 700 × g sıcaklıkta 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin.
  10. 1 mL Hücre İçi Fiksasyon/Geçirgenleştirme Tamponu ekleyerek ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgen hale getirin.
  11. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin.
  12. 1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  13. Anti-beta5t antikor veya anti-CCL21 antikorunun çalışma konsantrasyonlarının her birine 100 μL veya 40 μL anti-Aire antikoru çalışma konsantrasyonları (örn., AF488 etiketli), 1x geçirgenlik tamponunda, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  14. 1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  15. Adım 2.14'ü tekrarlayın.
  16. 100 μL çalışma konsantrasyonlarında tavşan önleyici IgG (örneğin, AF555 etiketli) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  17. 1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  18. Hücreleri 200 μL FACS Tamponunda yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.
  19. Akış sitometrik analizine kadar hücreleri karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
  20. Akış sitometrik analizinden önce hücreleri 60 μm naylon ağdan süzün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiz, en az altı floresan kanalının (CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye ve beta5t, CCL21 ve/veya Aire için) yanı sıra ileri ve yan saçılma parametrelerinin algılanmasına izin veren bir akış sitometresi gerektirir. 0 günlük farelerden ve 2 haftalık farelerden alınan Kollajenaz / Dispas ile sindirilen timus hücrelerinin temsili akış sitometrik profilleri sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Her iki şekilde de, Panel A'daki

figure-results-1

figure-results-2

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dispase'li veya Dispase'siz kollajenaz, TEC'ler 4,5,9,18,21'i hazırlamak için fare timusunu sindirmek için yaygın olarak kullanılır. Kollajenaz da dahil olmak üzere bir proteaz karışımı içeren liberaz, TEC'leri17,22 hazırlamak için timusu sindirmek için de kullanılır. Kollajenaz ve Liberaz kullanımı, enzimlerin ürün grubuna bağlı olarak küçük farklılıklar ortaya çıkabilse de, fare timusundan esasen eşdeğer verim ve cTEC ve mTEC kalitesi verir. Tripsin ayrıca verimli timus sindirimi21,23 için kullanılır, ancak TEC'ler tarafından eksprese edilen EpCAM ve CD80 dahil olmak üzere birçok hücre yüzeyi molekülünün tripsin sindirimine duyarlı olduğu gösterilmiştir21. Timusun enzimatik sindirimi için, hasarlı hücrelerden DNA salınımı nedeniyle viskoziteyi azaltmak için genellikle DNaz eklenir17,21.

Timusun enzimatik sindirimi, TEC'lerin timustan serbest bırakılması için gereklidir. Timus, doku parçaları görünmez hale gelene ve hücre süspansiyonu homojen görünene kadar yeterince sindirilmelidir. Ancak aşırı enzimatik tedavi hücrelere zarar verdiği ve hücre canlılığını azalttığı için sindirim çok uzun süre bırakılmamalıdır. Her deneyde, timus sindirimi sırasında inkübasyon süresine ve pipetleme gücüne dikkat etmek önemlidir. Mevcut enzimatik çürütme teknolojisinin, Giriş'te ayrıntılı olarak açıklandığı ve daha önce 17,18,19 bildirildiği gibi, TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmının serbest bırakılmasına izin verdiğinin farkında olmak da önemlidir.

TEC'ler total timus hücresi süspansiyonunda nadir olduğundan, total timus hücresi süspansiyonu kullanılarak TEC'lerin akış sitometrik analizi, ölçüm başına tipik olarak 8 × 106 ila 16 ila 106 hücre olmak ×üzere birçok hücrenin boyanmasını gerektirir.

Enzimle sindirilmiş timus hücrelerinden türetilen TEC'ler, anti-CD45 manyetik boncuklar22 ve/veya Percoll yoğunluk gradyanlı santrifüjleme31 kullanılarak zenginleştirilebilir. Bu zenginleştirme prosedürleri, özellikle TEC'ler daha sonra bir akış sitometrik hücre ayırıcı üzerinde saflaştırıldığında zaman tasarrufu sağlar. Ayrıca, anti-CD45 zenginleştirmesinin, CD45 eksprese eden timositler20 ile sıkı bir şekilde ilişkili olan bir TEC alt popülasyonunu ortadan kaldıracağı ve Percoll santrifüjlemesinin beklenmedik şekilde yoğun bir TEC alt popülasyonunu ortadan kaldırabileceği de belirtilmelidir.

TEC'lerin fiksasyonu ile ilgili olarak, akış sitometrik analizinde PFA tedavisinin hücreleri küçülttüğü ve ileri saçılma yoğunluğunu azalttığı bilinmektedir. %2 PFA ilavesinden hemen sonra hücrelerin nazikçe pipetlenmesi ve ardından PBS eklenmesi, aşırı hücre büzülmesini önlemeye yardımcı olabilir.

Akış sitometrik analizi için, timus içinde TEC'lerin nadiren ortaya çıktığı göz önüne alındığında, bunların tanımlanması, timositler veya splenositlerle karşılaştırıldığında farklı bir yaklaşım gerektirir. İlk sınıflandırma, timositler ve dendritik hücreler ve makrofajlar da dahil olmak üzere diğer hematopoietik hücreler üzerinde her yerde bulunan hematopoietik bir pan-belirteç olan CD45'in kullanımına dayanmaktadır. Tersine, hematopoietik kökenli olmayan TEC'ler CD45 ekspresyonundan yoksundur. Bunun yerine, TEC'ler yüzeylerinde EpCAM'i eksprese eder, dolayısıyla TEC'leri ayırt etmek için CD45-negatif ve EpCAM-pozitiften oluşan basit bir geçit stratejisine izin verir. Akış sitometrik analizimizde, bu popülasyonu tanımlayarak başlıyoruz ve daha sonra TEC'ler ve timositler arasındaki önemli boyut farklılığı ve TEC'lerin büyük boyutu ve yüksek otofloresansı göz önüne alındığında, ileri ve yan dağılım parametrelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesini sağlıyoruz.

Daha sonra, CD45-negatif EPCAM-pozitif popülasyonda cTEC ve mTEC belirteçlerinin değerlendirilmesine dikkat çekilir. Bu popülasyonun küçültülmüş büyüklüğü nedeniyle, bu adım cTEC'leri ve mTEC'leri telafi etmek için zorunlu hale gelir. Tamamen boyanmış bir panelin (örneğin, cTEC işaretleyici Ly51 ve mTEC işaretleyici UEA-1 ile birlikte TEC tanımlayıcı CD45 ve EpCAM) incelenmesi, saçılma ölçeklendirmesinin yeterliliğini daha da sağlar. Akış sitometrik kurulumu sırasında birincil hedefimiz, her antikor için pozitif ve negatif popülasyonları ayırt etmek etrafında döner.

Aire, beta5t ve CCL21'in birlikte boyanmasında, TEC alt kümeleri içindeki farklı popülasyonlar tanımlanır. Aire'in mTEC'ler tarafından seçici ekspresyonu göz önüne alındığında, CD45-negatif/EPCAM-pozitif/UEA-1-pozitif/Ly51-negatif hücrelerin dört renkli lekesine odaklanıyoruz. Burada, Aire için negatif kontrol oluşturmak için UEA-1-pozitif hücreler kullanılır ve Aire-pozitif hücrelerin net bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırır. mTEC'lerde ifade edilen CCL21 için de benzer bir yaklaşım benimsenmiştir. Tersine, yalnızca cTEC'ler tarafından ifade edilen beta5t için, beta5t için arka plan seviyelerini belirlemek için dört renkli leke içindeki Ly51-pozitif hücrelere vurgu yapılarak karşılaştırılabilir bir geçit stratejisi uygulanır. Anti-beta5t ile boyanmış numunelerin müteakip analizi, pozitif bir popülasyonun tanımlanmasını kolaylaştırır.

Anti-beta5t antikoru ve anti-CCL21 antikoru tavşan antikorlarıdır, bu nedenle bu antikorlar önceden floresan etiketlemesi yapılmadan karıştırılmamalıdır. Antikorların çalışma konsantrasyonları, antikorların seri seyreltmeleri ile boyanmış kontrol hücrelerinin (örneğin, vahşi tip ve nakavt farelerden alınan TEC'ler) akış sitometrik analizi yapılarak önceden belirlenmelidir.

Akış sitometrik analizinde, cTEC'ler ve mTEC'ler sıklıkla cTEC'ler için Ly51 veya CD205'in ve mTEC'ler için UEA1 ve CD80'in hücre yüzeyi ekspresyonu ile tanımlanır. Bununla birlikte, cTEC'lerin ve mTEC'lerin sonunda timustaki mikroanatomik lokalizasyonları ile tanımlanması gerektiği akılda tutulmalıdır. Embriyonik timusta, ortaya çıkan kanıtlar, Ly51 ve CD205'in ekspresyonunun cTEC'lerle sınırlı olmadığını, cTEC/mTEC-bipotent progenitörler ve olgunlaşmamış mTEC'ler32,33 dahil olmak üzere diğer TEC popülasyonlarına uzandığını göstermiştir. Ek olarak, cTEC'lerdeki Ly51 ekspresyonu, Şekil 1 ve Şekil 2'de de gösterildiği gibi, doğum sonrasıdönem 33'e kıyasla embriyogenez ve perinatal dönemde düşük kalır.

Sonuç olarak, TEC'lerin enzimatik olarak serbest bırakılmış tek hücreli süspansiyonunun akış sitometrik analizi, TEC'lerin serbest bırakılmasının sınırlı etkinliğine rağmen, TEC'lerin ve alt popülasyonlarının tek hücre çözünürlüğünde kantitatif analizi için güçlü bir teknik sunar. Özellikle, tek hücreli TEC süspansiyonundaki hücre içi moleküllerin akış sitometrik analizi, TEC'lerin ve bunların alt popülasyonlarının gelişimi ve işlevi için önemli olan çeşitli moleküllerin ekspresyonunu incelemek için yararlıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makaleyi okuduğu için Dr. Izumi Ohigashi'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü ve Kanser Araştırma Merkezi 011806 Intramural Araştırma Programı ZIA BC tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kollajenaz / Dispas Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetieBioscience00-5523-00
Hayalet Boya Menekşe 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anti-fare CD45 monoklonal antikor, Klon 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-fare Ly51 monoklonal antikor, Klon 6C3BioLegend108312
PE / Cy7 anti-fare EpCAM / CD326 monoklonal antikor, Klon G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglütinin I (UEA1)Vektör LaboratuvarlarDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anti-fare Aire monoklonal antikor, Klon 5H12eBioscience53-5934-82
Anti-fare Psmb11 / beta5t tavşan monoklonal antikoru, Klon CPTC-PSMB11 (fare) -1NIH NCICPTC-PSMB11 (fare) -1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anti-fare CCL21 / exodus 2 tavşan poliklonal antikoruBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-tavşan IgG ağır zincir keçi rekombinant antikoruInvitrogenA27039
Anti-Fare CD32 / CD16 – Saflaştırılmış (Fc Blok Antikoru)Leinco TechnologiesC247
Naylon Mesh 60 MikronBileşen KaynağıW31436
Ekipman
ThermomixerEppendorfIsı bloğu
Cellometre Otomatik 2000 Hücre Canlılığı sayacıNexcelomYaşayabilir hücre sayımı
LSRFortessa Hücre Analiz CihazıBD BiosciencesFlow sitometreBeş lazer (355, 408, 488, 595 ve 637 nm)
FACSDiva yazılım sürümü 9.0.1BD BiosciencesFlow sitometrik analiz
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesFlow sitometrik veri analizi
AntikorSeyreltme oranı (Çalışma konsantrasyonu)Seyreltme Tamponu
Anti-Fare CD32/CD16 – Saflaştırılmış (Fc Blok Antikoru)1:40FACS Tampon
BV421 anti-fare CD45 monoklonal antikor1:25FACS Tampon
PE / Cy7 anti-fare EpCAM / CD326 monoklonal antikor1:100FACS Tampon
Alexa Fluor 647 anti-fare Ly51 monoklonal antikor1:100FACS Tampon
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglütinin I (UEA1)1:400FACS Tamponu
Anti-fare CCL21 / exodus 2 tavşan poliklonal antikoru1:2001x Geçirgenleştirme Tamponu
Anti-fare Psmb11 / beta5t tavşan monoklonal antikor, Klon CPTC-PSMB11 (fare) -11:10001x Geçirgenleştirme Tamponu
Alexa Fluor 555 anti-tavşan IgG ağır zincirli keçi rekombinant antikoru1:4001x Geçirgenleştirme Tamponu
Tamponu10
;%
RPMI1640için Hücre hazırlama
FACS tamponu için (%1 BSA içeren 1x HBSS  ve% 0.1 sodyum azid)Hücre hazırlığı ve antikor boyama
2 FBS içeren RPMI1640 1 mg / ml Kollajenaz / Dispas ve 1U / ml DNaz çözeltisiEnzim sindirimi
PBS'de% 2 PFAHücre fiksasyonu
Fiksasyon / Geçirgenleştirme Tamponu (3 kısım Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyreltici ile 1 kısım Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi)Hücre fiksasyonu için
1x Geçirgenleştirme Tamponu (9 kısım damıtılmış su ile 1 kısım 10X konsantre)Hücreler arası antikor boyama için 
mM HEPES içeren RPMI1640 amaç2 FBS içeren hücre hazırlama için% içiniçin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak Sitometrisintrasell ler BoyamaFare TimusuH cre zolasyonuKortikal TEC lerMed ller TEC lerBeta5t EkspresyonuCCL21 Tespiti

İlgili makaleler