Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Özet

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Özet

Ökaryotlar, replizomu merkezi olarak organize eden ve süren ve replikasyon çatallarının önünde yol gösteren CMG olarak bilinen bir replikatif helikaza sahiptir. CMG'nin dinamikleri hakkında derin bir mekanik anlayış elde etmek, hücrelerin tüm genomlarını hücre döngüsü başına bir kez verimli ve doğru bir şekilde çoğaltma gibi muazzam bir görevi nasıl başardıklarını aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Tek moleküllü teknikler, benzersiz zamansal ve uzamsal çözünürlükleri nedeniyle CMG'nin dinamiklerini ölçmek için benzersiz bir şekilde uygundur. Bununla birlikte, CMG hareketinin tek moleküllü çalışmaları, şimdiye kadar, hücrelerden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden oluşturulmuş CMG'ye dayanmıştır, bu da aktivasyonuna yol açan adımların incelenmesini engellemektedir. Burada, 36 farklı saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptitinden montajını ve aktivasyonunu tamamen yeniden oluşturduktan sonra floresan olarak işaretlenmiş CMG'nin hareketinin tek molekül seviyesinde görüntülemeye izin veren hibrit bir topluluk ve tek moleküllü testi tarif ediyoruz. Bu tahlil, iki ortogonal bağlanma parçasına sahip doğrusal bir DNA substratının uçlarının çift işlevselleştirilmesine dayanır ve tek molekül düzeyinde benzer şekilde karmaşık DNA işleme mekanizmalarını incelemek için uyarlanabilir.

Giriş

Ökaryotlarda DNA replikasyonu, replisome¹ olarak bilinen dinamik bir protein kompleksi tarafından gerçekleştirilir. Bu kompleksin önemli bir bileşeni, replizomu süren ve merkezi olarak organize eden, replikasyon çatallarının ^1,2 önünde yol gösteren ökaryotik replikatif sarmal Cdc45/Mcm2-7/GINS'dir (CMG). Bu nedenle, CMG'nin dinamikleri hakkında derin bir nicel anlayış elde etmek, yanıtın dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Böyle bir anlayış, eşsiz uzamsal ve zamansal çözünürlükleri nedeniyle CMG gibi moleküler motorları incelemek için benzersiz bir şekilde uygun olan tek moleküllü tekniklerle elde edilebilir ve bize işlevleri, stokastiklikleri ve dinamikleri hakkında benzersiz bir nicel anlayış sağlayabilir 2,3,4,5,6,7,8,9.

İn vivo, CMG, replikasyonun hücre döngüsü ^1,10,11 başına yalnızca bir kez gerçekleşmesini sağlamak için zamansal olarak ayrılmış bir şekilde yüklenir ve aktive edilir. İlk olarak, hücre döngüsünün G1 fazında, yükleme faktörleri olarak bilinen bir dizi protein, CMG'nin ilk bileşeni olan Mcm2-7 heksamerik kompleksini, kafa kafaya konfigürasyona sahip çift heksamer şeklinde dsDNA 12,13,14,15,16 üzerine ^yükler 15,17,18 . Maya spesifik durumunda, bu ilk işlem, replikasyon^1'in kökenleri olarak bilinen spesifik DNA dizilerinde meydana gelir. Mcm2-7, replikatif helikazın motor çekirdeği olmasına rağmen, tam aktif CMG^{11,19,20,21'e} yol açmak için yüklü Mcm2-7'ye alınması gereken iki helikaz aktive edici faktör Cdc45 ve GINS olmadan kendi başına DNA ^19'u çözemez. Helikaz aktivasyon süreci, hücre döngüsünün S fazında gerçekleşir ve hücre döngüsü tarafından düzenlenen kinaz DDK ^22,23,24 tarafından Mcm2-7 çift heksamerlerinin seçici fosforilasyonu ile başlar. Bu fosforilasyon olayları, Cdc45 ve GINS'in, ateşleme faktörleri^10,11,26 olarak bilinen ikinci bir protein seti tarafından Mcm2-7 çift heksamerlere 10,22,23,24,25,26 alınmasını kolaylaştırır . Cdc45 ve GINS'in bağlanması, başlangıçta ebeveyn DNA'sının her iki zincirini de çevreleyen ve hala kafa kafaya bir konfigürasyonda bulunan iki kardeş CMG helikazına^{yol açar 11,27}. Son aktivasyon adımında, ateşleme faktörü Mcm10, her bir kardeş CMG^11'den bir DNA zincirinin ATP hidrolizine bağlı ekstrüzyonunu katalize eder. İplik ekstrüzyonundan sonra, kardeş CMG helikazları, ATP hidrolizine bağımlı bir şekilde ^11,20,21,28 ssDNA boyunca yer değiştirerek birbirinden baypas eder ve ayrılır, translokasyon olmayan iplik^29'u sterik olarak dışlayarak DNA'yı çözer. Tüm bu süreç, minimal 36 saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptit^10,11 setinden in vitro olarak tamamen yeniden oluşturulmuştur.

Yukarıda tarif edilen CMG montajının ve aktivasyonunun mükemmel in vivo regülasyonuna rağmen, CMG ^{2,30,31,32,33,34'ün} in vitro olarak yeniden yapılandırılmış tek moleküllü hareket çalışmaları, şimdiye kadar^20,21 hücrelerinden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden aktive edilmiş CMG'ye dayanmıştır, aktivasyonundan önceki tüm adımları ve hareketinin çift yönlü doğasını kaçırıyor. Bu önceden aktive edilmiş CMG yaklaşımı, kısmen tamamen yeniden yapılandırılmış CMG montaj reaksiyonunun^10,11 biyokimyasal karmaşıklığı nedeniyle tek moleküllü alanda altın standart olmuştur. Bu biyokimyasal reaksiyonun, çeşitli nedenlerden dolayı toplu biyokimyasal seviyeden tek molekül seviyesine çevrilmesi zor olmuştur. İlk olarak, reaksiyon verimlerini en üst düzeye çıkarmak için, CMG montajı ve aktivasyonu için gerekli olan yükleme ve ateşleme faktörleri 10-200 nM 10,11,27 aralığındaki konsantrasyonlarda gereklidir. Bu konsantrasyon aralıkları, özellikle floresan etiketli bileşenler³⁵ kullanıldığında, çoğu tek moleküllü tekniğin tolere edebileceğinin en üst sınırına karşılık gelir. Son olarak, CMG, ^36,37,38,39 hücresindeki binlerce baz çifti arasında gezinmek için evrimleşmiştir. Bu nedenle, hareketini biyolojik olarak ilgili bir uzamsal ölçekte incelemek için, uzun DNA substratları (tipik olarak onlarca kilobaz mertebesinde uzunluklarda) gerekir.30,31,34,40,41,42. Bu kadar uzun DNA substratlarının kullanılması, DNA substratı ne kadar uzunsa, proteinler ve protein agregatları için o kadar fazla potansiyel spesifik olmayan bağlanma bölgesi gibi ek bir zorluk teşkil eder. CMG söz konusu olduğunda, CMG montajı ve aktivasyonunda yer alan yükleme ve ateşleme faktörlerinin birçoğu içsel olarak düzensiz bölgeler⁴³ içerdiğinden ve toplanmaya eğilimli olduğundan, ikinci nokta özellikle önemlidir.

Burada, 36 saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptit^28'den montajını ve aktivasyonunu tamamen yeniden oluşturduktan sonra CMG'nin hareketinin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz. Bu tahlil, bir DNA substratının her iki ucunun iki ortogonal bağlanma parçası ile çift işlevselleştirilmesine dayanır: desthiobiotin ve digoksigenin² (Şekil 1A). İlk kısım olan desthiobiotin, DNA substratını streptavidin kaplı manyetik boncuklara⁴⁴ geri dönüşümlü olarak bağlamak için kullanılır (Şekil 1B). Bunu takiben, floresan etiketli CMG, boncuk bağlı DNA üzerine monte edilir ve aktive edilir ve elde edilen manyetik boncuk bağlı DNA: CMG komplekslerini saflaştırmak ve yıkamak için manyetik bir raf kullanılır (Şekil 1C). Bunu yaparken, aksi takdirde DNA substratı üzerinde toplanacak olan fazla protein uzaklaştırılır; bu, neredeyse agregasyonsuz DNA: CMG kompleksleri sağlar. Sağlam kompleksler daha sonra, desthiobiotin-streptavidin etkileşimini geride bırakabilen bir molar fazla serbest biotin ilavesiyle manyetik boncuklardan ayrıştırılır (Şekil 1D). Bireysel DNA: CMG kompleksleri daha sonra anti-digoksigenin antikoru (anti-Dig) ile kaplanmış optik olarak hapsedilmiş iki polistiren boncuk arasına bağlanır; bu adım için, DNA üzerindeki ikinci kısım olan digoksigenin, fazla miktarda serbest biyotin içeren bir tampon çözeltisinde bile anti-Dig'e bağlanabildiği için kullanılır (Şekil 1E). DNA: CMG kompleksi optik tuzakta yerinde tutulduktan sonra, floresan etiketli CMG'nin hareketi bir konfokal tarama lazeri ile görüntülenir (Şekil 1F). Bu tahlilin, benzer şekilde karmaşık DNA: protein etkileşimlerinin tek molekül düzeyinde çalışma için kolayca uyarlanabileceğini tahmin ediyoruz.

Protokol

1. Çift işlevselleştirilmiş lineer DNA substratının sentezi ve manyetik boncuklara bağlanması

1. DNA substratının desthiobiotin ve digoksigenin kısımları ile ikili işlevselleştirilmesi
   1. 20 μg 23.6 kb plazmid pGL50-ARS1'i (doğal bir ARS1 replikasyon kaynağı içeren, evde klonlanmış ve istek üzerine temin edilebilir) 200 μL 1x tampon (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat) nihai hacimde 37 ° C'de 16 saat boyunca doğrusallaştırın. 100 μg/ml BSA, pH 7.9).
      NOT: Bu adım, daha uygunsa, verimi düşürmeden 4 saate düşürülebilir.
   2. Reaksiyonu 65 ° C'de 20 dakika inkübe ederek AflII'yi inaktive edin. 200 μL'lik doğrusallaştırma reaksiyonunu 60 birim Klenow Fragment (3' ila 5' ekzo-) polimeraz, 17 μL 10x tampon (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 7.9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, ve 370 μM'lik bir nihai hacme kadar ultra saf su. Reaksiyonu 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu adımda, Klenow Parçası, her iki uçta iki D-Desthiobiotin-7-dATP ve iki Digoxigenin-11-dUTP nükleotidi ekleyerek doğrusallaştırılmış DNA'nın her iki ucundaki çıkıntıları köreltir.
   3. Reaksiyonu 10 mM EDTA ile destekleyin ve reaksiyonu 75 ° C'de 20 dakika inkübe ederek Klenow Fragmanını inaktive edin. Ultra saf su ile reaksiyon hacmini 400 μL'ye getirin.
   4. Dört S-400 döndürme sütunu alın, reçineyi yeniden süspanse etmek için en az 30 saniye vorteksleyin ve ardından depolama tamponunu çıkarmak için 735 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. 1,5 mL'lik tüpleri temizlemek için sütunları aktarın.
   5. Hemen, her sütuna 100 μL DNA çözeltisi ekleyin ve bunları 735 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. DNA şimdi akış halindedir ve sütunlar atılabilir.
   6. Dört sütunun akışını bir araya getirin, hacmi bir pipetle ölçün ve DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bu, boncuklara bağlı DNA miktarını hesaplamak için kullanılacaktır.
2. Streptavidin kaplı manyetik boncuklara iki kat işlevselleştirilmiş lineer DNA'nın bağlanması
   1. M-280 streptavidin kaplı manyetik boncukları 30 saniye boyunca yeniden süspanse etmek için vorteks.
   2. 4 mg yeniden süspanse edilmiş M-280 streptavidin kaplı manyetik boncukları temiz bir 1.5 mL tüpe aktarın. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların toplanması için 1 dakika bekleyin ve saklama tamponunu çıkarın.
   3. Boncuklara 1 mL 1x tampon A (5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA ve 1 M NaCl) ekleyin ve 5 saniye boyunca girdaplama ile yeniden süspanse edin. Boncukları oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Tüm tamponlar steril filtreli olmalıdır. Zaman kazanmak için önceden 2x tampon A, 1x tampon B (aşağıya bakın) ve 1x tampon C (aşağıya bakın) büyük miktarda yapın (önerilir). Bu tamponlar, manyetik boncuk üreticisi tarafından tavsiye edilen tamponlardır ve - 20 ° C'de saklanabilir.
   4. Tüpü manyetik bir tutucuya yerleştirin, boncukların toplanması için 1 dakika bekleyin ve tampon A'yı çıkarın.
   5. Boncukları pipetleme yoluyla 400 μL 2x tampon A içinde yeniden süspanse edin ve ardından 400 μL işlevselleştirilmiş DNA çözeltisi ekleyin (bunun 2x tampon A'yı, DNA'nın boncuklara bağlanması için en uygun olan 1x'lik bir nihai konsantrasyona seyrelttiğini unutmayın). Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
   6. İşlevselleştirilmiş DNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için boncuk/DNA karışımını gece boyunca 4 °C'de uçtan uca dönüşle inkübe edin.
   7. Süpernatanı çıkarmak için manyetik rafı kullanın (hacmini bir pipetle ve bağlanmamış DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçmeden önce atmayın) ve boncukları 2x 500 μL tampon B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA ve 1 M KOAc) ile yıkayın spesifik olarak bağlanmamış DNA'yı çıkarmak için. Boncukları 2x, üretici tarafından önerilen saklama tamponu olan 500 μL tampon C (10 mM HEPES-KOH pH 7.6 ve 1 mM EDTA) ile yıkayın.
      1. Boncuklara eklenen toplam DNA miktarını süpernatantta kalan DNA miktarı ile karşılaştırarak manyetik boncuklara bağlı toplam DNA miktarını hesaplayın. Verim, mg manyetik boncuk başına 2.3-2.9 mg DNA (~ 150-190 fmol) aralığında olmalıdır. Daha düşük verim elde edilirse, kullanmadan önce S400 kolonlarının kuru olmadığını kontrol edin. İlk plazmit DNA substratının bozulmadığından emin olmak için jel elektroforezi ile DNA bütünlüğünü sürekli olarak izleyin.
   8. Boncukları 300 μL tampon C'de tekrar süspanse edin ve 4 °C'de saklayın. Çentiklenmeyi önlemek için, 1 mg manyetik boncuktan 4 adet tek kullanımlık alikot yapın ve DNA'yı 2 haftadan daha uzun süre saklamayın.

2. Korelasyonlu çift ışınlı optik cımbız ve konfokal mikroskopi ile tamamen yeniden yapılandırılmış CMG'nin hareketini görüntülemek ve ölçmek için hibrit topluluk ve tek moleküllü test

1. Floresan etiketli CMG'nin manyetik boncuk bağlı DNA (Şekil 1C).
   NOT: CMG montajı ve aktivasyon reaksiyonları iki aşamada gerçekleştirilmiştir: Mcm2-7 yükleme ve fosforilasyon ve CMG montajı ve aktivasyonu. Aksi belirtilmedikçe, tüm tampon değişim adımları, boncukların mıknatıs tarafından 1 dakika boyunca toplanmasına izin verilerek ve ardından süpernatantın çıkarılmasıyla manyetik bir raf yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Tüm inkübasyonlar, floresan proteinlerin foto-ağartılmasını önlemek için kapaklı, sıcaklık kontrollü bir ısı bloğunda gerçekleştirildi. Kapak yoksa, tüpler kalay folyo ile kaplanmalıdır. Bu protokolde kullanılan tüm proteinlerin saflaştırılması ve floresan etiketlemesi daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir^10,11,28.
   1. Mcm2-7 yükleme ve fosforilasyon
      1. 1 mg DNA'ya bağlı streptavidin kaplı manyetik boncuklar alın ve depolama tamponunu (tampon C) çıkarın.
      2. Boncukları 200 μL yükleme tamponu ile yıkayın (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, %10 gliserol, 2 mM DTT, 100 μg/mL BSA ve 5 mM ATP).
      3. Yükleme tamponunu çıkarın ve boncukları 75 μL yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
      4. Boncuk bağlı DNA'ya 37.5 nM'lik bir nihai konsantrasyonda ORC ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
      5. 50 nM'lik bir nihai konsantrasyonda Cdc6 ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
      6. 100 nM'lik bir nihai konsantrasyonda Mcm2-7 / Cdt1 (veya floresan etiketli Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3} / Cdt1) ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
      7. 100 nM'lik bir nihai konsantrasyonda DDK ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      8. Süpernatanı çıkarın ve boncuk bağlı DNA'yı (şimdi fosforile Mcm2-7 heksamer içerir) 200 μL yüksek tuzlu yıkama (HSW) tamponu (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, %10 gliserol, 1 mM DTT ve 400 μg/mL BSA) ile yıkayın. Pipetleme ile karıştırın, boncukların tamponda tamamen yeniden asılı kaldığından ve hiçbir topak görünmediğinden emin olun.
      9. HSW tamponunu çıkarın ve boncukları 200 μL CMG tamponu (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, %10 gliserol, 1 mM DTT ve 400 μg/mL BSA) ile yıkayın.
   2. Floresan etiketli CMG'nin montajı ve aktivasyonu
      1. CMG tamponunu çıkarın ve DNA'ya bağlı boncukları 5 mM ATP ile desteklenmiş 50 μL CMG tamponunda yeniden süspanse edin.
      2. Boncuk bağlı DNA'ya 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45^LD555, 30 nM Sld3 / 7, 55 nM Sld2 ve 10 nM Mcm10 ekleyin. Bu adım için, tüm proteinleri DNA'ya eklemeden hemen önce bir tüpte karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin. Yeniden askıya alınmış boncuk bağlı DNA'yı protein karışımına ekleyin. Reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
      3. Boncukları 3x 200 μL HSW tamponu ile yıkayın. Boncukları 200 μL CMG tamponu ile bir kez yıkayın.
   3. Bozulmamış DNA'nın elüsyonu: Manyetik boncuklardan CMG kompleksleri (Şekil 1D)
      1. CMG tamponunu çıkarın ve DNA'yı elüte edin: CMG içeren DNA'ya bağlı manyetik boncukları 200 μL elüsyon tamponunda (10 mM biotin ile desteklenmiş CMG tamponu) yeniden süspanse ederek manyetik boncuklardan CMG kompleksleri. 800 rpm çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      2. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca toplanmasına izin verin. Çökelmiş boncukları bozmadan süpernatanı (şimdi ayrıştırılmış DNA: CMG komplekslerini içeren) dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
      3. Çözeltide boncuk kalmadığından emin olmak için (çözelti içinde bırakılan manyetik boncuklar testin optik yakalama kısmına müdahale edebileceğinden), toplanan süpernatanı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve kalan boncukların 5 dakika daha toplanmasına izin verin. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
      4. 200 μL süpernatanıma 1400 μL CMG tamponu ekleyin. Numune artık tek moleküllü görüntüleme için hazırdır.
2. Tam sulandırılmış CMG'nin korelasyonlu çift ışınlı optik cımbız ve konfokal mikroskopi ile tek moleküllü görüntülenmesi (Şekil 1E-G).
   NOT: Testin tek moleküllü kısmı, çift ışınlı optik cımbızları konfokal mikroskopi ve mikroakışkanlarla birleştiren ticari bir kurulumda gerçekleştirilir^45,46 (Şekil 1E-G), ancak ev yapımı bir kurulumda da gerçekleştirilebilir. Burada kullanılan ticari kurulum, beş girişe (sırasıyla Kanal 1-5 olarak anılır) ve bir çıkışa (Şekil 1E). Aşağıdaki adımlarda, tüm düğme ve/veya panel adları, bu ticari kurulumla birlikte sağlanan yazılıma özeldir.
   1. Ticari kurulumdaki beş girişi aşağıdaki gibi kullanın: Kanal 1-3'ü soldan enjekte edin ve bunları boncuk yakalama (Kanal 1), DNA-protein kompleksi bağlama (Kanal 2) ve CMG'nin varlığını kontrol etme (Kanal 3) için kullanın. Kanal 4 ve 5'i protein rezervuarları ve tampon değişim yerleri olarak kullanın. Her deneyden önce, mikroakışkan akış hücresini 1 mg / mL sığır serum albümini ile en az 30 dakika pasifleştirin, ardından ultra saf suda çözülmüş% 0.5 Pluronic F-127 ile pasifleştirin.
      1. Her deneydeki her kanalın içeriğinin açıklandığı gibi olduğundan emin olun (Şekil 1E):
         Kanal 1: PBS'de 1:50 oranında seyreltilmiş anti-digoksigenin kaplı polistiren boncuklar (2.06 μm çapında);
         Kanal 2: DNA: Manyetik boncuklardan ayrıştırılan CMG kompleksleri;
         Kanal 3: Görüntüleme Tamponu (2 mM 1,3,5,7 siklooktatetraen, 2 mM 4-nitrobenzilalkohol ve 2 mM Trolox ile desteklenmiş CMG tamponu);
         Kanal 4 ve 5: 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 ve 5 mM ATP, 5 mM ATPγS ile desteklenmiş veya nükleotid içermeyen Görüntüleme Tamponu.
   2. Deneyden önce, yazılımın Güç Kontrolleri panelindeki Yeniden Kalibre Et düğmesine tıklayarak her iki tuzakta^{da 0.3} pN/nm sertlik elde etmek için yakalama lazer gücünü ^33,46 ayarlayın. Yazılımın Görüntü Tarama panelinde eş odaklı piksel boyutunu 50 x 50 nm, görüntü boyutunu 160 x 18 piksel, piksel başına aydınlatma süresini 0,2 ms ve kare hızını 5 saniye olarak ayarlayın. Sıcaklık panelinde sıcaklık kontrolünü 30 °C'ye ayarlayın.
      NOT: Ek olarak, sürükleme kuvveti ile CMG'nin DNA'dan ayrışmasını en aza indirmek için maksimum aşama hızını (kanallar arasında hareket etmek için kullanılır) 0,2 mm/sn'ye ayarlamanızı öneririz.
   3. Tüm çözeltileri, enjeksiyon portunda 0,5 bar'lık sabit bir basınçla akış hücresine aktarın (bu, yazılımın Basınç Çubuğu panelinde ayarlanabilir). Ardından, 4. ve 5. kanallardaki akışı kapatın. Başlangıçta tüm çözeltileri akıttıktan sonra, basıncı 0,2 bar'a düşürün.
   4. Her optik tuzağa bir boncuk yakalanana kadar yakalama lazerlerini Kanal 1'e taşıyın. Tetiğe basarken joystick'i hareket ettirerek sıkışan boncukları Kanal 2'ye taşıyın. Ardından, tetiğe basmadan joystick'i kullanarak sağ boncuğu sol boncuğa doğru ve sol boncuktan uzaklaştırarak, bir DNA bağı sıkışana kadar bir DNA:CMG kompleksi avlayın (bu, yazılımın FD Viewer panelinde sıkışmış DNA^47'nin kuvvet uzatma eğrisinin izlenmesiyle bilinir).
      1. DNA bağlantısı için, FD Viewer panelinde DNA yapısının teorik olarak genişletilebilir solucan benzeri bir zincir modelini otomatik olarak çizecek olan Referans Model paneline DNA uzunluğunu ve doğru sıcaklık değerini girdiğinizden emin olun. İki boncuk arasında tek bir DNA molekülü yakalanırsa, DNA'nın kuvvet uzama davranışı, çizilen uzayabilir solucan benzeri zincir modeliyle yakından eşleşmelidir. Yazılımın otomatik olarak teorik olanın üzerine çizeceği deneysel kuvvet-uzama eğrisini izleyerek durumun böyle olduğundan emin olun.
         NOT: Teorik modelden sapmalar, boncuklar arasına bağlı çoklu DNA moleküllerinin varlığını ve/veya DNA'ya bağlı ve onu sıkıştıran protein agregatlarının varlığını gösterebilir. Proteinlerin DNA'dan kuvvet aracılı ayrışmasını önlemek için, bu ilk test sırasında 10 pN'lik bir gerilimi aşmayın.
   5. Boncukları Kanal 3'e taşıyın ve tüm kanallardaki akışı hemen durdurun. Objektifte ölçüldüğü gibi 3 μW gücünde 561 nm lazerle aydınlatan CMG'nin varlığını doğrulamak için Kanal 4'te tek karelik bir test taraması yapın. Uyarma lazerleri panelinde görüntüleme lazer güçlerini ayarlayın. Varsa, CMG, Şekil 1G ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi iki boyutlu kırınım sınırlı noktalar olarak görünecektir.
      1. DNA yakalanamazsa, kanal 2'deki akışı yavaşlatabilecek kabarcıklar için kanal 2'yi kontrol edin (kanal 1 ve 3'e kıyasla). Kabarcıklar varsa, kabarcıkları akıtmaya çalışmak için kanal 2'deki basıncı 1 bar'a yükseltin.
   6. CMG varsa, görüntüleme için DNA bağını kanal 4 veya 5'e taşıyın; Aksi takdirde, akışı tekrar açın, boncukları atın ve Adım 2.2.4'e geri dönün.
   7. 4. veya 5. kanallarda, DNA bağında 2 pN'lik bir başlangıç gerilimi elde etmek için boncuklar arasındaki mesafeyi ayarlayın. Bunun için Kuvvet Spektroskopisi paneline 2 pN girin ve bir kuvvet kelepçesi başlatmak için Etkinleştir düğmesine tıklayın. İlk gerilim 2 pN'ye ulaştığında, Kuvvet Spektroskopisi panelindeki Etkinleştir düğmesine tıklayarak görüntülemeden önce kuvvet kelepçesini devre dışı bırakın.
   8. Görüntü CMG^Cdc45-LD555, objektifte ölçüldüğü gibi 4 μW gücünde 561 nm lazerle her 5 saniyede bir (Şekil 1F). Bunun için Image scan (Görüntü taraması) panelindeki Start Scan (Taramayı Başlat) düğmesine tıklayın. Bu tür taramalarda CMG, Şekil 1G'deki örnekte olduğu gibi iki boyutlu kırınım sınırlı noktalar olarak gösterilecektir.
      1. CMG gözlenirse ancak ağartmadan önce hareket etmiyor gibi görünüyorsa, nükleaz aktivitesi için kullanılan tüm proteinleri test edin, çünkü DNA üzerindeki çentikler CMG'nin DNA^41'den ayrılmasına neden olarak görünür işlemselliğini ciddi şekilde azaltır.
         NOT: Burada kullanılan ticari mikroskop kullanılıyorsa, 4 μW'lık bir lazer gücü tutarlı sonuçlar vermelidir. Ev yapımı bir kurulum kullanıyorsanız, optimum lazer gücünü ampirik olarak tahmin etmenizi öneririz. Optimal bir lazer gücü, florofordan istenen hassasiyetle lokalize etmek için yeterli sinyal vermeli ve deneyin istenen zaman aralığına yakın bir florofor ömrü vermelidir.
         NOT: Bu yayın, hibrit topluluk ve tek moleküllü teste odaklansa da, daha önce bu testle oluşturulan verilerin analizinin kapsamlı bir açıklamasını yayınlamıştık⁴⁸.

Sonuçlar

Doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, burada açıklanan protokol neredeyse agrega içermeyen DNA:CMG kompleksleri vermelidir. Agregasyonsuz bir reaksiyon, mikroakışkan akış hücresindeki kanalların hiçbirini tıkamamalı ve sıkışmış DNA moleküllerini, DNA'yı kırmadan kontur uzunluğunun 'u içinde uçtan uca bir uzantıya germek mümkün olmalıdır. Tersine, reaksiyonda toplanma varsa, DNA molekülleri bazen agregalar tarafından sıkıştırılabilir ve gerilirse genellikle DNA kırılmasına neden olabilir. Protein agregatlarını tanımanın iyi bir yolu, DNA'nın 2D taramalarına bakmaktır. Topaklanmasız bir reaksiyonda, CMG, Şekil 2A'da gösterilen taramalarda olduğu gibi, DNA'yı seyrek olarak kalabalıklaştıran ayrık, simetrik kırınım sınırlı noktalar olarak görünür. Aksine, agregalar daha az ayrıktır, bazen Şekil 2B'de gösterilen taramalarda olduğu gibi DNA'nın daha büyük bir uzunluğunu dolduran asimetrik lekelerdir. Ayrıca, test başarılı bir şekilde yürütülürse ve saflaştırılmış proteinlerin yüksek saflığı elde edilirse, Şekil 2C'de gösterilen kimografide gözlemlendiği gibi, ATP varlığında CMG'nin uzun menzilli hareketi görülecektir.

Şekil 1: Tamamen yeniden yapılandırılmış CMG'nin hareketini görüntülemek ve ölçmek için hibrit topluluk ve tek moleküllü tahlilin resimli açıklaması. (A) Doğal olarak oluşan bir ARS1 replikasyon kökeni içeren 23.6 kb'lık bir doğrusal DNA, her iki uçta desthiobiotin ve digoksigenin kısımları ile iki kat işlevselleştirilmiştir. (B) İki kat işlevselleştirilmiş DNA, destiyobiotin kısımları aracılığıyla streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanır. (C) CMG, fazla bağlanmamış protein ve protein agregatlarını uzaklaştırmak için farklı yıkama adımları dahil edilerek manyetik boncuk bağlı DNA üzerinde kademeli olarak monte edilir ve aktive edilir. (D) Bozulmamış DNA: CMG kompleksleri daha sonra, desthiobiotin-streptavidin etkileşimini geride bırakan fazla miktarda serbest biotin ilavesiyle manyetik boncuklardan ayrıştırılır. (E) Bireysel DNA: CMG kompleksleri, bir mikroakışkan akış hücresi yardımıyla iki anti-digoksijenin kaplı optik olarak hapsedilmiş polistiren boncuk arasına bağlanır. Dig-anti-Dig etkileşiminin biotin-avidin etkileşimlerine dik olduğunu, bu nedenle serbest biotin varlığından etkilenmediğini unutmayın. (F) Optik cımbız tarafından yerinde tutulduktan sonra, DNA: CMG kompleksleri farklı tampon koşullarına aktarılır, burada DNA düzlemi daha sonra CMG'nin zaman içindeki DNA boyunca hareketini görüntülemek için konfokal bir tarama lazeri ile taranır. (G) Üst panel, bir konfokal tarama lazeri ile taranan iki optik olarak hapsolmuş anti-Dig kaplı polistiren boncuk arasında yerinde tutulan bir DNA:CMG kompleksinin bir diyagramını gösterir. Alt panel, optik bir tuzak ile yerinde tutulan bir DNA'ya bağlı CMG'nin örnek bir 2D taramasını gösterir. DNA bu deneylerde etiketlenmemiştir, ancak görüntünün ortasından geçen yatay bir çizgi olarak düşünülebilir. Bu rakam^28'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Başarılı ve başarısız bir deneyden elde edilen veri örnekleri. (A) Agregasyonsuz bir numunede CMG içeren bir DNA'nın örnek 2D taramaları. Her iki taramada da CMG, DNA boyunca seyrek olarak dağılmış simetrik ve ayrık kırınım sınırlı noktalar gösterir. (B) Agregalar içeren bir numunede CMG içeren bir DNA'nın örnek 2D taramaları. Her iki taramada da CMG, DNA'yı kalabalıklaştıran daha az simetrik lekeler oluşturur. (C) ATP varlığında zaman içinde CMG kırınımı sınırlı noktaların DNA üzerindeki konumunu gösteren, CMG komplekslerinin uzun menzilli hareketini gösteren kimografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kritik adımlar ve önemli reaktif kalite kontrolleri
Testteki kritik adımlar ve biyolojik reaktif kalite kontrolleri burada vurgulanmıştır. İlk olarak, kullanılan proteinlerin saflığı önemlidir, çünkü protein örneklerindeki küçük nükleaz kirleticilerinin bile neden olduğu DNA bozulması verileri olumsuz yönde etkileyecektir. Bunun nedeni, çift ışınlı optik cımbızda yalnızca sağlam (veya kısmen çentikli) DNA moleküllerinin hapsedilebilmesidir. Daha da önemlisi, DNA üzerindeki çentikler CMG'nin^41'i ayrıştırmasına neden olacak ve CMG'nin uzun menzilli hareketinin gözlemlenmesini zorlaştıracaktır. Her saflaştırılmış proteinin nükleaz aktivitesi açısından test edilmesinin yanı sıra, çentiklenmenin minimuma indirildiğinden emin olmak için başlangıç plazmid substratının bütünlüğünün sürekli olarak izlenmesini şiddetle tavsiye ederiz. İkinci önemli adım, DNA:CMG komplekslerinin elüsasyonunu takiben manyetik boncukların dikkatli bir şekilde çıkarılmasıdır. Bu adımdaki süpernatant çıkarma, toplanan boncukları bozmamak için yavaşça yapılmalıdır. Optik cımbıza akan numunede manyetik boncuklar bırakılırsa, bunlar genellikle optik olarak sıkışmış polistiren boncuklara çarparak optik tuzaktan kaçmalarına ve veri toplamayı zorlaştırmalarına neden olur. Son olarak, DNA:CMG kompleksleri optik cımbızda dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu amaçla, kuvvet uygulaması CMG'yi DNA'dan ayırabileceğinden, DNA'nın gerginliğini 10 pN'nin üzerine çıkarmamanızı öneririz. Ayrıca, mikroakışkan akış hücresindeki kanallar arasında hareket, ortaya çıkan sürükleme kuvvetlerinin CMG'yi DNA'dan ayırmasını önlemek için mümkün olduğunca yavaş (~ 0.2 mm / s) yapılmalıdır.

Yöntemin modifikasyonları
Testin değiştirilebilecek birkaç adımı vardır. Örneğin, elüsyon verimini önemli ölçüde etkilemeden elüsyon süresinin 60 dakikadan 30 dakikaya düşürülebileceğini gösterdik. Ek olarak, CMG'nin DNA uçlarından yayılmasını önlemek ve genel olarak CMG^28'i stabilize etmek için elüsyon tamponunun düşük (1 mM'nin altında) ATP veya ATPγS konsantrasyonu ile desteklenmesini öneririz. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz tampon bileşimleri ve protein konsantrasyonları, önceki topluluk biyokimyasal ve tek moleküllü çalışmada^11,18 kullanılanlara dayanmasına rağmen, tanımladığımız tahlil, CMG 26,27'yi birleştirmek için diğer protokollerle tamamen uyumludur. Bu nedenle, CMG montajının veya aktivasyonunun verimliliğini arttırdığı bildirilen herhangi bir biyokimyasal ilerleme, verimi artırmak için testin toplu kısmında uygulanabilir ve uygulanmalıdır. Son olarak, çerçeveler arasındaki sürenin arttırılması, CMG'nin görüntülenebileceği toplam süreyi artırarak, florofor ağartma işleminden önce uzun menzilli CMG hareketinin gözlemlenmesini kolaylaştırır.

Yöntemin sınırlamaları
Tanımladığımız hibrit yöntem, CMG'nin yalnızca toplu olarak etkinleştirilmesinin ardından görüntülenebilmesi bakımından sınırlıdır. CMG'nin aktivasyonunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için daha fazla çalışma gerekecektir. Bir diğer önemli sınırlama, CMG'nin ^17,26,27 çiftleri halinde birleştirilmesini beklerken, gözlemlediğimiz DNA başına toplam CMG kompleksi sayısının çoğunlukla bir²⁸ olmasıdır, bu da CMG'nin veya en azından Cdc45'in hassas DNA'nın işlenmesi sırasında DNA'dan ayrıldığını düşündürmektedir: CMG kompleksleri. Tek moleküllü görüntülemeden önce işleme adımlarının sayısının azaltılmasının yanı sıra, mikroakışkan akış hücresinin plastik boruları ve camı için daha iyi pasivasyon stratejileri geliştirmek bu verimi artırmaya hazırdır.

Yöntemin önemi
CMG'nin tek moleküllü hareket çalışmaları, şimdiye kadar hücrelerden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden aktive edilmiş CMG'yi kullanmıştır. Nispeten daha basit olsa da, bu önceden etkinleştirilmiş CMG yaklaşımı, CMG aktivasyonuna yol açan adımların yanı sıra CMG'nin çift yönlü doğasını ve replisome hareketini kaçırması nedeniyle sınırlıdır. Öte yandan, CMG montajının ve aktivasyonunun tam olarak yeniden yapılandırılması, herhangi bir aktivasyon öncesi adımı incelemenin yanı sıra CMG hareketini çift yönlü bir şekilde inceleme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın toplu biyokimyasal seviyeden tek molekül seviyesine çevrilmesi daha zordur, çünkü çok daha fazla saflaştırılmış protein faktörü ve adımı içerir. Burada tanımladığımız tahlil, tek molekül seviyesinde tamamen yeniden yapılandırılmış CMG'nin hareketini görüntülememize izin vererek, daha önce kaçırılan bazı aktivasyon öncesi dinamiklere erişmemize izin vererek bu zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı oldu²⁸. Ek olarak, çoğunlukla DNA başına bir CMG görmemize rağmen, zıt yönlerde hareket eden iki CMG kompleksinin birkaç örneğini gözlemleyebildik ve hatta kardeş CMG'lerin birbirinden ilk ayrılmasını bile yakalayabildik²⁸, bu da çift yönlü replikasyonun kurulmasına dair bazı bilgiler sağladı.

Bu testin önceki CMG hareketine kıyasla bir başka avantajı, kullandığımız DNA substratının tamamen çift sarmallı doğasında yatmaktadır (Şekil 1A). Önceki önceden aktive edilmiş CMG çalışmasında, CMG'yi DNA substratına bağlamanın en yaygın yolu 3' ssDNA flebidir. Bu, burulma ile kolayca sınırlandırılamayan bir DNA yapısı ile sonuçlanır ve bu nedenle, replisome ilerlemesinde süper sarmanın rolünün araştırılmasını yasaklar. Tersine, burada tanımladığımız yeni yaklaşım, kullanılan DNA substratı tamamen çift sarmallı olduğundan, bu süreçte torkun rolünü incelemek için uyarlanma potansiyeline sahip olabilir.

Yöntemin daha geniş uygulamaları
Açıklanan hibrit tahlil, tam bir ökaryotik yanıtın tam olarak yeniden yapılandırılmasına giden yolu açacak ve bize ve diğerlerine, yanıtlayıcının tüm farklı görevlerinde başarılı olmasını sağlayan önemli dinamikleri gözlemlememize ve ölçmemize olanak tanıyacaktır. DNA replikasyonu bir yana, rapor ettiğimiz tahlil, karmaşık bir biyokimyasal reaksiyonun toplu biyokimyasaldan tek molekül seviyesine çevrilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil ediyor. Bu tahlilin, farklı DNA işleme mekanizmalarında yer alan benzer şekilde karmaşık DNA: protein etkileşimlerini incelemek için kolayca değiştirilebileceğini tahmin ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AflII	NEB	R0520L
Anti-digoxigenin kaplı polistiren boncuklar	Spheroteck	DIGP-20-2
ATP çözeltisi	Thermo Fisher	R0441
ATP ve gama; S	Roche	11162306001
BSA	NEB	B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Tampon	NEB	B6004S	AflII
dCTP	Promega	U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP	ile Sağlanan Jena Bioscience	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigenin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin manyetik boncuklar	Invitrogen	11205D
Klenow Parçası (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR döndürme kolonları	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S,	Klenow Fragment
Nonidet ile Sağlanır ve nbsp; P 40 Yedek	Sigma	74385
Pluronic F-127	Sigma	P2443