Araştırma makalesi

Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi

DOI:

10.3791/67067

⸱

15 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler biyoloji laboratuvarı ders öğrencileri için ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimi (CURE) formatında uyarlanabilir bir Gibson Assembly moleküler klonlama modülü kullanılmıştır. Öğrenci öğrenme çıktılarının değerlendirilmesi, CURE'nin tamamlanmasından sonra moleküler klonlamada daha iyi bir anlayış ve güven gösterdi ve doğal ürün biyosentez araştırmaları için yeni plazmitler klonlandı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler biyoloji tekniklerinin sürekli ilerlemesi, moleküler biyoloji müfredatının, öğrencileri modern yeterliliklerle işgücüne girmeye etkili bir şekilde hazırlamak için düzenli olarak iyileştirilmesini gerektirir. Özellikle, son derece özelleştirilebilir ve uyarlanabilir bir moleküler klonlama tekniği olan Gibson Assembly'nin ortaya çıkışı, çok sayıda araştırma ortamında moleküler klonlama manzarasını ilerletmiştir. Bu nedenle, California Polytechnic State University, San Luis Obispo'daki bir moleküler biyoloji laboratuvarı dersinde kullanılmak üzere bir Gibson Assembly klonlama modülü oluşturduk ve modülden öğrenci öğrenme çıktılarını değerlendirdik. Kursun üç tekrarından fazla öğrenci, doğal ürün biyosentezindeki araştırma projelerini desteklemek için üç benzersiz plazmit kütüphanesinin klonlanmasını içeren deney tabanlı bağımsız bir projeye katıldılar. Öğrencilere, moleküler klonlama konusundaki anlayışlarını ve moleküler biyoloji terimleri ve tekniklerine olan güvenlerini değerlendirmek için ön ve son anketler verildi. Öğrencilerin yanıtları, hem moleküler klonlama kavramlarını öğrenmede hem de moleküler klonlama terimleri ve tekniklerine kendi bildirdikleri güvende önemli bir artış göstermiştir. Bu modül çerçevesi, çeşitli uygulamalar için Gibson Assembly'yi öğretmek üzere genelleştirilebilir ve eğitmenlere araştırma projelerini ilerletirken uyarlanabilir ve ortaya çıkan bir klonlama teknolojisini öğretmek için bir araç seti sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lisans öğrencilerini temel moleküler biyoloji kavramları ve laboratuvar teknikleri konusunda eğitmek, bilimsel ve mesleki gelişimleri için çok önemlidir, çünkü bu metodolojiler akademi ve endüstri dahil olmak üzere çeşitli araştırma ortamlarında yaygındır. Bu nedenle, California Polytechnic State University, San Luis Obispo'daki (Cal Poly) biyoloji (moleküler ve hücresel biyoloji konsantrasyonu) ve biyokimya ana dallarındaki öğrencilerin, bu konuları öğrenmek ve uygulamak için bir üst bölüm moleküler biyoloji laboratuvarı dersi almaları gerekmektedir (CHEM/BIO 475). Bu ders için daha önce öğrencilerin bir maya tamamlayıcı DNA (cDNA) şablonu1'den hazırlanan aktin içeren bir plazmiti bir araya getirmek için topoizomeraz bazlı (TOPO) klonlama gerçekleştirdiği bir temel müfredat geliştirilmiştir. Öğrenciler, özgün araştırma hipotezlerini taklit eden sorulara dayalı deneyler tasarlayarak laboratuvar uygulamalarına ve sorgulamaya dayalı öğrenmeye aşinalıklarını artırırlar. Moleküler biyoloji alanındaki sürekli ilerleme, ilgili müfredatın, modern yeterliliklere sahip öğrencileri işgücüne hazırlamak için uyarlanmasını gerektirir. Özellikle, Gibson Assembly'nin kullanımı bilim camiasında daha baskın hale geldi; Yöntem başlangıçta yapay kromozomları2 sentezlemek için kurulmuş olsa da, bu raporun yazıldığı sırada 5.000'den fazla yayın Gibson ve arkadaşlarının orijinal çalışmasına atıfta bulunmuştur. Gibson Assembly, geleneksel klonlama metodolojilerine kıyasla benzersizdir: son derece özelleştirilebilir ve bağlantıları üretmek için kısıtlama bölgelerine ihtiyaç duymadan birden fazla doğrusal DNA parçasını kolayca bağlayabilir. Böylece, CHEM / BIO 475 müfredatını modern moleküler klonlama tekniklerini içerecek ve sorgulamaya dayalı ders modelini geliştirecek şekilde yenileme fırsatı gördük.

Öğrenci araştırma deneyimlerinin artan kavramsal anlayışa, beceri geliştirmeye ve fen bilimlerinde kalıcılığa katkıda bulunduğu tespit edilmiştir3, ancak tüm lisans öğrencilerinin doğrudan bir araştırma laboratuvarına katılma fırsatı yoktur. Araştırma laboratuvarlarında sınırlı öğrenci kapasitesinin zorluğunu ele almak için, sınıfta özgün araştırmalar yoluyla bilime erişilebilirliği artırmak için ders temelli lisans araştırma deneyimleri (CURE'ler) geliştirilmiş ve kullanılmıştır. CURE'ler uygulamalarında farklılık gösterse de, bilimsel araştırmanın beş ilkesini ele alan ortak uygulamalar oluşturulmuştur. İyi tasarlanmış bir CURE'de, öğrenciler 1) bilimsel uygulamaları kullanacak, 2) bir araştırma projesinde işbirliği yapacak, 3) yeni keşifler yapmaya çalışacak, 4) sınıf dışında ilgili çalışmalara katkıda bulunacak ve 5) deneysel başarısızlık durumunda hipotezleri ve yöntemleri yeniden değerlendirecek ve gözden geçirecektir4. Bir laboratuvardaki geleneksel öğrenci araştırma deneyimlerine benzer şekilde, CURE'lerin öğrencilerin bilime, bilimsel becerilere, proje sahipliğine ve bilim, teknoloji, mühendislik ve matematikte (STEM) kalıcılığa olan güvenini güçlendirdiği gösterilmiştir5. Moleküler klonlamayı içeren CURE'ler daha önce 6,7,8,9,10,11,12,13 bildirilmiş olsa da, Gibson Assembly'nin otantik araştırma plazmitlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmak için uyarlanabilirliğini vurgulayan herhangi bir şeyin farkında değiliz.

Burada, California Polytechnic State University, San Luis Obispo'daki mevcut sorgulamaya dayalı CHEM / BIO 475 müfredatının iki büyük iyileştirme ile genişletildiğini bildiriyoruz: Gibson Assembly'yi kullanarak uygulamalı deneyim ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1708919 ve NSF-2300890) tarafından finanse edilen araştırma projeleri için orijinal plazmit yapıları sağlayan bir CURE'ye öğrenci katılımı. Bu müfredatın üç uygulamasından fazla öğrenci, Actinomycetota tarafından üretilen biyoaktif moleküllerin doğal ürün biyosentezine odaklanan iki farklı araştırma projesine katkıda bulunmuşlardır. Doğal ürünler genellikle antibiyotik, antifungal ve/veya antikanser aktivitelere sahip farmakoforlar içerir ve bu küçük moleküllere ilaç keşif çabalarında önem ve klinik alaka potansiyeli verir14. Bu araştırma, bakteriyel biyosentetik enzimlerin hem işlevinin hem de mühendislik potansiyelinin araştırılmasını sağlamak için plazmit kütüphanelerinin oluşturulmasını gerektirir. Bu CURE'de öğrenciler, bu araştırma projeleriyle ilgili benzersiz plazmit kütüphanelerini klonlamak için Gibson Assembly deneyleri tasarladılar ve gerçekleştirdiler (Şekil 1). Ek olarak, modülün formatı ve tasarımı ayırt edicidir, çünkü diğer araştırma projeleri için ilgilenilen herhangi bir plazmidi oluşturmak için kolayca uyarlanabilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Gibson Assembly'nin araştırma laboratuvarımızdaki rolüne genel bakış. Actinomycetota, biyosentetik enzimleri kodlayan gen kümelerini kullanarak klinik olarak anlamlı biyoaktivitelere sahip küçük moleküllü doğal ürünler üretir. Araştırmamızda, biyosentetik bir gen içeren plazmitler, kodlanmış enzimin işlevinin aşağı akış araştırmaları için Gibson Assembly aracılığıyla birleştirilir. Biorender.com'dan bilim ikonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Laboratuvara genel bakış

Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, moleküler ve hücresel biyoloji konsantrasyonuna sahip biyokimya ana dalları ve biyoloji ana dalları için gerekli olan bir üst bölüm dersidir. Ön koşulları karşılayan diğer öğrenciler, dersi üst bölüm seçmeli dersi olarak alabilirler. Kurs, Kimya ve Biyokimya Bölümü ile Cal Poly'deki Biyoloji Bölümü arasında birlikte listelenmiştir. Her iki bölümden öğretim üyeleri her dönem sırayla dersi verir (iki çeyrek Biyoloji, dörtte bir Kimya ve Biyokimya).

Sınıf, haftada iki kez 170 dakikalık periyotlarla ve haftada bir kez 50 dakikalık bir ders için laboratuvarda toplanır. Laboratuvar bölümleri en fazla 16 öğrenci içerir ve her üç ayda bir 2-3 laboratuvar bölümü sunulur. Kurs 10 hafta sürer ve final sınavı 10. haftadaki son toplantıda yapılır. Ders süresi, laboratuvarda yürütülen birçok deneysel tekniğin arkasındaki teorinin yanı sıra laboratuvarda ele alınmayan moleküler biyolojideki güncel konuları tartışmak için harcanır. Laboratuvarın çekirdek müfredatı, yaklaşık 7 hafta süren (13-14 laboratuvar toplantısı) maya1'den aktin geninin klonlanması sürecini kapsar. Teknikler arasında mikropipetleme, maya RNA izolasyonu, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak bir maya geninin amplifiye edilmesi, topo klonlama, mavi-beyaz tarama, plazmit izolasyonu ve restriksiyon sindirimi ve PCR ile ekin doğrulanması, klonların in silico analizi ve DNA dizi analizi yer alır. Kursun son 3 haftasının müfredatı öğretim elemanının takdirine bağlıdır, ancak öğrencilerin tanımlanmamış sonuçları olan "bağımsız bir projeyi" tamamlamalarını içerir.

Deneye genel bakış

Araştırma grubumuzun odak noktalarından biri Actinomycetota'daki biyosentetik yollardır. Bağımsız projeyi tasarlarken, öğrencilerin doğal ürün biyosentezini araştıran araştırma projelerimizde kullanılmak üzere Gibson Assembly aracılığıyla plazmitler oluşturmalarını öngördük. Burada değerlendirilen kurs modülünün yinelemeleri, biyosentetik yolların manipülasyonuna izin veren plazmitlere özgü olsa da, Gibson Assembly iş akışı diğer moleküler klonlama projeleri için büyük ölçüde uyarlanabilir (Şekil 2). İş akışı, iki ders dönemi ve altı laboratuvar dönemi (toplam 3 hafta) boyunca tamamlanan üç farklı deneye (A, B ve C) bölündü ( Bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Deneylerden önce, öğrenci hazırlığını desteklemek ve öğrenci anlayışını değerlendirmek için çalışma sayfaları yapıldı (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5). İş akışı, eğitmenin ihtiyaçlarına ve ilgi alanlarına göre esnek bir biçimde sunulur.

figure-introduction-2
Şekil 2: Gibson Assembly modülü iş akışı. 1. Gün ve 4. Gün, öğrencilerin in silico dizi analizi ve deney tasarımını tamamladıkları ders dönemleridir. 2-3 ve 5-8. günler, Gibson Assembly aracılığıyla yeni plazmitleri klonlama adımlarının yürütüldüğü, ardından izolasyon ve taramanın yapıldığı laboratuvar toplantılarıdır. Resimli akış şeması, öğrencilerin gerçekleştirdiği üç deneye (A, B ve C) göre gruplandırılmıştır. Daha ayrıntılı yönergeler ve protokoller, sırasıyla Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2 olarak sağlanan Eğitmen ve Öğrenci Kılavuzlarında bulunabilir. Biorender.com'dan bilim ikonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gibson Assembly bağımsız proje modülü ilk olarak 2019 bahar çeyreğinde CHEM/BIO 475'te pilot olarak uygulandı. 2020 ve 2021'de kurs, SARS-CoV-2 salgını nedeniyle çevrimiçi olarak verildi. 2022 ve 2023 Baharında yüz yüze eğitim yeniden başladığında, kurstaki öğrenciler, orijinal, araştırmayla ilgili plazmitlerin klonlanacağı bağımsız bir Gibson Assembly projesinin öğrenme sonuçlarını değerlendiren bir çalışmaya katılmaya davet edildi. 2019'da öğrenciler, Micromonospora echinospora ATCC 15837 genomundan pKC1132'ye klonlanan gen kasetlerinden oluşan bir plazmit kütüphanesi oluşturdular (Şekil 3). Bu plazmit kütüphanesi, araştırma laboratuvarımızda, doğal ürün TLN-0522015 için varsayılan bir biyosentetik gen kümesinde ilgilenilen genleri etkisiz hale getirmek için kullanılmaktadır. Gen inaktivasyon çalışmalarımızı tamamlamak için, 2022'deki öğrenciler, varsayılan TLN-05220 gen kümesinden küçük bir gen kütüphanesini pUC19'a (Şekil3) klonladılar; Araştırma grubumuz bu plazmitleri, protein aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için genleri pET28b dahil olmak üzere ekspresyon vektörlerine alt klonlamak için kullanmıştır. 2023 kohortundaki öğrenciler, epoksomisin sentetaz16 ile ilgili bir biyosentetik mühendislik projesi üzerinde devam eden çalışmalara katkıda bulundular. 3-4 kişilik takımlar halinde, öğrenciler ribozomal olmayan peptit sentetaz17 modüllerinin mühendislik alanlarını, araştırma laboratuvarımızda bu enzimlerin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını optimize etmek için çeşitli protein ekspresyon vektörlerine klonladılar (Şekil 3). Yedeklilik, her kohort için klonlama planına dahil edildi. Örneğin, 2019 kohortu 44 öğrenci içeriyordu ve klonlama için sınıfa 15 plazmit atandı. Böylece, her bir plazmitin klonlanması iki veya üç kez denendi.

figure-introduction-3
Şekil 3: 2019, 2022 ve 2023 bağımsız proje yinelemeleri sırasında klonlanan plazmitlerin ve öğrenci katılımcıların özeti. Gibson Assembly projesi üç kez konuşlandırıldı. Her sunumda, öğrenci katılımcılar, biyosentetik yolları araştıran araştırma projelerinde kullanılmak üzere farklı bir plazmit kütüphanesi klonladılar. 2019 ve 2022 yıllarındaki projeler, iki parçalı (bir gen, kaset veya gen ve bir vektör) Gibson Assembly reaksiyonları ile doğal ürün TLN-0522015 üzerinde devam eden çalışmalarımızı destekledi. 2023 projesi, epoksomisin biyosentezi 16'da yer alan ribozomal olmayan bir peptit sentetaz (NRPS) enziminin 1. ve 2. modülleri arasında alan takasını içeriyordu. Taranmış parçalar, değiştirilen alanın iki farklı mutantını temsil eder ve düz renkler, değiştirilmeyen alanları temsil eder. Toplamda, sekiz farklı gen fragmanı (modül 1 için dört ve modül 2 için dördü) Gibson Assembly için uyumlu çıkıntılarla üretildi. Her modül için, sekiz mühendislik NRPS plazmidi üretme potansiyeli için, üç gen fragmanının iki farklı kombinasyonu, iki farklı vektörden biriyle (pBAD33 ve pET28, montaj başına toplam dört fragman) birleştirildi. Biorender.com'dan bilim ikonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Değerlendirmeye genel bakış

Gibson Assembly bağımsız projesinin başlamasından en az 1 hafta önce, 2022 ve 2023 kohortlarındaki öğrenciler, Cal Poly18'deki biyokimya laboratuvarı dersinde yapılan bir ankette gerçekleştirilen bir çalışmaya benzer şekilde tasarlanmış bir öğrenme çıktısı araştırmasına katılmaya davet edildi. Öğrenci katılımcılar, bağımsız projenin başlamasından önce laboratuvar toplantısında çoktan seçmeli bir ön anket ve son laboratuvar toplantısı sırasında (yani Gibson Assembly modülünü tamamladıktan sonra) çoktan seçmeli bir anket sonrası doldurdular. Anket öncesi ve sonrası 28 aynı sorudan oluşmuş ve anket sonrası iki ek soru (toplam 30) kullanılmıştır. Öğrencilerin moleküler klonlamada yer alan enzimler ve mekanizmalar hakkındaki bilgilerini değerlendirmek için on içerik sorusu yazılmıştır (örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu [PCR], Gibson Assembly, dönüşüm, mavi-beyaz tarama). Aşağıdaki yedi soru, öğrencilerden moleküler klonlama terimlerine (örneğin, DNA polimeraz, eksonükleaz, ligaz) aşinalıklarını kendi kendilerine değerlendirmelerini istedi. Sonraki 10 soru, öğrencilerin moleküler klonlama tekniklerini (örneğin, DNA dizi analizi, kısıtlama sindirim reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi) gerçekleştirme yeteneklerini kendi kendilerine değerlendirmelerine izin verdi. Öğrenciler ayrıca, moleküler klonlama teknikleri hakkındaki bilgilerine dayanarak moleküler biyoloji alanında kariyer yapma konusunda rahat olup olmayacaklarını da bildirdiler. Öğrencilerin kursta öğrenmeye olan bağlılıklarını ve kursun değerli bir öğrenme deneyimi olup olmadığını kendi kendilerine değerlendirmeleri için son ankete iki ek soru dahil edildi (Ek Dosya 6 ve Ek Dosya 7). 2022 ve 2023 öğrenci anket öncesi ve sonrası yanıtlarından elde edilen tüm veriler analiz için birleştirildi ve Ek Tablo S1'de mevcut.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan katılımcıları içeren çalışmalar, Cal Poly'deki Araştırma Kurumsal İnceleme Kurulu'ndaki (2022-113-CP (IRB)) insan denekler tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.

Aşağıdaki protokol, eğitmen hazırlığını (adım 1.1–1.3), doğrusal fragmanları elde etmek için PCR (adım 2.1–2.7), Gibson montajı, dönüşümü ve klon seçimi (adım 3.1–3.5), plazmit izolasyonu ve taraması (adım 4.1–4.4) ve öğrenme kazanımlarının değerlendirilmesini (5.1–5.2). Eğitmen hazırlığı, primer tasarımının temsili bir örneğini ve istenen bir plazmid haritasının in silico olarak hazırlanmasını tanımlar. Protokolün tüm bölümleri, istenen diğer plazmitler için uyarlanabilir. Her öğrenci deneyi iki adet 3 saatlik laboratuvar toplantısına bölünmüştür.

1. Eğitmen hazırlığı

  1. Benchling Montaj Sihirbazı kullanılarak Gibson Montaj astarı tasarımı
    1. Genomik DNA, plazmit ve sentetik DNA gibi gen ek(ler)i için DNA şablon kaynağını belirleyin.
      NOT: Karmaşık genomik DNA şablonlarından amplifiye edilecek genler için, öncelikle Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST)21 kullanılarak, İlgilenilen gen(ler) için spesifik olan genomik DNA şablonu içindeki primerler için benzersiz bağlanma bölgelerinin belirlenmesi tavsiye edilir, Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi. Plazmitler veya sentetik DNA gibi basit şablonlar için bir sonraki adıma geçin.
    2. Gen ek(ler)inin ve vektörün DNA dizilerini alın (örneğin, Ek Dosya 8'de GenBank dosyaları olarak sağlanan poliketid hidroksilaz gen dizisine ve pUC19 dizisine bakın). İstenen ekleme dizilerini ve istenen vektör dizisini, her biri yeni bir DNA dizisi dosyası olarak Benchling'e aktarın. Gibson Assembly reaksiyonuna dahil edilmek üzere içe aktarılan her diziyi açın.
      NOT: DNA dizi dosyaları, GenBank ve FAXA dahil olmak üzere çeşitli formatlarda içe aktarılabilir. Ayrıca, bir diziyi doğrudan bir erişim numarasıyla bir veritabanından içe aktarabilir veya başka bir dosyadan veya görüntüleyiciden kopyalanan bir nükleotid dizisine yapıştırabilirsiniz.
    3. Ekranın alt kısmında, Montaj Sihirbazı aracını bulun. Montaj Sihirbazı'na tıklayın ve ardından Yeni Montaj Oluştur'u seçin. Sağlanan seçeneklerden Gibson'ı seçin ve montajı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
    4. Vektör dizisi penceresinde, vektör omurgasından montaja dahil edilecek tüm tabanları seçin. Seçimi, gen ekinin 3' ucundaki nükleotid konumunda başlatın (örneğin, pUC19'un 657 konumu) ve dahil edilecek kalan tüm nükleotidleri seçin (örneğin, tüm pUC19 dizisini dahil etmek için 656 konumuna kadar). Seçildikten sonra, ekranın alt kısmındaki Omurga sekmesine tıklayın| Parçayı Ayarla.
      NOT: Dairesel bir şablonun istenen tüm tabanlarını seçmek için vektörün Dizi Haritası ve Plazmid görünümleri arasında geçiş yapın. Alternatif olarak, vektör parçasını Gibson Assembly için kısıtlama özeti (PCR yerine) yoluyla hazırlamayı planlıyorsanız, omurga dizisini bir kısıtlama enzimi kesme bölgesi (örneğin, XbaI) ile doğrusallaştırın. Bunu yapmak için, kesilen yeri tıklatın, Shift tuşunu basılı tutun ve kesilen yeri yeniden tıklatın. Ardından omurgayı ayarlamak için Parçayı Ayarla'yı tıklayın. Omurga Montaj Sihirbazı'nda bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırılırsa, vektöre özgü primerlerin Benchling tarafından oluşturulmayacağını unutmayın.
    5. Kesici uç sırası penceresinde, montaja dahil edilecek tüm kesici uç tabanlarını seçin. Seçildikten sonra, ekranın alt kısmındaki Ekle sekmesine tıklayın | Set Parçası.
    6. Birden fazla gen eklenmesi durumunda, Montaj Sihirbazı'nın sağ tarafındaki + düğmesine tıklayın. Kesici uç sırası penceresinde, montaja dahil edilecek tüm kesici uç tabanlarını seçin. Seçildikten sonra, ekranın alt kısmındaki Ekle sekmesine tıklayın | Set Parçası.
    7. Tüm parçalar ayarlandıktan sonra, montajı istediğiniz plazmit adıyla yeniden adlandırın ve Montaj Sihirbazı'nın sağındaki Assemble'a tıklayın. Hem Sıra Klasörü hem de Primer Klasörü için istediğiniz klasör konumunu seçin. Rekombinant plazmit dizisini birleştirmek için Oluştur'a tıklayın.
    8. Birleştirilmiş plazmidi açın ve temel bir plazmit haritasını ve türetildiği dizilere genel bir bakışı görüntülemek için Montaj Geçmişi'ne tıklayın. Her parça için nükleotid konumlarının istenen tasarımla eşleştiğinden emin olun.
    9. Montaj Parametreleri sekmesinde, montaj için tasarlanmış astarların adlarını görüntüleyin. Her bir insert için tasarlanmış iki primer (bir ileri ve bir geri) olacağını ve primer adlarının DNA dizi dosyalarının başlıklarından türetileceğini unutmayın. Ayrıca, astar erime sıcaklıklarının ve önerilen tavlama sıcaklıklarının bu pencerede uyumlu olduğundan emin olun (bkz. Ek Dosya 8, Temsili Primerler).
      1. Astar erime sıcaklıkları veya tavlama sıcaklıkları ideal değilse, astar dizisi dosyalarındaki astar dizilerini manuel olarak ayarlayın (örneğin, erime sıcaklığını azaltmak için nükleotidlerin çıkarılması). Alternatif olarak, Yeniden aç'a tıklayın ve Montaj Sihirbazı'ndaki Birleştir düğmesinin yanındaki Enzim/Astar Ayarları düğmesine tıklayarak astar ayarlarını yapın. Ardından, Montaj adımını tekrarlayın ve astar dizilerini yeniden inceleyin.
      2. Bir plazmit kütüphanesi, aynı vektör omurgasına klonlanmış birçok farklı gen ile klonlanacaksa,
      3. Her durumda vektör için aynı astar çiftini kullanın. Bunu yapmak için, kesici uca özgü çıkıntıları takacak olan vektör primerlerinden tüm nükleotidleri manuel olarak çıkarın. Bu nükleotidler, astarın 5' ucunda bulunacaktır. Çıkardıktan sonra, astar erime sıcaklıklarının ve tavlama sıcaklıklarının uyumlu olduğundan emin olun (bkz. Ek Dosya 8, Temsili Primerler).
      4. Tüm kesici uç astar çiftlerinin çok benzer erime sıcaklıklarına ve tavlama sıcaklıklarına sahip olduğundan emin olun.
        NOT: Bu, her çiftin tavlama sıcaklığı optimizasyonu ihtiyacını azaltacak ve tüm öğrenci PCR reaksiyonlarının aynı termodöngüleyici programı kullanılarak aynı anda döngüye sokulmasına izin verecektir.
    10. İstenen plazmitler için astar tasarımı tamamlandıktan sonra, Montaj Sihirbazı'nda Sonlandır'a tıklayın. Primerleri bir DNA sentez şirketinden sipariş edin ve insert(ler) ve vektör için DNA şablonlarının örneklerini alın.
    11. DNA şablonlarıyla bir gradyan PCR deneyi kullanarak optimum tavlama sıcaklıkları için hem kesici uca hem de vektöre özgü primer çiftlerini test edin. Benchling tarafından önerilen tavlama sıcaklıklarını başlangıçta 3 °C± test edin.
    12. Tavlama sıcaklıkları belirlendikten sonra, öğrenciler için PCR reaksiyonları için primer çözeltileri, DNA şablonları ve gerekli reaktiflerin alikotlarını oluşturun.
  2. Deneylerden önce, hazırlığı desteklemek ve anlamayı değerlendirmek için öğrencilere çalışma sayfaları sağlayın (Ek Dosya 4, Ek 5 ve Ek 6).
  3. Öğrenme kazanımları ile ilgili veri toplama
    NOT: Gibson Assembly modülünden öğrenme kazanımı verilerini toplamak ve sonuçları yayınlamakla ilgileniyorsanız, kurumun politikalarına göre insan deneklerle araştırma yapmak için onay alın.
    1. Öğrencileri, Gibson Assembly bağımsız projesinin başlamasından en az 1 hafta önce bir öğrenme kazanımı araştırmasına katılmaya davet edin.
    2. Öğrenci katılımcıların, bağımsız projenin başlamasından önce laboratuvar toplantısında çoktan seçmeli ön anketi (Ek Dosya 6) doldurmalarını sağlayın.

2. Öğrenci deneyi A: Doğrusal parçalar elde etmek için PCR

  1. Eğitmenden PCR için primerler ve şablon DNA solüsyonları edinin.
  2. DNA polimeraz MasterMix, DNA şablonu, ileri ve geri primerler ve nükleaz içermeyen su dahil olmak üzere 25 μL reaksiyonları öğrenci kılavuzundaki talimatlara göre pipetleyin (bkz. Ek Dosya 2).
  3. Reaksiyonu, Ek Dosya 2'deki öğrenci kılavuzuna göre bir termodöngüleyicide döndürün. Reaksiyonun tavlama sıcaklığının astarlar için uygun olduğundan ve uzatma süresinin istenen amplikonun uzunluğu için uygun olduğundan emin olun. Ayrıntılı talimatlar için Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'e bakın.
  4. PCR reaksiyonlarını bir sonraki laboratuvar dönemine kadar 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
  5. Agaroz jel elektroforezi ile her reaksiyonun 5 μL'sini analiz edin. Jel çalışırken, plazmit DNA'yı şablon olarak kullanan her reaksiyona 1 μL DpnI kısıtlama enzimi ekleyin. Bu karışımı 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: DpnI, kalan dairesel plazmit DNA şablonunu bozarak dönüşüm adımında yanlış pozitifler elde etme olasılığını azaltacaktır.
  6. PCR'nin başarılı olduğunu ve doğru amplifikasyonun elde edildiğini doğrulamak için jeli görüntüleyin. Başarılı PCR reaksiyonlarını ticari olarak temin edilebilen bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın. Sonraki Gibson montaj hesaplamalarında kullanmak üzere bir mikrohacim spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu (ng/μL) ölçün.
  7. Bir sonraki sınıf toplantısından önce, Gibson Meclisi için reaksiyon tarifini tasarlayın (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 4'e bakın).

3. Öğrenci deneyi B: Gibson Montajı, dönüşümü ve klon seçimi

  1. Gibson Assembly reaksiyonunu tasarlanan tarife göre pipetleyin. Reaksiyonu 50 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonlar kuluçkaya yatarken, kimyasal olarak yetkin Escherichia coli hücrelerini buz üzerinde çözerek dönüşüme hazırlanın.
  2. Gibson Düzeneğinin 2 μL'sini ısı şoku yoluyla kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün. Dönüştürülmüş hücrelerin 100 μL'sini iki seçim plakasına pipetleyin ve sterilize edilmiş boncuklarla yayın. Luria-Bertani (LB) agar üzerinde kalan hücrelerin 10-4, 10-5 ve 10-6 dilüsyonlarını hazırlayın. LB üzerinde her seri seyreltmeden 100 μL plaka (seçim yok) ve sterilize boncuklarla yayın.
    NOT: Bu adım, dönüşüm verimliliğinin hesaplanmasına izin verir.
  3. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakaları bir sonraki ders dönemine kadar 4 °C'de saklayın.
  4. Tüm plakalardaki kolonileri sayın ve Ek Dosya 2'de belirtildiği gibi dönüşüm verimliliğini hesaplayın. Bir seçici plakayı, her iki seçici plakadan dört koloni ile yeniden çizgi haline getirin ve bu plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Bu, pozitif klonlarınızın yedek kültürü olarak hizmet eder.
  5. Bir işaretleyici kullanarak, seçim plakasındaki dört farklı koloniyi seçin, daire içine alın ve öğrencinin baş harfleri ve bir numara ile etiketleyin (örneğin, ABC1). Seçim için antibiyotik içeren yeni bir LB-agar plakası alın, plakayı kadranlara bölmek için bir işaretleyici kullanın (yani dördüncü) ve ardından sırasıyla etiketlenmiş kadrana yeniden çizgi çekmek için her koloninin ~ 1 / 2'sini kullanın ve diğer 1/2'sini seçilen dört koloninin her biri için 5 mL sıvı LB kültürünü aşılamak için. Tüpleri ilgili koloni kimliğiyle (örneğin, ABC1) etiketlediğinizden ve seçim için doğru antibiyotik konsantrasyonunu eklediğinizden emin olun. Sıvı kültürleri gece boyunca 37 ° C'de çalkalanan bir inkübatörde ve agar plakasını 37 ° C'de statik bir inkübatörde inkübe edin; Sıvı kültürleri ve plakaları bir sonraki ders dönemine kadar 4 °C'de saklayın.

4. Öğrenci deneyi C: Plazmid izolasyonu ve taraması

  1. Bir mini hazırlık kiti kullanarak Deney B'deki sıvı kültürlerden plazmit DNA'yı izole edin. İzole plazmit konsantrasyonunu ölçün (ng/μL cinsinden).
  2. İzole edilmiş plazmitleri analiz etmek için bir kısıtlama özeti veya PCR ekranı tasarlayın ( Ek Dosya 2'deki ayrıntılı talimatlara bakın ve Ek Dosya 5'teki beklentileri bildirin).
  3. Kısıtlamayı pipetleyin, reaksiyonları veya reaksiyonları tasarlanan tariflere göre sindirin ve daha önce tasarlanan sıcaklıklarda ve sürelerde inkübe edin.
  4. Sonuçları agaroz jel elektroforezi ile analiz edin.

5. Değerlendirme

  1. Öğrenci katılımcıların, Gibson Assembly modülü tamamlandıktan sonra laboratuvar toplantısı olan çoktan seçmeli anket sonrası (Ek Dosya 7) doldurmalarını sağlayın.
  2. Analiz için anket öncesi ve sonrası yanıtlardaki tüm verileri birleştirin.
    1. Anketler arasındaki her bir içerik sorusunun ortalama puanındaki artışın istatistiksel anlamlılığını, iki kuyruklu eşleştirilmiş t-testleri ve Cohen'in d etkisi büyüklüğünü kullanarak inceleyin.
    2. Değişimin derecesini ve istatistiksel anlamlılığını belirlemek için her bir terim ve teknik için öğrenci güven artışını değerlendirin.
    3. Normalleştirilmiş öğrenme kazanımı (NLG) ve eşleştirilmemiş t-testlerini kullanarak öğrenci geçmişinin ve akademik faktörlerin öğrenci öğrenimi üzerindeki etkisini belirleyin.
    4. Ortalama puanları değerlendirerek öğrencilerin proje deneyimine ve moleküler biyoloji kariyerlerine yönelik tutumlarını değerlendirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonlamada öğrenci başarısı


figure-results-1


figure-results-2

figure-results-3

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, öğrencilere ders temelli bir araştırma ortamında Gibson Assembly aracılığıyla moleküler klonlamayı öğreten ayarlanabilir bir lisans sınıfı laboratuvar projesi öneriyoruz. Toplamda, 28 yeni plazmit lisans öğrencileri tarafından bir sınıf ortamında klonlandı. Bireysel öğrenci tarafından bildirilen başarı, üç kohort üzerinden% 44.4 ile% 81.8 arasında değişmektedir ve genel klonlama başarısı% 80 idi (toplam atanan 35 plazmitin 28'i başarıyla klonlandı). 2023'te daha düşük klonlama başarısı muhtemelen iki bileşik faktörden kaynaklanıyordu. İlk olarak, şablon DNA örneklerinin tüpleri çok yakından ilişkili isimlerle etiketlendi; öğrenci araştırmacılar tarafından hazırlanan DNA şablonlarının karıştırılması ve bunun da öğretim laboratuvarında öğrenciler tarafından gerçekleştirilen Gibson Assembly reaksiyonu sırasında uyumlu olmayan doğrusal parçaların kombinasyonuna yol açması mümkündür. Bu projenin gelecekteki yinelemelerinde, öğrencilere verilmeden önce doğru kimliği doğrulamak için şablon DNA önce dizilenmeli veya bir kısıtlama özeti ile taranmalıdır. İkincisi, bu projenin 2023 yinelemesi, önceki yıllardaki iki parçalı montajların (bir vektör ve bir insert) aksine, dört parçalı montajlardan (bir vektör ve üç insert) oluşuyordu. Gibson Assembly'deki daha fazla parça reaksiyon verimliliğini düşürebileceğinden, bu aynı zamanda bu proje için klonlama başarısını da düşürmüş olabilir22. Bu projenin gelecekteki yinelemelerinde, başarılı plazmid ligasyonu ve dönüşümü olasılığını artırmak için daha fazla grubun aynı plazmidi klonlaması veya grupların çeşitli ekleme-vektör oranlarında birden fazla Gibson Assembly reaksiyonu kurması yoluyla daha fazla yedeklilik oluşturulabilir. Ek olarak, parçalar arasındaki daha uzun örtüşmeler ve Gibson Montaj reaksiyonunun artan inkübasyon süresi dahil edilmesi, 4-6 parçalı montajlarda başarıyı artırabilir23.

Yeni plazmitlerin klonlanmasına ek olarak, proje öncesi ve sonrası anket sonuçları, öğrencilerin moleküler biyoloji ve moleküler klonlama kavramlarını daha iyi anladıklarını, Gibson Assembly klonlaması ile ilgili sorular için en yüksek etki büyüklüğüne sahip olduklarını göstermektedir. Ek olarak, değerlendirilenlerin çoğunluğu için projeyi tamamladıktan sonra moleküler biyoloji terimlerine ve laboratuvar tekniklerine ilişkin kendi bildirdikleri öğrenci güveni önemli ölçüde iyileşti. Gibson Assembly, akademik araştırmalarda ve biyoteknoloji endüstrisinde kullanılan önemli ve çok yönlü bir moleküler klonlama tekniğidir2. Bu kavramları ve uygulamalı becerileri bir laboratuvar dersinde öğreterek, tüm lisans öğrencileri, işgücüne girerken veya sürekli eğitime girerken araştırma yetkinliği ve işe alınabilir becerilerle mezun olmak için eşit fırsata sahiptir.

Açıklanan Gibson Assembly müfredatı, başarılı bir CURE4'ün beş bileşenini içerir. Öğrenciler, PCR amplikon boyutlarına ve kısıtlama sindirim kesintilerine dayalı hedefler ve beklentiler dahil olmak üzere kendi protokollerini tasarlayarak bilimsel uygulamaları kullandılar (Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5). Bağımsız proje, gerekli her parçanın hazırlanmasını bir grup içindeki üyeler arasında bölerek ve nihayetinde her bir grup üyesinden gelen parçaları tek bir ligasyon reaksiyonunda kullanarak öğrenci işbirliğini teşvik eder (Ek Dosya 3'te Deney: Bir Planlama Çalışma Sayfası (Takım Tabanlı)). Bu bağımsız projelerin klonlamayı amaçladığı plazmitler, sınıf dışındaki araştırma projeleriyle ilgili olan ve potansiyel olarak yayınlanabilir araştırmalar için veri sağlayan yeni ifade plazmitleridir. Daha geleneksel bir araştırma deneyimine benzer şekilde, CURE kursundaki klonlama başarı oranları %100 değildi. Öğrencilerden, olumsuz sonuçlar vermiş olabilecek değişkenleri değerlendirmeleri ve plazmidin neden başarılı bir şekilde klonlanmadığını açıklayan hipotezler önermeleri istendi, bu da öğrenciler için araştırma sonuçları ile ilgili gerçek bir öğrenme deneyimi olarak hizmet etti.

Bu Gibson Assembly CURE yinelemesinde, öğrenciler Actinomycetota doğal ürün araştırmasına uygun plazmitleri klonladılar; Bununla birlikte, iş akışı diğer projelere de son derece uyarlanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Burada sunulan protokoller genelleştirilmiştir ve öğrencilerin altı laboratuvar toplantısı ve iki ders içinde çok sayıda araştırma amacı için kullanılabilecek plazmitleri klonlamalarına izin verir. Çerçeve, öğrencilerin yeni plazmitleri ayrı ayrı klonlamalarına veya öğrencilerin takım tabanlı bir yaklaşımla >2 doğrusal parçadan tek bir plazmiti klonlamak için birlikte çalışmalarına olanak tanır. Genel olarak, bu yaklaşım, Gibson Assembly'nin farklı şekilde kullanılmasını gerektirebilecek çok çeşitli araştırma projelerine uyacak şekilde uyarlanabilir.

Bu çalışma, Gibson Assembly'yi öğretmek için CURE tabanlı bir yaklaşımla öğrenci öğrenme kazanımlarını değerlendirdi, ancak çalışmanın genişletilmesi yoluyla ek bilgiler elde edilebilir. Anket öncesi ve sonrası format, bağımsız proje nedeniyle öğrenme çıktılarının değerlendirilmesine izin verirken, Gibson Assembly'nin ders temelli öğretimi ile herhangi bir karşılaştırma yapılmamıştır. Deneye dayalı CURE'nin, deneysel sonuçların zaten öğrenciler için tasarlandığı ders tabanlı veya daha geleneksel bir laboratuvar etkinliğiyle karşılaştırılması, geliştirilmiş Gibson Assembly öğrenme çıktılarının CURE kurs modeline özgü olması durumunda daha fazla bilgi sağlayacaktır. Son olarak, Gibson Meclisi ile ilgili bazı içerik soruları anlamada önemli gelişmeler gösterirken, diğerleri göstermedi. Gibson Assembly'de kullanılan homolog örtüşmeler, bunların nasıl monte edildiği ve bir Gibson Assembly klonlama reaksiyonunda nasıl yeniden birleştikleri ile ilgili sorular iyileşmedi. Bu, bu konularla ilgili daha fazla açıklamanın veya ek bir öğrenme değerlendirmesinin, bu müfredatın gelecekteki uygulamalarında öğrenci anlayışını geliştirebileceğini düşündürmektedir.

Gibson Assembly bağımsız proje yapısı Cal Poly'de uygulanmaya devam ediyor. Dersin gelecekteki yinelemelerinde, bu proje daha yüksek öğrenci bağımsızlığı, hipotez oluşturma ve deneysel tasarıma izin verecek şekilde değiştirilecektir. Cal Poly'de yaklaşan bir müfredat değişikliği, bağımsız projeyi, öğrenci liderliğindeki primer tasarımını, vektör omurga seçimini, dizi analizini ve/veya protein ekspresyonu gibi plazmitlerin aşağı akış testini içerecek şekilde genişletme fırsatı sunuyor. Ek olarak, bağımsız proje, devam eden araştırma projelerinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, bölgeye yönelik mutajenez veya gen düzenleme gibi diğer ilgili moleküler biyoloji tekniklerini öğretmek için özelleştirilebilir. Öğrencilerin bağımsız projede kullandıkları teknikleri değiştirmek, hangi konuların CURE formatı için uygun olduğu ve hangilerinin uygulanmasının zor olduğu konusunda daha fazla anlayış sağlayabilir.

Birlikte ele alındığında, bu rapor, hem öğrencilerin ortaya çıkan bir klonlama metodolojisini anlamalarını geliştirmek hem de bilimsel süreçteki yetkinliği artırmak için bir CURE uygulayan uyarlanabilir bir Gibson Assembly öğretim modülünü detaylandırmaktadır. Bağımsız proje, değerlendirilen moleküler biyoloji terim ve tekniklerinin çoğunda öğrenci öğrenme sonuçlarını ve güvenini geliştirdi. Bu modülün yalnızca yeni araştırma plazmitleri oluşturmak için değil, aynı zamanda öğrencilerin araştırma tekniklerine erişilebilirliğini ve güvenini artırmak, lisans öğrencilerini STEM'de gelecekteki kariyerlere daha iyi hazırlamak için kullanılmasını ve uyarlanmasını teşvik ediyoruz. İdeal olarak, bu çalışma moleküler biyoloji müfredatındaki gelişmelere ilham verecek ve bilimsel araştırma metodolojileri gelişmeye devam ettikçe STEM dersinin uyarlanabilirliğini teşvik edecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik destek için Andrea Laubscher'e ve laboratuvar uygulaması ve öğrenme çıktılarının değerlendirilmesi üzerine yararlı tartışmalar için Michael Black, Sandi Clement ve Javin Oza'ya minnetle teşekkür eder. Yazarlar, 2019, 2022 ve 2023 kohortlarında öğrenme çıktısı çalışmasına katılan tüm öğrencilere ve ayrıca laboratuvar uygulamasını öğretmek için reaktif hazırlığına yardımcı olan araştırma öğrencileri Nathan Kuhn ve Aayushi Adettiwar'a takdirle teşekkür eder. Yazarlar ayrıca William ve Linda Frost Fonu, Biyoteknoloji Uygulama Merkezi'nin Chevron Biyoteknoloji Uygulamalı Araştırma Bağış Hibesi ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF-1708919 ve NSF-2300890) fon desteğini kabul etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP'ler, 10  mM)Fisher ScientificFERR0191Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
Ditiyotreitol (DTT)Fisher ScientificFERR0861Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
DpnI New England BiolabsR0176S1000 adet
Fisherbrand Isotemp Mikrobiyolojik İnkübatörFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Isotemp Su BanyosuFisher ScientificS28124
GelRed Nükleik Asit Jel LekesiBiotiumNC959471910.000X
GeneJET Jel Ekstraksiyonu ve DNA Temizleme Mikro KitiThermo ScientificFERK0831100 Hazırlık
GeneRuler 1 kb DNA merdiveniFisher ScientificFERSM0314 100 uygulama
LB Et suyu, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 g
Magnezyum klorür hekzahidratFisher ScientificBP214-500Ev yapımı' MasterMix bileşeni
Mastercycler nexus X2 Gradyan TermodöngüleyiciEppendorf6337000027
Mikrofüj 16 SantrifüjBeckman CoulterA46474
Micromonospora echinospora bakteriAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC 15837
Mikrodalga FırınGeneral Electric 
Moleküler Biyoloji Sınıfı AgarozFisher BioReaktiflerBP160-100100 g
Nanodrop Bir Mikrohacimli SpektrofotometreThermo Scientific13-400-518
NEB 5-alfa Yetkili E. coliNew England BiolabsC2987H20 x 0.05 mL
NEBuilder HiFi DNA Montaj Master MixNew England BiolabsE2621S10 reaksiyon
New Brunswick Innova 40 Masaüstü Orbital ÇalkalayıcıNew BrunswickM1299-0090
Nükleaz İçermeyen SuFisher BioReagentsBP248450 50 mL
PEG-8000 Fisher ScientificBP233-100Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
Phusion DNA PolimerazNew England BiolabsM0530Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
Taşınabilir TeraziOhausSKX123
pUC19 vektörNew England BiolabsN3041S
Q5 Yüksek Sadakat 2x Master Mix New England BiolabsM0492S100 reaksiyon
T5 EksonükleazMerkez üssüT5E4111KEv Yapımı' MasterMix bileşeni
Taq DNA LigaseNew England BiolabsM0208Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Ev Yapımı' MasterMix bileşeni
TriTrack DNA Jel Yükleme Boyası (6x)Termo BilimselFERR11615 x 1 mL
Zyppy Plazmid Miniprep KitiZymo ResearchD4019100 Hazırlık
ve beta;-Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +)New England BiolabsB9007SEv Yapımı 'MasterMix bileşeni
2440640

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory. Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Bell, J. K., et al. CUREs in biochemistry—where we are and where we should go. Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).
  4. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).
  5. Buchanan, A. J., Fisher, G. R. Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review. CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).
  6. Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).
  7. Li, G., et al. CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research. Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).
  8. Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry. Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).
  9. Li, C., et al. Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology. Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).
  10. Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes. Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).
  11. Dean, D. M., Wilder, J. A. The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods. Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).
  12. Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).
  13. Roberts, L. A., Shell, S. S. A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation. Front Microbiol. 13, 1025250(2023).
  14. Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects. Microbiol Res. 246, 126708(2021).
  15. Banskota, A. H., et al. TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins. J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).
  16. Schorn, M., et al. Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors. ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).
  17. Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).
  18. Williams, L. C., et al. The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education. Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).
  19. Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM. PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).
  20. Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors. CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).
  21. Camacho, C., et al. BLAST+: Architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  22. Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly (2024).
  23. Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gibson MontajKurs Tabanl Ara t rmaPlazmid K t phanelerirenci renme Kazan mlarMolek ler Biyoloji M fredatKlonlama TeknikleriDo al r n BiyosenteziLaboratuvar Kurs Mod l

İlgili makaleler