68Ga Etiketli Nano Molekülün Radyosentezi, Kalite Kontrolü ve Küçük Hayvan Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi

Özet

Bu makale, yeni bir radyoaktif işaretli probun (yani, ⁶⁸Ga etiketli nanobody NM-02) radyosentezini, formülasyonunu, kalite kontrolünü ve bir ksenogreft modelinde küçük hayvan PET/BT görüntülemesi için kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Küçük hayvan Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) ve Tek Foton Emisyon Bilgisayarlı Tomografi (SPECT) görüntüleme teknikleri, klinik öncesi kanser araştırmalarında çok önemlidir ve radyoizleyici sentezi, kalite güvencesi ve in vivo enjeksiyon protokollerine titiz bir şekilde dikkat edilmesini gerektirir. Bu çalışma, küçük hayvan PET deneylerinin sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için uyarlanmış kapsamlı bir iş akışı sunmaktadır. Radyokimya laboratuvarında ⁶⁸Ga kullanılarak yapılan sentez süreci detaylandırılmıştır ve her radyoizleyici üretimi için sıkı kalite kontrol ve güvence protokolleri vurgulanmıştır. Konsantrasyon, molar aktivite, pH ve saflık gibi parametreler, insan çalışmaları için geçerli standartlarla uyumlu olarak titizlikle izlenir. Bu metodoloji, farelere hassas intravenöz enjeksiyonlar için aerodinamik şırınga hazırlığı ve özel olarak tasarlanmış bir 30G kanül sunar. Sıcaklık ve kalp atış hızı da dahil olmak üzere tarama sırasında hayvan sağlığının izlenmesi, prosedür boyunca sağlıklarını sağlar. PET ve SPECT taramaları için dozajlar, hayvanlara ve araştırmacılara radyasyon maruziyetini en aza indirerek veri toplamayı dengelemek için önceden belirlenmiştir. Benzer şekilde, BT taramaları, özellikle tedavi etkilerini değerlendiren uzun süreli çalışmalarla ilgili olarak, radyasyona maruz kalmayı sınırlamak için önceden programlanmış ayarlar kullanır. İş akışı, bu adımları optimize ederek prosedürleri standartlaştırmayı, değişkenliği azaltmayı ve küçük hayvan PET/SPECT/CT görüntülemenin kalitesini artırmayı amaçlar. Bu kaynak, moleküler görüntülemede klinik öncesi araştırmaların doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak isteyen araştırmacılar için değerli bilgiler sağlar ve sonuçta alanı ilerletir.

Giriş

Son derece önemli olan bir konu meme kanseri alanındaki araştırmalardır. Meme kanseri, kadınlarda görülen tüm^{kanserlerin yaklaşık} 1/3'ünü oluşturan, sık görülen bir kanser olmaya devam etmektedir. Tedavi, tümörün biyolojik ve histolojik özelliklerine ve hastalığın evresine göre uyarlanır. Tümör zaten metastaz yapmadığı sürece hayatta kalma şansı genellikle iyidir, bu durumda 5 yıllık sağkalım sadece %30 civarındadır1. Diğer jinekolojik kanserler de benzer bir kaderden muzdariptir, örneğin yumurtalık kanseri evre 1 tümörler için %95'> 5 yıllık sağkalım gösterirken, metastaz yapmış evre 4 tümörler için sadece %15'tir ^2,3.

Non-invaziv görüntüleme, özellikle pozitron emisyon tomografisi (PET), metabolizma, reseptör ekspresyonu ve terapötik yanıt gibi tümör moleküler yönlerine benzersiz bilgiler sunduğu için kanser araştırmalarını dönüştürmektedir ^4,5,6. Belirli metabolik alanların hem görselleştirilmesine hem de niceliklerinin belirlenmesine izin verir - sadece doğru bir şekilde teşhis etmekle kalmaz, aynı zamanda (yeni) tedavilerin etkisini çok kısa zaman noktalarında izlemeye de olanak tanır. Gerçekten de PET, 1-3 tedavi döngüsünden sonra yanıta karşı yanıtsızlığın değerlendirilmesine izin verir ve bunu klasik bilgisayarlı tomografi (BT) görüntülemede görülen morfolojik değişikliklere kıyasla daha iyi ve daha hızlı yapar⁷. PET'in non-invaziv doğası da boylamsal çalışmalara olanak tanır.

Herhangi bir hayvan modeli, yeni (radyoaktif) farmasötiklerin terapötik kapasitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için maksimum standardizasyon gerektirir, bu nedenle hem tümör modelinin oluşturulmasında hem de küçük hayvan PET görüntüleme/veri analizinde buna vurgu yapılmalıdır. Hayvanlarda en iyi tümör modeli (deri altı aşılama veya ortotopik implantasyon, fareler, insan veya sinjeneik tümörler, rutin klinik bakımın eşlik ettiği veya etmediği) hakkında tartışılabilir, ancak bu, bu yayının amacının ötesinde olacaktır. Kanser çalışmaları için tarafımızdan birkaç model kullanılmaktadır ve burada açıklanan model nispeten basit bir deri altı modelidir.

Radyokimyada kalite kontrol, hayvan güvenliği ve tedavi etkinliği için çok önemlidir. Bu sadece radyofarmasötikin kendisini değil, aynı zamanda ürün formülasyonunu da etkiler. Klinik uygulamalar için radyofarmasötiklerin üretimine ilişkin kapsamlı mevzuat ^8,9 (mevcut mevzuat ve kılavuzlara kapsamlı bir genel bakış için bkz. ¹⁰) ve klinik öncesi araştırmalar için radyofarmasötiklerin özelliklerine ilişkin çeşitli kılavuzlar (kapsamlı bir genel bakış için bkz. ¹¹) bulunmaktadır. Hem klinik hem de klinik öncesi uygulamalar için radyofarmasötikler üretiyoruz ve klinik uygulamalar için sentezlerde bulunan üst düzey kalite kontrolünden klinik öncesi uygulamalar için olanlara geçişi basitleştiriyoruz.

Araştırma odağımız, özellikle insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) pozitif kanserler olmak üzere yönlendirilmiş teranostikler üzerinedir. Bu nedenle, tedavi sırasında kanseri teşhis etmek ve izlemek için yeni radyofarmasötikler geliştiriyoruz. Başarılı tanısal radyofarmasötikler, farklı radyoizotoplar kullanılarak terapötik bileşikler olarak da değerlendirilmektedir. Bu radyofarmasötiklerin değerlendirilmesi ilk olarak hayvan modellerinde gerçekleştirilir ve umut verici klinik öncesi sonuçlardan sonra klinik çeviri için çabalanır. Bu makalede, moleküler görüntülemede klinik öncesi araştırmaların doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için fare intravenöz enjeksiyonu ve PET/BT taraması için standart uygulamanın yanı sıra kalite kontrol ve güvenceyi sağlamak için kullanılan protokolleri, tek bir radyofarmasötik ile örneklendirilmiş olarak sunacağız. Protokol üç farklı bölüme ayrılmıştır: radyokimya (izleyici sentezi ve kalite kontrol), hayvan modeli oluşturma (deri altı tümör modeli) ve görüntüleme.

Protokol

Araştırma protokolü, en yüksek hayvan refahı standartlarına bağlıdır ve RWTH Aachen Üniversite Hastanesi'nin Hayvan Bakım Yönergelerine sıkı sıkıya bağlıdır. Çalışmalarda yer alan tüm hayvanlara etik ve insancıl muamele edilmesini sağlamayı taahhüt ediyoruz ve prosedürler yerel hayvan etik komitesi tarafından gözden geçiriliyor ve onaylanıyor. Tüm hayvan deneyleri, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin yönetmelikle bağlantılı olarak Hayvanları Koruma Yasası'na uygunluk açısından bir Alman yetkili makamı (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu çalışma boyunca kullanılan ekipman, malzeme ve reaktiflerin tam listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir. ⁶⁸Ga'nın işlenmesinin mümkün olduğunda pipetle yapılması ve ütünün etiketleme verimini büyük ölçüde azaltabileceğinden kesinlikle herhangi bir metalden kaçınılması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Bu, radyokimya prosedürleri tamamlanana kadar iğnelerden kaçınılması gerektiği anlamına gelir.

1. Radyokimya

1. NM-02-DOTA-GA'nın ⁶⁸Ga ile radyoetiketlenmesi
   DİKKAT: Protokol, radyoaktif maddelerin işlenmesini ve manipüle edilmesini içerir. Araştırmacılar, radyoaktif maddelerin işlenmesi, ALARA (makul olarak ulaşılabilir olduğu kadar düşük) uygulamaları ile ilgili yerel mevzuata uymalı, kurşun koruma ile çalışmalı, doğrudan temas süresini en aza indirmeli ve radyasyona maruz kalmanın her adımında maksimum mesafeyi korumalıdır. Deneysel prosedürler radyoaktivite tespit cihazları ile izlenmelidir.
   1. ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Jeneratörü manuel veya otomatik olarak 10 mL 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 mL) içinde yükseltin. Elüatı kartuştan geçirerek ⁶⁸Ga'yı bir PS-H⁺ kartuşuna (boyut M - 0.8 mL) hapsedin. PS-H⁺ SPE kartuşunu toplam 1 mL 4 M NaCl ile kademeli ve yavaşça bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın.
   2. Elüatın ilk 0.3 mL'sini atın ve kalan 0.7 mL'yi başka bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
   3. Yeni bir mikrosantrifüj tüpü alın ve üreticinin protokolünde belirtildiği gibi NM-02-DOTA-GA'nın radyo-etiketlemesine devam edin.
      NOT: Nano gövde-şelatör konjugatı (NM-02-DOTA-GA) daha önce tedarikçinin protokolüne göre hazırlanmıştır. Konjugat, birkaç ay boyunca -80 ° C'de alikotlarda saklanabilir.
   4. 5 μL'ye kadar 3 M NH₄OAc kullanarak ürünün pH'ını yaklaşık 7'ye ayarlayın.
2. Kalite kontrol
   1. Doğru ayarda bir aktivite ölçer kullanarak mikrosantrifüj tüpündeki konsantre numunenin aktivitesini ölçün (izotop olarak ⁶⁸Gua; 1 mL şırınga, geometri için 0.1 mL). Radyokimyasal verim (çürümeye göre düzeltilmiş) en az @ olmalıdır.
   2. pH test şeridi (0-14 μL) üzerinde yeterli miktarda lekeleyerek pH'ı bir pH test şeridi (10-15) ile belirleyin.
   3. İnce tabaka kromatografisi (TLC)
      1. Silika emdirilmiş bir TLC şeridi üzerinde 1 μL radyo-etiketleme reaksiyon karışımını tespit edin. Alikotun yaklaşık 1 dakika kurumasını bekleyin. TLC'yi, kapalı bir TLC haznesinde yaklaşık 2-3 mm önceden doldurulmuş mobil faz olarak sitrik asit kullanarak çalıştırın. Sıvı şeridin üst kısmına ulaştığında TLC şeridini hazneden çıkarın.
      2. TLC şeridini bir radyo-TLC tarayıcıya yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre ölçün. Ürün orijinde görünmelidir (R_f < 0.2), serbest ⁶⁸Ga katyonları ise çözücü cephesi ile elüte olacaktır (R_f > 0.9).
      3. Radyo-kromatogramı kullanarak, eğrinin altındaki entegre alanı (AUC) R_f 0.0-0.2'den toplam AUC'ye (R_f 0.0-1.0) bölerek ve 100 ile çarparak reaksiyonun radyoetiketleme verimini hesaplayın.
   4. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)
      1. Tüm hatların taşması için HPLC'nin doğru çözücüyü kullanarak en az 10 dakika çalıştığından emin olun ve ölçüm ayarını yapın. Çözücü B olarak triflorasetik asit (1 mL) ve sitrat çözeltisi (20 mL) ile birleştirilmiş 50:50 asetonitril (çözücü A) ve %0.9 NaCl çözeltisi (980 mL) karışımının izokratik akışını kullanın. UV absorbansını 280 nm'de ölçün.
      2. Üründen 5 μL alın ve 15 μL% 0.9 NaCl ile seyreltin. Analitik radyo-HPLC'ye 15 μL karışım enjekte edin (5 μm SEC-s2000 154 şsütun; akış hızı: 2 mL / dak).
      3. Çözücü B olarak triflorasetik asit (1 mL) ve sitrat çözeltisi (20 mL) ile birleştirilmiş 50:50 asetonitril (çözücü A) ve %0.9 NaCl çözeltisi (980 mL) karışımının izokratik akışını kullanın. UV absorbansını 280 nm'de ölçün. UV ve gama kanalları arasında alıkonma sürelerinde küçük bir kayma vardır; bu, HPLC'nin tasarımından kaynaklanmaktadır (gama sinyali, UV dedektöründen sonra seri olarak kurulur).
      4. Gama kanalındaki tepe noktalarını entegre ederek radyokimyasal saflığı belirleyin. Ürün, daha önce radyoaktif işaretli olmayan nano gövdenin ölçülmesiyle belirlenen entegrasyon aralığında olmalıdır. Ek olarak, diğer tüm tepe noktalarını gama kanalına entegre edin ve bunları safsızlık olarak değerlendirin. Saflık% >95 olmalıdır.
   5. Endotoksin
      1. Seyreltmek için (sertifikalı) endotoksin içermeyen su kullanarak toplam hacmi 150 μL olan ürünün 1:20 oranında seyreltilmesini hazırlayın.
      2. Endotoksin test okuyucusuna gerekli tüm reaktiflerle ticari olarak önceden doldurulmuş tek kullanımlık bir endotoksin kartuşu yerleştirin ve her kartuş haznesine 25 μL seyreltilmiş ürün yükleyin.
      3. Oynat'a basın. PTS'nin dahili pozitif ve negatif kontrolleri vardır ve nihai rapora dahil edilecektir. Test yaklaşık 15 dakika sürer. Endotoksin içeriği V_max = 20 mL'de < 8.7 EU/mL ise ürün endotoksin içermeyen olarak kabul edilir.
   6. Retrospektif sterilite
      1. Enjeksiyondan ve kaliteli numunenin alınmasından sonra, radyofarmasötiki steril bir şişede buzdolabında 4 °C'de saklayın.
      2. ^12'ye göre bir sterilite testi yapmak için 10⁵ Bq veya 10 Bq/g muafiyet sınırı aşılmadıysa, numuneyi steriliteyi analiz etmek için sertifikalı bir enstitüye (kurum içi veya harici bir şirket) teslim edin.
3. Şırınga hazırlama (hayvan başına bir tane)
   1. Doğru ayarda bir aktivite ölçer kullanarak ürünün aktivitesini ölçün (izotop olarak ⁶⁸Ga; 1 mL şırınga, geometri için 0.1 mL).
   2. Bir mikrosantrifüj tüpünde 15 MBq (yaklaşık 25 μL) ürün alın ve hacmi% 0.9 NaCl ila 75 μL ile doldurun.
   3. Şırıngaya 50 μL ekleyin ve doğru ayarda bir aktivite ölçer kullanarak ölçün (izotop olarak ⁶⁸Ga; 1 mL şırınga, geometri için 0.1 mL). Şırınga 10 MBq ürün içermelidir.
      NOT: ⁶⁸Ga etiketli nano gövde NM-02 oluşturulur oluşturulmaz, ⁶⁸Ga ile çalışırken plastik pipet uçları artık gerekli değildir. Bundan sonra, protokol bir sıvının işlenmesinden bahsettiğinde, uygun bir şırınga (1 mL) ve iğne (27-30G) kullanın.

2. Hayvan modeli oluşturma

1. Hayvan barınağı
   1. Deri altı tümörleri geliştirmek için dişi immün yetmezliği olan Rj: ATHYM-Foxn1^nu/nu farelerini 6-8 haftalıkken (ticari bir tedarikçiden) kullanın. Varışta, tüm fareleri doğrudan hayvan odasında barındırın ve iklimlendirme için nakliyeden en az 1 hafta sonra verin.
   2. Hayvanları 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüsü altında barındırın ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın. Oda sıcaklığını ve bağıl nemi sırasıyla 20-25 °C ve E-e arasında tutun.
2. İmplantasyon için hücrelerin hazırlanması
   1. Hücre kültürünü 1 x 10⁶ SKOV-3 hücre ile başlatın ve bir T175 hücre kültürü şişesine FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile zenginleştirilmiş 25 mL önceden ısıtılmış DMEM/F12 ortamı ekleyin.
   2. Hücreleri bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO_2'de yetiştirin ve tam ortamı haftada en az 2 kez değiştirin.
   3. 1 hafta sonra veya hücre implantasyonundan en geç 1 gün önce, mikoplazma^13'ü test etmek için hücre kültürü şişesinden 20 μL ortam alın. Hücre enjeksiyonu için sadece mikoplazma negatif hücreler kullanın.
   4. Hücre enjeksiyonu gününde, tüm ortamı aspire edin ve 5 mL PBS'yi şişeye pipetleyin. Kalan ortamı yıkamak için şişeyi birkaç kez ileri geri döndürün.
   5. Şişeye 3 mL tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 4 dakika inkübe edin. Hücrelerin hücre kültürü şişesinden ayrılıp ayrılmadığını 40x büyütme ile mikroskop altında kontrol edin.
   6. Tripsin aktivitesini nötralize etmek için 7 mL ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   7. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri 150 x g'da 5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL ortam ekleyin.
   8. Bir mikrosantrifüj tüpünde 12 μL hücre süspansiyonu alın ve eşit miktarda tripan mavisi ekleyin. Hemositometre odasını 10 μL dikkatlice karıştırılmış hücre süspansiyonu ile doldurun.
   9. Tanımlanan alan içindeki lekelenmemiş, canlı hücreleri sayın ve hücre numarasını hesaplayın. Hücre konsantrasyonunu 5 x 10⁷ hücre/mL ortama ayarlayın ve hücre süspansiyonunu 1 mL bazal membran matrisi ile dikkatlice karıştırın.
   10. Her fare için 1 mL İnsülin şırıngasında P bazal membran matrisi ile 0.2 mL hücre ortamında 5 x 10⁶ hücre alın. Bazal membran matrisinin katılaşmasını önlemek için şırıngayı enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun.
       NOT: Bir farenin ağırlığı 20 g'dan azsa, karışımdan yalnızca 150 μL (15-20 g için) veya 100 μL (10-15 g için) enjekte edin. Deri altı uygulamalar için, GV-SOLAS tarafından önerilen maksimum 10 mL/kg vücut ağırlığı hacminin^14'ü aşmamasına dikkat edilir.
3. Aşılama ve takip
   1. Hücre süspansiyonunu, boynunu ve kuyruğunu bir elinizle sabitleyerek uyanık hayvanın yan tarafına deri altından enjekte edin. Genellikle sol yan tarafa yapılan enjeksiyonları tercih ediyoruz.
   2. Bazal membran matrisinin sertleşmesi için 10−15 s bekleyin, ardından iğneyi çıkarın.
   3. İki dikey tümör eksenini ölçmek için dijital bir kumpas kullanarak implantasyondan sonra günlük olarak tümör büyümesini izleyin.
   4. Bu ölçümleri kullanarak, aşağıdaki formülle hesaplanan tümör hacmini kullanarak tümör büyümesini değerlendirin:
      V_T = L × B² × π / 6
      burada V_T , mm cinsinden tümör hacmidir³, L , tümörün mm cinsinden uzunluğudur (yani, iki dik eksenden daha büyük olanı) ve B , tümörün mm cinsinden genişliğidir (yani, iki dik eksenden daha küçüktür¹⁵). Bu teknik, cildi de içerdiği için tümör hacmini abartma eğilimindedir.
   5. Tümör kütlesi, elektronik ölçekte ölçüldüğünde farenin ağırlığını etkiler. Tümör kütlesi için düzeltilmiş hayvanın ağırlığını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      m_fare-T = m_fare - 0,82 × V_T
      burada m_fare-T , g cinsinden tümör kütlesi hariç fare ağırlığıdır, m_fare , elektronik ölçeğe göre g cinsinden fare ağırlığıdır ve V_T , mm cinsinden hesaplanan tümör hacmidir³. 0.82 g /^mm3 sayısı, önceki hayvan deneylerinden izole edilen, tartılan ve verilen formül kullanılarak belirlenen hacimleri olan bir dizi tümörün ortalama değerinden kaynaklanır. Ortalama bir tümör yoğunluğunu temsil eder.
   6. Ek olarak, tümörün fareye kıyasla ne kadar büyük olduğunu belirleyin ve aşağıdaki formülü kullanarak tümör yükünü izleyin:
      Tümör yükü [%] = (0.82 × V_T) / m_fare × 100
      tümör yükünün yüzde olarak ifade edildiği durumlarda, 0.82 × V_T , g cinsinden tümör kütlesine karşılık gelir (yani, V_T, mm³ cinsinden hesaplanan tümör hacmi, ortalama tümör yoğunluğunun çarpı) ve m_fare , g cinsinden ölçeğe göre fare ağırlığıdır.
   7. Hayvanlar 200 mm'den^3'ten fazla bir tümör hacmine ulaştığında, deneye bağlı olarak onları non-invaziv PET/CT veya SPECT/CT için planlayın.

3. Görüntüleme

1. Şırınga hazırlama (ısmarlama sistem)
   NOT: Fare kuyruğu küçüktür; bu nedenle, 27G veya daha küçük bir kanülün kullanılması gerekir (daha büyük sayılar daha küçük iğnelere karşılık gelir). Dişi fareler söz konusu olduğunda, bolus enjeksiyonları için erişilebilir tek damar üç kuyruk damarıdır. Anatomik olarak, dorsal kuyruk damarı, iki yan damara kıyasla vertebral kolona daha yakındır; İyatrojenik kemik çizilmesini önlemek için bu damara enjeksiyon yapmayın. Deneyime dayanarak, 30G kanül kullanmak, daha küçük damarlara da erişilebileceğinden en iyi sonuçları sağlar. 30G kateterler satın alınamadığından, bu tipin araştırmacı tarafından dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.
   1. Planlanan uygulama yoluna bağlı olarak şırıngayı radyoaktif izleyici ile hazırlayın. İntravenöz enjeksiyonlar için, 25 g'lık bir fare için maksimum 5 mL / kg vücut ağırlığı hacminin uygulandığından emin olun; bu, maksimum 125 μL'lik bir enjekte edilen hacim anlamına gelir.
   2. 30G kateter hazırlamak için öncelikle herhangi bir 30G iğne kullanın ve metal iğne milini metal makasla veya plastikten bükerek çıkarın.
   3. Milin göbekten çıkarılan kısmına 0.3 mm çapında bir PE10 borusunu manuel olarak yerleştirin. Tüpün delinmesini önlemek için özen gösterilmelidir.
      NOT: Diğer plastik türleri de kullanılabilir; bununla birlikte, PE10 duvar sertliği ve esneklik arasında en iyi dengeyi sunar.
2. İntravenöz enjeksiyon
   NOT: İntravenöz enjeksiyonlar uyanık hayvanlarda da yapılabilir; Bununla birlikte, bu gerekli değilse, araştırma hayvanı üzerindeki yükü azaltmak için hayvanlara izofluran sedasyonu altında enjekte edilmelidir.
   1. 30G kateteri %0.9 NaCl tamponu veya istenen başka bir tamponla doldurun.
   2. Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve hayvan doğru refleksini kaybedene kadar sürekli olarak oksijen (veya tıbbi sınıf basınçlı hava) ve gaz halindeki izofluran karışımı ile doldurun. İndüksiyon için, 0,8 L / dak oksijen veya hava akışı ile% 3,5 -% 5 izofluran kullanın.
   3. Sedasyonlu fareyi hemen bir ısıtma matı (37-38 °C) üzerine ilk ventral pozisyona yerleştirirken, bir burun konisi aracılığıyla izofluran sedasyonunu sürdürün. Fareleri aşırı ısınma belirtileri açısından sık sık kontrol edin (ör. aşırı gerilme, hızlı nefes alma, ciltte kızarıklık). Anestezinin sürdürülmesi için, 0.8 L / dk'lık bir oksijen veya hava akışı ile% 1.8 -% 2.5 izofluran kullanın.
   4. Sedasyon sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik bir merhem sürün. Her iki yanal kuyruk damarını inceleyin ve enjeksiyon için en iyisini seçin. Damarın görünürlüğü ve çapı dikkate alınmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için, seçilen damar ısıtma matı ile temas edecek şekilde kuyruğu hafifçe döndürün ve damarın 1 dakika genişlemesine izin verin.
   5. Seçilen damar yukarı gelecek şekilde tüm fareyi yanal konuma getirin. Kuyruğun ucunu ve tabanını bantla sabitleyin.
   6. Baskın el ile 30G kateteri alın ve içinde bir kan yedeği oluşturmak için baskın olmayan elin işaret parmağını seçilen damarın üzerine nazikçe yerleştirin. Yedekleme bölgesinde, damar genişleyerek küçük bir kambur oluşturacaktır.
   7. Baskın el ile 30G kateteri damar üzerindeki kambura bakacak şekilde kuyruğa paralel olarak yerleştirin. Baskın eli ileri doğru hareket ettirin. Çoğu zaman, bu teknik doğrudan bir damar delinmesi sağlar.
   8. Damarın içine girdikten sonra, plastik tüpte kan reflüsü görünür hale gelir. Enjeksiyon sırasında iğnenin damar içinde hareket etmemesini sağlamak için plastik tüpü sabitleyin. Tüpün serbest ucuna, 30G'lik bir iğneye bağlı izleyici şırıngayı yerleştirin.
      NOT: İzleyicinin dinamik bir dağılımının değerlendirilmesi gerektiğinde, hayvan PET tarayıcı yatağına yerleştirildikten ve PET başlatıldıktan sonra aşağıdaki noktaların gerçekleştirilmesi gerekir.
   9. İzleyici şırınganın içeriğini en az 10 saniye boyunca yavaşça enjekte edin. 30G iğnesini hala 30G kateter sistemine bağlı tutarken, yalnızca izleyici şırıngayı çıkarın ve kateteri yıkamak için %0.9 NaCl tamponu (veya istenen başka bir tampon) içeren bir şırınga bağlayın. Enjeksiyon prosedürü sırasında solunumu sürekli olarak izleyin ve saniyede yaklaşık 1 nefesi korumak için izofluran konsantrasyonunu ayarlayın.
   10. 30G kateteri kuyruk damarından çıkarın ve kanamayı durdurmak için steril bir pamuklu kompres kullanın.
   11. Kalan aktiviteyi ölçmek için, 30G kateterini, tampon şırıngayı, boş izleyici şırıngasını ve pamuk kompresini ölçün, çünkü hepsi hayvana ulaşmayan az miktarda izleyici içerir.
3. PET/CT alımı
   NOT: ⁶⁸Ga etiketli nano gövde NM-02 için, tüm hayvanlar küçük bir hayvan PET / CT sistemi ile görüntülenir.
   1. PET edinimi
      1. Sakinleştirilmiş fareyi hayvan yatağına ventral pozisyonda yerleştirin ve PET tarayıcıya takın. İzofluran akışını PET üzerindeki burun konisine geçirin ve tarama sırasında hayvanın solunum hızı dakikada 75 ila 50 solunum arasında olacak şekilde 0,8 L / dk'da tıbbi havada% 1,5 -% 2,5 izofluranda tutun.
      2. Fareyi boynunun arkasına tıbbi bantla hayvan yatağına sabitleyin. Gerekirse, sedasyon sırasında kurumayı önlemek için farenin gözlerine bir kez daha oftalmik bir merhem sürün.
      3. Hayvan yatağındaki ısıtma yastığını yaklaşık 30 °C'ye eşdeğer olan yaklaşık% 80 güce kadar açın.
      4. Çekim süresini 45 dakika olarak ayarlayın ve taranacak İlgi Bölgesini seçin. Çalışma izotopu olarak ⁶⁸Ga'yı seçin ve taramayı başlatın. Enjekte edilen aktivite miktarını, enjeksiyon zamanını ve boş şırınganın ölçüm zamanını girin. Bir PET yatak pozisyonu 160 mm'dir ve bu, tüm vücut fare taraması için yeterince uzundur.
      5. İzleyicinin dinamik dağılımının değerlendirilmesi gerektiğinde, önce PET taramasını başlatın, alım için 30 saniye bekleyin ve ancak bundan sonra 3.2.9-3.2.10 adımlarına devam edin. Daha fazla kan kaybını önlemek için kateteri tampon şırınga takılı olarak farede bırakın. Artefaktları önlemek için CT alımından önce PET'in sonunda kateterin bağlantısı kesilebilir.
   2. CT alımı
      1. Hayvan yatağını PET tarayıcıdan ayırın ve hemen CT tarayıcıya bağlayın. Gerekirse, kanülü kuyruk damarından da çıkarın. Damar delinmesinden en az 30 dakika sonra, enjeksiyon bölgesi zaten pıhtılaşmıştır, bu nedenle daha fazla kanama meydana gelmez.
      2. İzofluran akışını CT tarayıcıdaki burun konisine geçirin.
      3. PET görüntüleme için taranacak aynı ilgi alanını seçin. Standart çekim protokolünü seçin: 440 μA, 50 kVp, 32 ms pozlama süresi ve 960 pozlama/360° ile spiral modda 1080° döndürme; BT taramasının süresi, tam vücut fare taraması için yaklaşık 7 dakikadır.
      4. Solunum hızını kontrol edin ve hayvan yatağındaki ısıtma yastığını açın. Taramalar sırasında solunumu sürekli olarak izleyin ve dakikada 75 ila 50 nefes arasında bir solunum hızını korumak için İzofluran konsantrasyonunu ayarlayın.

4. Görüntüleme sonrası hayvan bakımı

1. Taramaların sonunda, hayvanın uyanması için en az 15 dakikaya ihtiyacı vardır. Littermate saldırganlığını önlemek için, hayvanı yaklaşık 15 dakika boyunca tek başına veya kendi başına yürüyebilecek duruma gelene kadar orijinal barınak kafesine geri yerleştirene kadar kafesleyin. Bu süre zarfında, hipotermiyi önlemek için kızılötesi ışık kullanın.
2. Başlangıçta, hemodinamik bir şoku önlemek için hayvanı sol tarafına (güvenli pozisyon) yerleştirin. Oftalmik merhemin kalmasına izin verin, çünkü uyandıktan sonra hayvanın kendisi tarafından çıkarılacaktır.

5. PET / CT rekonstrüksiyonu

1. 192 × 192 × 384 matrisinde 511 keV'lik bir zirveden 0,4 mm'lik bir izometrik voksel boyutuna kadar 'lik ± bir enerji penceresi ile 3 boyutlu sıralı alt küme beklenti maksimizasyonu (yani, 30 yinelemeli OSEM-3D) kullanarak PET rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin. PET rekonstrüksiyonuna CT tabanlı düzeltmeler (yani zayıflama düzeltmesi, saçılma düzeltmesi, ölü zaman ve rastgele olaylar) uygulayın.
2. İzleyicinin dinamik dağılımının değerlendirilmesi gerekiyorsa, çok çerçeveli bir yeniden yapılandırma uygulayın. Örnek olarak, 45 dakikalık bir tarama için şu kareler kullanılabilir: 4 x 30 sn, 3 x 1 dk, 5 x 2 dk, 2 x 5 dk ve 2 x 10 dk.
3. 200 × 200 × 425 matrisinde 0,2 mm'lik izometrik voksel boyutuna yinelemeli bir yeniden yapılandırma algoritması (yani ISRA) yeniden yapılandırma işlemi kullanarak CT standart edinim protokollerini yeniden yapılandırın. Satıcı yazılımını kullanarak, aşağıdaki formülü kullanarak CT değerlerini Hounsfield birimlerine (HU) dönüştürün:
   
   burada_{μ w} suyun doğrusal zayıflama katsayısı, μ_a havanın doğrusal zayıflama katsayısı ve μ_t dokunun doğrusal zayıflama katsayısıdır.
4. PET ve BT görüntüleri, kapiller fantom taramasından oluşturulan matris kullanılarak rekonstrüksiyondan sonra otomatik olarak hizalandı. Yeniden oluşturulan tüm verileri arşivleyin ve gerektiğinde görüntü analiz yazılımı kullanarak bir veritabanı sunucusuna aktarın.

6. Görüntü işleme ve analizi

NOT: Birlikte kaydedilen PET/CT görüntüleri, her hibrit taramanın bir konu olarak kaydedildiği bir görüntü analiz yazılımının veritabanı sunucusunda niceleme için daha fazla kullanılır.

1. BT'ye göre tümörü tanımlayın ve bunu ilgilenilen bölge olarak seçin. Tümör tabanını BT'de manuel olarak maskeleyin.
2. Kullanıcıdan bağımsız segmentasyon elde etmek için, yeni oluşturulan tümör maskesini PET veya SPECT üzerinde eşikleyin. PET için minimum 1.0 standartlaştırılmış alım değeri (SUV) eşiği kullanın. SPECT için, kalpte veya terminal abdominal aortta ölçülen ortalama kan havuzu alımından daha yüksek bir minimum eşik kullanın.
3. Ortalamayı, maksimumu, en sıcak 10 vokselin ortalamasını (yani, sıcak ortalama 10) ve yeni oluşturulan ilgi hacimlerinin toplam alımını kaydedin.
4. Bu değerleri, istatistiksel analiz için daha fazla kullanılacak olan SUV ve hedef arka plan (TBR) değerleri oluşturmak için kullanın.

Tartışma

Radyosentez
Burada tarif edilen radyosentez, ⁶⁸Ga etiketli yeni bir bileşik için tipiktir - kısa sentez süresi, uygun pH'a vurgu yapılır ve mümkün olduğunda metallerden kaçınılır. Bunun için, bileşenlerin eklenme sırasını kesinlikle takip etmek önemlidir. Her durumda, ⁶⁸Ga çözeltinin pH değeri önce 3 M NH 4 OAc ile pH_4'eayarlanmalıdır; aksi takdirde, pH çok asidik ise nano cisim bozulabilir. ⁶⁸Ga-sentezinin genel kavramları^{daha önce 16} olarak tanımlanmıştır, bu yüzden burada ayrıntılara girmeyeceğiz. Otomatik sentez modülü, radyasyon dozunun azaltılması ile ilgili daha fazla optimizasyon gerektirir. Bu, burada açıklandığı gibi, tipik bir klinik öncesi deneyde keşif araştırmasının kapsamının ötesinde olan önemli bir çaba gerektirir. Ayrıca, otomatik bir sentezin, mevcut yöntemle (1 mL'< üretebileceğimiz küçük hacimleri vermesi olası değildir), bu da ⁶⁸Ga'lık daha yüksek konsantrasyonlara ve daha yüksek spesifik aktiviteye izin verir.

Kalite kontrol yine de çok detaylı bir şekilde yapılmalı ve kayıt altına alınmalıdır. Bu detayın bir istisnası pH'dır: Klinik sentezler için pH ölçümleri sıklıkla pH metreler kullanılarak çok doğru bir şekilde yapılırken, burada pH'ı basit bir pH şeridi ile ölçmek yeterlidir, çünkü intravenöz enjeksiyonlar için gereksinimler buna izin verir (6 ile 8 arasındaki herhangi bir pH'a izin verilir¹⁴). Bu basit teknik, ekipmanı radyoaktif malzeme ile kirletme maliyetini ve olasılığını azaltır.

Hayvan modelleri için formülasyonlar
İzleyicinin son formülasyonu, izleyicinin çok önemli bir yönüdür ve klinik öncesi araştırmalarda genellikle sadece zayıf bir şekilde tanımlanan bir özelliktir. Radyofarmasötikler de dahil olmak üzere insan denemeleri için farmasötiklerin formülasyonu için klinik öncesi açık mevzuat olmasına rağmen, çözücüleri veya formülasyonları özel olarak tartışmayan yalnızca kılavuzlar^17,18 vardır. Bu kılavuzlar genellikle (hayvan) etik komiteleri (Almanya'da: LANUV¹⁹) tarafından onaylanmak üzere yasal olarak gerekli protokoller hazırlanırken veya değerlendirilirken kullanılır, ancak bu belgeler formülasyonun önemini yeterince vurgulamamaktadır. Kötü formülasyonların yanlış (negatif) sonuçlara yol açması muhtemeldir, ancak onkoloji alanında da hala var olan kalıcı yayın yanlılığı göz önüne alındığında böyle bir iddianın doğrulanması zordur²⁰.

ARRIVE yönergelerine ek olarak, insanlar için uygun formülasyonların genellikle kemirgenler için de uygun olduğunu varsayarak, insan uygulamaları için tasarlanmış mevzuatı mümkün olduğunca takip etmeyi tercih ettik. En büyük fark, konunun boyutu ve dolayısıyla güvenli bir şekilde enjekte edilebilecek hacim miktarıdır. Bu amaçla, büyük bileşikleri saflaştırmak için etkili oldukları kanıtlandığından, moleküler ağırlık kesme (MWCO) filtreleri kullanarak mümkün olduğunda bileşiği saflaştırmayı tercih ettik²¹. Tipik bir 68Ga etiketli izleyicinin nihayet tercih edilen bir çözelti içinde ve fareler için uygun küçük bir hacimde (tipik maksimum intravenöz enjeksiyon 100 - 150 μL) çözülmesine izin verirler.

Almanya'da GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, Türkçe: Laboratuvar Hayvanları Derneği), hayvanların korunması ve araştırılması arasında bir aracı olarak hizmet vermekte ve hem insanlara hem de hayvanlara fayda sağlamaktadır. Bu nedenle, bu dernek, hayvan bakımını ulusal düzeyde standardize etmek için, özellikle onkoloji ve anestezi alanlarında, hayvan araştırmalarının birçok yönü için öneriler oluşturmuştur¹⁴. Bundan böyle, çoğu yetkili makam ve ulusal etik komiteler, hayvan protokollerinin bu tavsiyelere uymasını zorunlu kılmaktadır. GV-SOLAS, çoğu uygulama yolunun maksimum hacimleri için önerilere sahiptir. İntravenöz enjeksiyon için maksimum 5 mL / kg vücut ağırlığı önerilir; 25 g'lık bir fare için bu 150 μL'ye eşittir. Bu nedenle, tüm radyoaktif izleyici üretimleri, hayvan başına maksimum 150 μL enjeksiyon hacmine ayarlanmıştır. İntravenöz olarak enjekte edilirken bu eşiğin aşılması, hipervoleminin neden olduğu akut kalp yetmezliği riskini artırır. Bu eşiği aşan tekrarlanan intravenöz enjeksiyonlar, pulmoner fibroz riskinin artmasına neden olur, çünkü her enjeksiyon, akış hızına bağlı olarak küçük pulmoner ödemlere neden olur. Bu yazıda sunulan fare IV'ün bir insan eşdeğeri, 75 kg'lık bir insan için toplam 375 mL'lik bir hacmi bolusta (10 saniye içinde) intravenöz olarak enjekte etmek olacaktır. Standart klinik bakımda, 1 saat boyunca 500 mL% 0.9 NaCl çözeltisi uygulanır; bu, herhangi bir komplikasyondan kaçınmak için 375 mL'nin 45 dakika boyunca uygulanacağı anlamına gelir.

GV-SOLAS, tümör yükünün %5'ten fazla olmamasını önerir; Hayvanın tedavi altında olması durumunda yük %10'a kadar ^{uzatılabilir22}. Tedavi edilen ve tedavi edilmeyen gruplar arasındaki bu fark, özellikle sağkalım durumunda, tedavi edilen tümör fareleri, afferent kontrol grubundan daha yüksek bir tümör yükü elde edebileceğinden, bir araştırma yanlılığı yaratma potansiyeline sahiptir. Bu gibi durumlardan kaçınmak için, tedavi hayvanları için% 5'lik tümör yükü de sabitlenmelidir; Bununla birlikte, bu, insancıl bir son nokta olarak adlandırılan bir son noktaya ulaşmadan önce araştırma hayvanlarını öldürmek için etik ikilemlere yol açabilir veya (tercihen) afferent kontrol grupları söz konusu olduğunda% 10'a kadar olan artışın, önyargıyı önlemek için etik olarak temellendirildiğini iddia edebilir.

Tümör yükünün her gün non-invaziv bir şekilde hesaplanması gerektiğinden, günlük hesaplanan tümör hacmini tümör ağırlığına dönüştürmek için bir düzeltme faktörü (yani 0.82) uyguluyoruz. Bu faktörü, hayvanlar protokole göre öldürülmeden önce dijital bir kumpas kullanarak tümör çaplarını ve daha sonra bir ölçek kullanarak gerçek tümör ağırlığını ölçerek hesapladık. Bu düzeltme faktörü, tümör dokusunun yoğunluğundan farklıdır, çünkü ölçülen tümör hacmi aynı zamanda cildi de içerir. Bu nedenle, ölçülen tümör hacmi gerçek tümör hacminden daha büyük olduğu için bu faktör muhtemelen 1.0'ın <. Tarttığımız tümörler nispeten büyük olduğu için, değerlendirme deneyin son gününde yapıldığı için, bu faktör gerçekten de küçük tümörlerin ağırlığını abartıyor. Sadece tümör yükünün değerlendirilmesinde kullanılmalıdır.

GV-SOLAS önerilerinin bir başka yönü, fareler için 15 mm'lik sabit bir tümör çapının insancıl bir son nokta¹⁷ olarak ayarlanmasıdır. Sıklıkla, tümör hücrelerini içeren solüsyondan sonra hava veya tıkaç enjekte edilmezse, tümör deri altı enjeksiyonu ile yapılan iğne kanalı boyunca hızlı büyüme eğilimindedir. Bu nedenle, 15 mm'ye belirli uygulama yollarına daha hızlı ulaşılır. Deneyim açısından, bazı tümörler eliptik bir şekilde büyüdüğünden, farklı uygulama yolları arasında tarafsız karşılaştırmalar yapmak için yukarıda belirtilen tümör hacmi formülünü uyarladık ve kullandık.

Kullandığımız hayvan modelleri, ARRIVE¹⁷ ve PREPARE¹⁸ yönergelerine uygun olarak tasarlanmıştır ve kolay bir deneysel üreme sağlar. Tümör büyüme hızı farklı fareler arasında değiştiğinden, model belirli bir dereceye kadar varyasyona tabidir, bu da standardizasyonu ve yorumlamayı daha zor hale getirir. Bununla birlikte, bu varyasyonlar kanser hastalarında mevcut olan intra- ve intertümöral heterojenliği yansıtmaktadır²³.

Bu protokolün sınırlamaları yoktur. Hayvanlar enjeksiyon sırasında, özellikle PET/CT taraması sırasında sakinleştirilmelidir. Sedasyon, özellikle izofluran ile kan akışını etkiler ve hayvanlar hipotermik hale gelebilir, bu da bir ısıtma matının kullanılmasını ve sedasyonun derinliğinin izlenmesini gerektirir. Bu sorun, uyanık hayvanları tarayarak önlenebilir; Ancak bu, genellikle mevcut olmayan özel şirket içi yazılım ve uzmanlık gerektirir.

Diğer bir sınırlama radyasyon dozudur. Hayvanlar tarafından alınan doz tek bir tarama için ihmal edilebilir olsa da, birden fazla tarama yapmak (yani, özellikle 10'dan fazla ise), potansiyel olarak tümör büyümesini etkileyen önemli bir kümülatif doz ile sonuçlanabilir. Tümör büyümesi bir okuma parametresi olduğunda, karşılaştırılabilir gruplar sağlamak için tüm hayvanların aynı sayıda tarama ve doz alması önemlidir ve bu da tüm projenin iş yükünü artırır. PET/CT sistemi yerine PET/MRI sistemi kullanmak radyasyona maruz kalmayı azaltabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha uzun tarama süreleri, ek maliyetler ve anatomik bilgi elde etmek için farklı bir yöntem içerir.

Almanya'daki GV-SOLAS gibi sosyal yardım kuruluşlarının tavsiyelerine bağlı kalarak ve ARRIVE ve PREPARE gibi yerleşik yönergeleri izleyerek, hayvan modellerini standartlaştırmaya ve deneysel protokollerdeki değişkenliği en aza indirmeye çalışıyoruz. Bu çabalar, klinik öncesi çalışmaların güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için çok önemlidir ve sonuçta umut verici radyofarmasötiklerin tezgahtan yatak başına çevrilmesini kolaylaştırır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ekipman< / güçlü >
Aktivite ölçer ISOMED 2010	Nuviatech Healthcare	-
Santrifüj MIKRO 185	Andreas Hettich GmbH & Co. KG	1203
Endotoksin testi Endosafe nexgen-PTS	Charles	River-Isıtma
bloğu NANOCOLOR VARIO C2	Macherey-Nagel	919350
HPLC sistemi, radyo dedektörü	Knauer & Raytest-Görüntü
analiz yazılımı Pmod 4.4	PMOD Technologies	LLC-Küçük
hayvan PET/CT sistemi β-CUBE ve X-CUBE	Molecubes	NV-TLC
MiniGITA*	Elysia-Raytest	-
Malzemeler
0,3 mm çap PE10 tüp	balıkçı bilimsel	22-204008
30G iğne	B|Braun	4656300
Santrifüj filtre; 10 kDa MWCO, 0,5 mL	Milipore UFC501008
Kromatografi kağıt şeridi iTLC-SG	Agilent Technologies	SGI0001
Endotoksin Kartuşu, 0,05 EU/ml hassasiyet	Charles River	PTS-2005
HPLC Kolonu Biosep SEC-s2000	Phenomenex-Mikrosantrifüj
tüpü (1,5 mL)	Eppendorf	0030125150
pH şeridi 0,0 - 6,0	Merck KGaA	109531
pH şeridi 0-14	Merck KGaA	109535
PS-H+ SPE kartuşu	Macherey Nagel GmbH &; Co. KG	731861
Steril flakon 10 mL	ALK Yaşam Bilimleri Çözümleri	SEV100
Reaktifler< / strong>
68< sup>Ge/68< / sup>Ga-Jeneratör	NRF-iThembaLABS-Amonyumasetat
	Merck KGaA	101116
Sitrik asit	Merck KGaA
Hidroklorik asit	Merck KGaA	320331
NaCl	Merck KGaA	S9888
Nanobody NM-02	Radiopharm Teranostikler-P-SCN-Bz-DOTA-GA
	CheMatech	C115
Triflorasetik asit	Merck KGaA	T6508
Ultra saf su	Merck KGaA