Bu protokol, domuzlardan paratiroid bezleri elde etmek için hızlı ve öldürücü olmayan bir yöntem sunar. Prosedür üç ana adımdan oluşur: anestezi ile domuz hazırlığı, tek taraflı timus alımı ve intratimik paratiroid bezinin ex vivo tanımlanması ve çıkarılması.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Donör Domuzlardan Paratiroid Bezi Temini ve Ex Vivo Kimliklendirme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Genellikle cerrahi komplikasyonlardan kaynaklanan hipoparatiroidizm, kalsiyum homeostazını ciddi şekilde bozarak semptomların devre dışı bırakılmasına neden olur. Mevcut tedaviler, paratiroid nakli gibi alternatif tedavilere olan ihtiyacı vurgulayarak sınırlı bir rahatlama sunmaktadır. Bu çalışma, özellikle ksenotransplantasyon alanı için transplantasyon araştırmalarında potansiyel uygulamaları olan domuzlardan canlı donör paratiroid temini için basit bir yöntem sunmaktadır. Prosedür üç ana adımı içerir: anestezi ile domuz hazırlığı, tek taraflı timus alımı ve intratimik paratiroid bezinin ex vivo tanımlanması ve çıkarılması. Protokol, operasyon sonrası etik tedavi ve iyileşmeyi sağlayan prosedürlerle birlikte Landrace domuzlarını kullanır. Paratiroid bezlerini başarıyla çıkardık ve sonraki analizlerle canlılıklarını ve bütünlüklerini doğruladık. Doku süpernatantındaki PTH seviyeleri 1.000 pg / mL'yi aştı ve immünofloresan boyama, paratiroid bezlerini timik dokudan ayırdı ve prosedürün güvenilirliğini doğruladı. Bu protokol, domuzlardan paratiroid bezi temini için hızlı, öldürücü olmayan ve etik açıdan sağlam bir yöntem sunar ve domuzlar ve insanlar arasındaki anatomik farklılıkları ele alır. Hipoparatiroidizm araştırmaları ve ksenotransplantasyon için önemli etkileri olan sürdürülebilir bir yaklaşım sunar.
Giriş
Bu protokol, domuzlardan paratiroid bezi temini için hızlı ve öldürücü olmayan bir yöntem sunar. Yetersiz parathormon sekresyonu ile karakterize hipoparatiroidizm, kalsiyum homeostazını kritik olarak bozar1. Ağırlıklı olarak paratiroidektomi veya tiroidektomiyi takiben cerrahi bir komplikasyon olan bu durum, asteni, kronik ağrı, taşikardi, nöbetler ve hatta son dönem böbrek hastalığı gibi semptomlarla kendini gösterir2. Bazen, nadir görülen otoimmün veya genetik bozukluklardan kaynaklanır. Mevcut tedaviler, özellikle kalsiyum ve D vitamini oral takviyesi veya rekombinant parathormon, yorgunluk ve depresyon gibi sistemik semptomlardan sadece kısmi rahatlama sağlar 3,4. Şiddetli hipoparatiroidizm için potansiyel bir çare olarak paratiroid allotransplantasyonunun artan gerekliliği, tek tip nakil protokollerininoluşturulması gerekliliğini vurgulamaktadır 5,6,7,8,9. Bununla birlikte, paratiroid transplantasyonu ile ilgili klinik öncesi çalışmalar sınırlı kalmıştır ve standardize edilmiş hayvan modelleri eksiktir. Ayrıca, ksenotransplantasyon alanındakison artış 10,11, özellikle endokrin hücre tedavisi alanında olmak üzere ksenotransplantasyonun klinik uygulamalarına olan ilgiyi artırmaktadır12,13. Bununla birlikte, paratiroid ksenotransplantasyonunun domuz modelleri, domuzlarda paratiroid dokusunu tanımlamanın karmaşıklığı nedeniyle zordur. Bu nedenle, paratiroid ksenotransplantasyonunu daha da geliştirmek için domuzlardan paratiroid bezlerini almak için tekrarlanabilir, sürdürülebilir ve etik bir teknik sağlamaya ihtiyaç vardır.
Tipik olarak tiroidin arkasında bulunan dört paratiroid bezine sahip olan insanlardan farklı olarak, domuzların çoğu, her biri timusun kafatası kısmında bulunan iki paratiroid bezine sahiptir. Domuzlarda paratiroid bezlerini bulmayı amaçlayan önceki çalışmalar, ya ex vivo tanımlama için ölümcül yöntemlere ya da ksenotransplantasyonda uygulanması zor olabilecek florofor bazlı tekniklere dayanıyordu 14,15,16. Burada, iki temel adıma dayanan, ksenotransplantasyon için uygun, basit ve ölümcül olmayan bir teknik öneriyoruz: domuz timüsünün alınması ve transillüminasyon kullanılarak paratiroid bezinin ex vivo itanımlanması. Bu teknik, transplantasyonun yanı sıra paratiroid fizyolojisi üzerine araştırmalar için de yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan çalışmaları, Lille Üniversitesi'nin hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır (referans #20491-20190219161313).
1. Domuz anestezisi
- Preoperatif analjezi sağlamak için ilk insizyondan 30 dakika önce buprenorfin (kas içine 0.015 mg / kg) uygulayın.
- Sedasyonu indüklemek için kas içi ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (3 mg / kg) enjeksiyonu yapın. Anesteziyi derinleştirmek için 3 ila 5 dakika inhalasyon yoluyla % 5 izofluran uygulayın.
- Göz kapağı kapanma refleksini ve yutma refleksini kontrol ederek anestezi derinliğini değerlendirin. Domuzu entübe edin ve ameliyat masasına sırtüstü yatırın. Anestezi bakımı için inhalasyon yoluyla izofluran konsantrasyonunu% 2'ye düşürün.
- Prosedür boyunca optimum anestezik derinliği ve fizyolojik stabiliteyi sağlamak için taşınabilir çok parametreli bir veteriner monitörü kullanarak kalp atış hızını ve oksijen satürasyonunu sürekli olarak izleyin.
2. İlgi alanının açıklanması
- Submandibular bölgeden sternuma kadar uzanan servikal bölgeyi tıraş edin ve titizlikle temizleyin.
- Steril bir alan sağlamak için antiseptik sabun ve ardından klorheksidin uygulayın. Tüm alanı iyice kurulayın.
- Cerrahi müdahale için ön servikal bölgeyi izole etmek için steril örtüler yerleştirin.
3. Domuz timus maruziyeti
- Bir neşter kullanarak beyaz servikal çizgi boyunca 10 cm'lik dikey bir kesi yapın. Pretiroid kaslarını ayırmak ve net bir cerrahi alan oluşturmak için alanı Metzenbaum makasıyla dikkatlice inceleyin.
- Bağ dokusunun diseksiyonunu kolaylaştırmak ve timusu açığa çıkarmak için omohyoid kas ile tiroid kıkırdağı arasına kendi kendini tutan bir ekartör yerleştirin.
NOT: Yaralanmayı önlemek için trakea üzerine aşırı baskı uygulamaktan kaçının. - Timusun kraniyal kısmını yavaş yavaş açığa çıkarın ve vagus siniri, iç juguler ven ve ortak karotid arteri içeren karotis kılıfından dikkatlice ayırın.
NOT: Yaralanmayı önlemek için, hemostaz elde etmek için elektrokoagülasyon kullanın.
4. Domuz timus alımı
- Serbest bırakıldıktan sonra, tipik olarak 5-8 cm ölçülerinde olan timusun kraniyal kısmını çıkarın.
- Paratiroid bezinin tanımlanmasını kolaylaştırmak için ekstrakte edilen timusu izotonik salin solüsyonunda durulayın.
NOT: Bu adım, paratiroid bezinin farklı dokusunun görselleştirilmesini ve farklılaşmasını geliştirmek için çok önemlidir
5. İntratimik paratiroid bezinin ex vivo olarak tanımlanması
- Paratiroid bezinin tanımlanmasını kolaylaştırmak için timik dokuyu nazikçe düzleştirin.
NOT: Paratiroid bezi, özellikle çevresindeki dokuya kıyasla belirgin bir doku sergiler. Paratiroid bezinin fibrotik kapsülü daha sıkıdır ve bezelye ile benzer büyüklüktedir. - Transillüminasyon yoluyla paratiroid bezini tanımlamak için bir ışık kaynağı kullanın.
NOT: Paratiroid bezini çevreleyen damar sistemi, farklılaşmasına yardımcı olacak şekilde açıkça görülebilir olmalıdır. - Kapsülü dikkatlice çıkarın ve tüm paratiroid bezini çıkarın. Hassas kullanım için Debakey forseps ve hassas diseksiyon için Metzenbaum makas kullanın. Bezi çevreleyen timik dokudan izole edin.
- İzole edilmiş paratiroid bezini soğuk hava deposu solüsyonuna koyun ve sonraki prosedürler için canlılığını korumak için 4 ° C'de tutun.
- Daha sonraki işlemler için dokuyu parafine gömün.
6. Cerrahi kapatma ve uyandırma
- Paratiroid bezinin alınmasından sonra, ameliyat bölgesini katmanlar halinde kapatın. Emilebilir dikişler kullanarak kasları ve deri altı dokuları dikin. Cildi emilmeyen dikişlerle kapatın.
- Yavaş yavaş domuzu anesteziden ayırın. Bilincinizi geri kazandıktan sonra, domuzu ameliyat sonrası acil komplikasyonlar açısından izleyin.
- Postoperatif protokole göre analjezik ve antibiyotik uygulayın (buprenorfin 0.03 à 0.05 mg / kg ve 48 saat boyunca Clamoxyl 15 mg / kg). Domuzları veteriner gözetiminde iyileşmek üzere barınaklarına geri koyun.
7. İmmün boyama protokolü
- Parafine gömülü numunelerden deparafinizasyon ve dehidrasyon gerçekleştirin: 5 dakika ksilen, 10 dakika ksilen, 5 dakika %100 etanol, 7 dakika 30 %90 etanol, 7 dakika 30 %70 etanol, 5 dakika %50 etanol, 5 dakika damıtılmış su ve 5 dakika fosfat-tampon-salin (PBS).
- Numuneleri sitrat tamponu pH 6'da 650 W'ta 9 dakika boyunca mikrodalgada pişirerek antijen alımını gerçekleştirin. Numunelerin tamponda 20 dakika soğumasını bekleyin. PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
- Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için bir Dako-kalem ile çevrelenmiş numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika protein bloğu çözeltisi ile inkübe edin.
- % 1 Sığır Serum Albümini (BSA) içinde seyreltilmiş birincil antikor (PTH Antikoru (H-7), Fare IgG-α-insan, sc-398856, 1: 100) ile numuneleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- % 1 sığır serum albümini içinde seyreltilmiş ikincil antikor (Alexa Fluor 488, keçi-α-Fare, A11001, 1:500) ile oda sıcaklığında 1 saat 30 dakika inkübe edin. İki kez PBS ile ve bir kez çift damıtılmış su ile 5 dakika yıkayın.
- Slaytları DAPI solüsyonu ile monte edin ve slaytları 4 °C'de saklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmanın birincil sonuçları, Landrace domuzlarından paratiroid bezlerinin başarılı bir şekilde çıkarılmasını ve bunların canlılığını ve bütünlüğünü doğrulamak için müteakip analizleri içerir. Sonuçlar aşağıdaki gibi özetlenmiştir. Paratiroid dokusunun tanımlanması intraoperatif olarak transillüminasyon ile doğrulandı (Şekil 1A). Ekstraksiyondan sonra, iki küçük doku örneği toplandı (her biri yaklaşık% 10). Bir numune, 1 mL DMEM-F12 kültür ortamında bir tabak tabağında kıyıldı. ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, domuzlarda paratiroid bezi temini için hızlı ve öldürücü olmayan bir yöntem sunar. Protokol içindeki en önemli adım, daha fazla ex vivo araştırma için tam geri kazanımı sağlamak için domuz timusunun lokalizasyonunu içerir. Timus çıkarıldıktan sonra, paratiroid bezi transillüminasyon kullanılarak kolayca tanımlanabilir.
Bu tekniğin ana zorluklarından biri, protokolümüz domuz ve insan PTG konumları arasındaki anatomik farklılıkları ortadan ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Fransız Diyabet Derneği'ne ve Fondation pour la Recherche Médicale'e destek ve araştırma fonu için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| 22G Kısa Periferik Kateter | Smiths Medical | 5060 | |
| Temel set II, krep | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (bupr & eacute; norfin) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| Tek Kullanımlık Neşterler | Swann-Morton | 0510 | |
| Elektrot spatula | Erbe | 21191-002 | |
| Elektrocerrahi Jeneratörü BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| Yerçekimi infüzyonu Mobil Luer Kilit uçlu 3 vana | Care Fusion | A64-3V | |
| Elektrotlar için iki düğmeli tutamak Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| İzofluran Huni Doldurma Buharlaştırıcı | Supera Anestezi Yenilikleri | VAP3000 | |
| Isorane (izofluran) | Axience | ||
| Ketamidor (ké tamin) | Axience | ||
| Işık Tavan Çift | RIMSA | PENTA81 + 30E | |
| Medisorb Karbon Dioksit Emici | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutürler 0 | Ethicon | F2520 | |
| Mikrotom | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| Oksijen Konsantratörü | DeVilbiss | 525KS | |
| Paxman (ksilazin) | Virbac | ||
| Taşınabilir Çok Parametreli Veteriner Monitörü | Mindray | IPM 10 | |
| Yeniden Kullanılabilir Laringoskop Kolları | Opticlar | 600.080 | |
| Küçük Hayvan Anestezi Ventilatörü | Midmark | 91806001 | |
| Sodyum Klorür Enjeksiyonu Viaflo | Baxter | ||
| Cerrahi Aletler | Kohler medizintechnik | ||
| Cerrahi Masa | Vetinox | TA700005 | |
| Trakeal Tüp | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| Malzemeler ve Reaktifler< / güçlü> | |||
| DMEM F-12 orta | ThermoFischer | 11320033 | |
| Parathormon antikoru | SantaCruz | sc-398856 | |
| Hızlı intraoperatif pth testi | Beckman Coulter | A16972 |
Kaynaklar
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
