Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Glokom, dünya çapında körlüğün önde gelen bir nedenidir ve görme restorasyonunu zorlaştıran karmaşık bir patojenik mekanizma ile karakterizedir. Fareler, nispeten homojen genetik geçmişleri ve yapısal olarak insanlardakilere benzeyen retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) nedeniyle glokomun patogenezini ve tedavisini incelemek için değerli hayvan modelleri olarak hizmet eder. Fare glokom modellerinde RGC hasarının ve tedavi sonuçlarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi, tüm retina boyunca RGC numarasının belirlenmesini gerektirir. Bu protokol, tüm retinanın izolasyonunu, RGC'lerin spesifik antikorlarla etiketlenmesini ve AI tabanlı bir program kullanılarak RGC'lerin hızlı, doğru otomatik sayımını içeren kapsamlı bir yöntemin ana hatlarını çizer. Kolaylaştırılmış yaklaşım, fare retinalarındaki RGC sayılarının verimli ve kesin bir şekilde ölçülmesine izin vererek, RGC dejenerasyonunun ve potansiyel terapötik müdahalelerin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, araştırmacıların RGC hasarının derecesini değerlendirmelerini sağlayarak, glokom patogenezinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur ve görme kaybını yönetmek ve önlemek için etkili tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.
Giriş
Glokom, ganglion hücrelerinin ilerleyici ölümü ile karakterizedir ve bu da görme restorasyonu için önemli bir zorluk teşkil eder 1,2. Bu hastalık, prevalansı ve görme üzerindeki etkisi nedeniyle oftalmik araştırmaların ana odak noktasıdır3. Fare modelleri glokomda vazgeçilmezdir
Homojen genetik altyapıları, yüksek üreme kapasiteleri ve ganglion hücre özelliklerinin insana benzerliği nedeniyle yapılan araştırmalar4. Bu yöntemin birincil amacı, glokomun patogenezini anlamak ve ilgili tedavileri geliştirmek için gerekli olan fare modellerinde retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) doğru bir şekilde ölçmektir.
Bu tekniğin geliştirilmesinin ardındaki mantık, fare modellerinde RGC dejenerasyonunu değerlendirmek için güvenilir ve verimli bir yönteme duyulan ihtiyaçtan kaynaklanmaktadır. RGC'lerin retina kesitlerinde etiketlenmesi gibi geleneksel yöntemler, retinadaki RGC'lerin eşit olmayan dağılımı nedeniyle genellikle güvenilmez sonuçlar verir5. Tüm retina boyunca RGC'lerin ölçülmesi, sayılarındaki değişiklikleri daha iyi yansıtır ve hastalığın ilerlemesini ve terapötik müdahaleleri değerlendirmek için çok önemlidir.
Bu yöntem, alternatif tekniklere göre çeşitli avantajlar sunar. Örneğin, 40.000 ila 60.000 RGC içeren normal bir yetişkin fare retinasında retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) manuel olarak sayılması zaman alıcı ve hataya açık olabilir 6,7,8. Geliştirdiğimiz otomatik RGC sayım yazılımı, 3 dakikadan daha kısa sürede doğru sayım yapılmasına olanak tanıyarak araştırmacılara potansiyel olarak önemli miktarda zaman kazandırıyor. Ek olarak, otomatik sayım için kullanılan yapay zeka tabanlı yazılım, önyargıyı en aza indirir ve tekrarlanabilirliği artırır.
Ayrıca, bu teknik, farklı fare modellerinde ve deneysel koşullarda RGC dejenerasyonunu değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlar ve glokom araştırması alanına değerli veriler sağlar. Yöntem, hastalıklardaki retina değişikliklerini anlamak için tam montajlı retina analizinin önemini vurgulayan diğer çalışmalarla uyumludur9.
Okuyucuların bu yöntemin kendi uygulamaları için uygun olup olmadığını belirlemelerine yardımcı olmak için, bu tekniğin, glokom veya diğer retina hastalıklarının fare modellerinde retinal ganglion hücresi (RGC) dejenerasyonunu inceleyen araştırmacılar için özellikle avantajlı olduğunu belirtmek önemlidir. Yöntem, çeşitli deney kurulumlarına uyarlanabilir ve RGC sayımında yüksek derecede doğruluk ve verimlilik sunar, bu da onu hem küçük ölçekli hem de büyük ölçekli çalışmalar için ideal hale getirir. Ek olarak, protokolün basit tasarımı ve kullanıcı dostu yazılımın mevcudiyeti, onu retina analizinde farklı uzmanlık seviyelerine sahip araştırmacılar için erişilebilir kılar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Prosedür, araştırmada hayvanların kullanılması için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin yönergelerine uygun hale geldi ve Sichuan İl Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57Bl/6J erkek fareler (2 aylık) kullanıldı. Şekil 1 , burada açıklanan genel prosedürü göstermektedir. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Tam montajlı retinaların izolasyonu
- Hayvan kurban etme
- Fareleri servikal çıkık kullanarak sakfidel edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) (Şekil 2A). Servikal çıkık öncesi,
İzofluranı (oksijende% 3 -% 5) soluyarak veya ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun.
- Fareleri servikal çıkık kullanarak sakfidel edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) (Şekil 2A). Servikal çıkık öncesi,
- Enükleasyon ve göz küresi işleme
- Sonraki diseksiyon sırasında oryantasyonu hatırlamak için göz küresinin dorsal tarafındaki korneanın kenarını mavi bir işaretleyici ile işaretleyin.
- Göz küresine bağlı kalan kas dokularını makasla çıkarın. Enükleasyonlu göz küresini kısa bir durulama için 1x PBS ile doldurulmuş 2 mL yuvarlak tabanlı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 2C).
- Fiksasyon
- Göz küresini, 4 ° C'de 10 dakika boyunca fiksasyon için yeni yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA) içeren başka bir 2 mL yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 2D).
- Diseksiyon mikroskobu altında ince makas kullanarak kornea üzerinde küçük bir kesi (yaklaşık 1-2 mm) yapın.
- Doku morfolojisini korumak için 3 saat boyunca 4 ° C'de daha fazla fiksasyon için göz küresini tekrar fiksatife yerleştirin (Şekil 2D).
- Kornea ve lensin çıkarılması 1,9
- İnce cerrahi makas kullanarak kornea ile sklera arasındaki sınır olan kornea limbus çevresinde yaklaşık 1 mm'lik küçük bir kesi yapın.
- Korneanın çevresini dikkatlice kesin ve alttaki yapıları ortaya çıkarmak için tamamen çıkarın.
- Retinanın zarar görmesini önlemek için lensi çevre dokulardan nazikçe kavramak ve dikkatlice kaldırmak için ince forseps kullanın. Hassas bir işlemle retinanın yapısal bütünlüğünü koruyun.
- Daha sonraki işlemler için vizör lastiğini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Korneayı eksize edin ve "çapraz yarık" tekniğini kullanarak lensi daha verimli bir şekilde çıkarın10. Kornea boyunca iki dikey yarık açın ve lensi çıkarmak için forseps kullanın.
- Skleral insizyon
- Sonraki diseksiyon adımlarını kolaylaştırmak için ince oftalmik makasla sklerada hassas bir yarık açın (Şekil 2J).
- Retina ayrılması
- Sklera ve retina arasındaki kesiye dişlerle forseps yerleştirin. Dokunun yırtılmasını önlemek için aşırı kuvvetten kaçınarak skleranın kenarını nazikçe kavrayın.
- Forsepsleri sklera ve retina arasındaki sınır boyunca yavaş, sabit el hareketleriyle hareket ettirerek insizyonu kademeli olarak büyütün. Sklerayı retinadan dikkatlice ayırmak için forsepsin dişli kısmını kullanın ve retinanın hasar görmediğinden emin olun (Şekil 2J).
- Retina kesimi
- Keskin bir makas kullanarak retinayı kabaca eşit büyüklükte dört flebe bölün. Kesiklerin optik sinirin yaklaşık yarısına kadar olduğundan ve birbirinden 90° uzağa yönlendirildiğinden emin olun.
- Retina temizliği
- Yumuşak kıllı bir fırça kullanarak diseke retinayı nazikçe açın ve yüzeyindeki kalıntıları titizlikle temizleyin (Şekil 2K).
- Son fiksasyon
- İzole edilmiş retinayı, tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak taze% 4 PFA içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Dokunun korunması için 5 saat ila gece boyunca buz üzerinde fiksasyona izin verin.
2. İmmün boyama
- Yıkama
- İzole edilmiş tam montajlı retinayı 1x PBS'de 5 dakika boyunca hafif çalkalama ile yıkayın. PBS çözümünü atın. Artık fiksatif ve kalıntıları temizlemek için bu işlemi iki kez tekrarlayın.
- Engelleme
- Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek ve geçirgenliği artırmak için yıkanmış retinayı 30 dakika boyunca bir bloke edici tampon çözeltisine (% 4 normal eşek serumu (NDS) ve% 0.2 Triton X-100 ile 1x PBS) daldırın (Şekil 3A).
- Birincil antikor inkübasyonu
- Bloke edici tamponu birincil antikor BRN3A ile değiştirin (bloke edici tamponda 1:200 oranında seyreltilmiş). Spesifik antijen-antikor bağlanmasına izin vermek için retinayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 3B).
- Yıkama
- Bağlanmamış primer antikorları çıkarmak ve arka plan lekelenmesini azaltmak için retinayı her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın (Şekil 3C).
- İkincil antikor inkübasyonu
- Hedef antijenleri görselleştirmek için retinayı Alexa594- veya Alexa488 konjuge anti-tavşan ikincil antikoru (1:300 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin (Şekil 3D).
- Yıkama
- Fazla ikincil antikorları uzaklaştırmak ve spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile art arda üç yıkama yapın.
- Montaj
- İmmün lekeli retinayı nazikçe bir cam mikroskop lamına aktarın, katlanmayı veya bozulmayı en aza indirmek için dikkatlice düzleştirin.
- Retinanın merkezine küçük bir damla solma önleyici montaj ortamı uygulayın ve doku boyunca eşit dağılım sağlayın.
- Hava kabarcıklarından kaçınarak monte edilmiş retinanın üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin (Şekil 3E,F).
3. Görüntü işleme
NOT: Görüntüyü RGC otomatik sayma yazılımına aktarın ve saymaya başlayın. Tüm retina için BRN3A pozitif hücrelerin sayısı dakikalar içinde elde edilebilir. AutoCount yazılımını GitHub'dan (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs) indirin. Aşağıdaki yazılım için ayrıntılı kurulum adımlarını izleyin:
- Kodu GitHub bağlantısından indirin. Biri "Intelligent-quantifying-RGCs.zip" adlı bir dosya alacak. Bu dosyayı açın.
- Gerekli dosyaları bulut diskinden indirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve sıkıştırmayı açın. İndirilen dosya "yolov5_cpu" olarak adlandırılır. Beklenmeyen sorunları önlemek için bu paketin sıkıştırmasını geçerli klasöre açın.
- 1. adımdaki Config dosyasını bulun ve içeriğini "yolov5_cpu" yolunu gösterecek şekilde değiştirin.
NOT: Örneğin, indirilen "yolov5_cpu" "D:\1me\yolov5_cpu_" içine yerleştirilmişse, 1. adımdaki "config.ini" dosyasını "D:/1me/yolov5_cpu" olarak değiştirin (\ yerine / kullanın). (Şekil 4A). - userinterface.exe tıklayarak grafik arayüzü açın. İlk yükleme yavaş olabilir (yönetici olarak çalıştırın) (Şekil 4B).
- Yazılımı açtıktan sonra, "pmse_plus.pt" model dosyasının C sürücüsünün kök dizininde bulunup bulunmadığını doğrulayın. Mevcut değilse, bu dizine kopyalayın.
NOT: "pmse_plus.pt" model dosyası, ayıklanan Intelligent-quantifying RGCs klasöründe bulunan "yolov5" klasörünün weights klasöründe bulunur (Şekil 4C). - Algılanacak görüntüleri hazırlayın.
NOT: Yazılım, aynı anda yalnızca bir veya beş resmin okunmasına izin verir. Daha fazla okumak bir hataya neden olur.
4. Otomatik hücre sayımı
- Sayma yazılımını açın (Şekil 5A).
- Görüntüyü içe aktarmak için RESMİ AÇ'a tıklayın (Şekil 5B).
- Yazılımın hücreleri otomatik olarak saymasına izin vermek için ÇALIŞTIR'a tıklayın (Şekil 5C).
NOT: Yazılım, sayılan hücreleri kırmızı kare bir kutu ile işaretleyecek ve hücre sayısını sağ üst köşede gösterecektir (Şekil 5D).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, titiz doku hazırlığı, hassas antikor inkübasyonu ve güvenilir otomatik hücre sayımı sağlayarak fare retinalarının tam montajlı immün boyama metodolojisini detaylandırır. Prosedür, retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) sağlam bir şekilde etiketlenmesini ve nicelleştirilmesini kolaylaştırarak, çeşitli deneysel bağlamlarda hücresel popülasyonların doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Yöntem, vahşi tip ve glokom modellenmiş farelerde RGC'leri saymak için kullanıldı ve tutarlı sonuçlar verdi. Temsili b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, bir fare retinasındaki tüm retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) belirlenmesi için bir yöntem sağlar ve bu, glokom çalışmaları için fare modellerinde RGC dejenerasyonunun ilerlemesini izlemek için kullanılabilir. Fare retinası hassas bir sinir dokusudur5 ve tam montajlı retinaları fare gözlerinden izole etmek tekrarlanan uygulama gerektirir. Deney sırasında, fiksasyon süresinin retina morfolojisini önemli ölçüde etkilediği bulundu. Yaklaşık 2 haftal...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma projesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82371059 (HZ)), Çin'in Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2023JDZH0002 (HZ)), Chengdu Bilim ve Teknoloji Bürosu (2022-YF05-01984-SN (HZ)) ve Sichuan İl Halk Hastanesi (30320230095 (JY), 30420220062 (JY)).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1&kez; PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594 konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG (H+Lü) | ThermoFisher | A-11012 | |
| Anti-BRN3A antikoru [EPR23257-285] | Abcam | ab245230 | |
| Otomatik Sayım yazılımı | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| Bulut disk | Google sürücü bağlantısı | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| Bulut disk | Baidu bağlantısı | Çıkarma kodu: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Marker | Sharpie | ||
| Normal Eşek Serumu | Biosharp, Labgic | 25030081 | |
| Paraformaldehit | Macklin | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sükroz | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
Kaynaklar
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
