Method Article

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV), hücre kaynaklı, lipid çift tabaka kapalı, kopyalanamayan nanopartiküllerdir. EV, hücreler arası iletişimi düzenlemedeki rolleri nedeniyle şu anda kardiyovasküler araştırmalarda dikkat çekmekte ve potansiyel olarak kardiyovasküler hastalık için değerli biyobelirteçler olarak hizmet etmektedir. Bununla birlikte, EV proteomu ve kardiyovasküler teşhiste bir biyobelirteç olarak potansiyeli tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, büyük bir üniversite hastanesinin Göğüs Ağrısı Ünitesine başvuran hastalardan alınan plazma örnekleri kullanılarak plazma kaynaklı EV'nin izolasyonu ve miktarının belirlenmesi ve protein kargolarının analizi için standart bir yöntem sunar. Rutin flebotomi sonrası EV, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile plazmadan izole edilir. EV izolatlarındaki spesifik EV işaretleyici proteinlerinin zenginleşmesi, immünoblotlama ile görselleştirilir ve ortalama boyut dağılımı ve plazma EV konsantrasyonları, nanopartikül izleme analizi ile ölçülür. Son olarak, EV proteomunun etiketsiz analizi için ultra performanslı sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi kullanılır. Bu nedenle bu protokol, plazmadan türetilmiş EV'leri kritik biyolojik bilginin potansiyel taşıyıcıları olarak incelemek ve kullanmak ve ayrıca yeni biyobelirteçler olarak potansiyellerini keşfetmek için kapsamlı bir yaklaşım sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV), isimlendirme ile düzgün bir şekilde tanımlanmamış, bir lipid çift tabakası ile çevrili ve çeşitli hücre tipleri tarafından salınan,1'i çoğaltma yeteneğinden yoksun nanopartiküllerdir. Bu farklı grup, tipik olarak çapı yaklaşık 40 nm ila 160 nm arasında değişen, endozomal kökenli EV'nin bir alt popülasyonu olan eksozomları içerir2. Çok sayıda vücut sıvısındatespit edilebilen 3 EV'ler, proteinler, mRNA, mikroRNA ve lipitler gibi çeşitli aktif biyomolekülleri transfer ederek hücreler arası iletişimi kolaylaştırır. Bu nedenle, EV, hücreye özgü yüzey belirteçleri ve biyomoleküller aracılığıyla köken hücreleri hakkında bilgi sağlar ve özellikleri ana hücrenin ve çevresinin durumundan güçlü bir şekilde etkilenir4. Bu özellikler, özellikle kardiyovasküler hastalıklar bağlamında, EV'nin biyobelirteçler olarak potansiyel rolüne artan bir ilgiye yol açmıştır.

Çok sayıda in vitro ve in vivo çalışma, miyokardiyal hipoksik stresin EV 5,6,7'nin artmasına neden olduğunu göstermiştir. EV kargosu ile ilgili çağdaş araştırmalar, büyük ölçüde, çeşitli kardiyovasküler hastalıkların teşhisinde bir biyobelirteç olarak hizmet etme potansiyeline sahip olan EV'ye bağlı mikroRNA'ya odaklanmıştır 8,9,10. Buna karşılık, dolaşımdaki EV proteomu ile ilgili kanıtlar nispeten az kalmaktadır ve kardiyovasküler hastalarda plazma EV'yi araştıran daha az çalışma vardır. Miyokard enfarktüsü geçiren hastalardan plazma kaynaklı EV üzerine yapılan iki kapsamlı çalışmada, yazarlar potansiyel tanısal önemiolan spesifik bir iskemi kaynaklı EV proteom profili tanımladılar 6,11.

EV'nin metodolojik olarak işlenmesinin tarihsel olarak zorlu olduğu kanıtlanmıştır ve şu anda EV izolasyonu, karakterizasyonu ve nicelleştirmesi için en uygun yaklaşım için kesin bir öneri yoktur. EV izolasyonu için yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında diferansiyel ultrasantrifüjleme, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisi1 gibi filtrasyon yöntemleri bulunur. Mevcut konsensüs yönergelerine göre, EV izolatlarının karakterizasyonu, bir görüntüleme yöntemi1 ile birlikte tetraspaninler veya eksüinler gibi en az üç tipik EV yüzey proteini markörünün kanıtını içermelidir. EV kargosunu protein düzeyinde incelemek için en sık Western blot veya ELISA gibi antikor bazlı yöntemler kullanılır.

Dolaşımdaki EV'nin izolasyonu ve işlenmesi ile ilgili metodolojik zorluklar göz önüne alındığında, bu protokol hasta alımı ve numune toplamadan müteakip EV izolasyonuna, plazma EV izolatlarının karakterizasyonuna ve miktar tayinine kadar kapsamlı bir yol sunar. Ek olarak, bu çalışma, güneybatı Almanya'daki bir üçüncü basamak bakım merkezinde acil servise (Göğüs Ağrısı Ünitesi) başvuran hastalardan plazmadan türetilmiş EV'nin anında izolasyonu için bir iş akışını ve ardından sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanılarak hastalığa özgü plazma EV proteomunun etiketsiz analizini göstermektedir. Amaç, ilk tanıda ve hastalığın ilerlemesi ve/veya çözünürlüğü boyunca çeşitli iskemik, konjenital veya (oto-)immün kardiyovasküler hastalıkları olan geniş bir hasta kohortunda farklı şekilde zenginleştirilmiş EV'ye bağlı proteinleri tanımlamak için yüksek verimli bir analizi kolaylaştırmaktır. Bu proteomik tarama yaklaşımı, kardiyovasküler hastalıkta mevcut teşhis ve terapötik izlemeyi geliştirmek için EV'ye bağlı yeni protein biyobelirteçlerini ortaya çıkarmak nihai hedefi ile farklı hastalık yolaklarıyla ilişkili EV'ye özgü protein zenginleştirme modellerini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için, belirgin veya altta yatan kardiyovasküler hastalık belirtisi olmayan üç sağlıklı kontrol hastası ve ST dışı yüksek miyokard enfarktüsü (NSTEMI) olan iki hastadan oluşan örnek bir hasta kohortu işe alındı. Heidelberg Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından önceden onay verildi (IRB onayı #S-351/2015) ve işe alımdan önce tüm hastalardan yazılı onay alındı. Hastalar, Heidelberg Üniversite Hastanesi Kardiyoloji Anabilim Dalı Göğüs Ağrısı Ünitesi'nden ilk klinik sunum, tıbbi öykü ve tanısal test sonuçlarına göre alındı.

Sağlıklı kontrol hastaları için dahil edilme kriterleri arasında atipik veya nonspesifik klinik görünüm, normal sınırlar içinde kardiyak biyobelirteç seviyeleri, kardiyovasküler hastalık öyküsü olmaması ve daha ileri tanı testlerinde normal bulgular vardı. Dışlama kriterleri arasında son beş yıl içinde malignite veya sitostatik tedavi öyküsü, hemodiyaliz, ailesel hiperlipidemi sendromları ve herhangi bir kardiyovasküler hastalık öyküsü vardı. Güncel kılavuzlar12 izlenerek NSTEMI tanısı konuldu ve hemodinamik olarak anlamlı koroner stenoz koroner anjiyografi ile doğrulandı. Her hasta için, antekubital venden standart flebotomi13 yoluyla sitrat takviyeli toplama tüplerine 36 mL'ye kadar kan toplandı ve kan örnekleri daha sonraki işlemler için hemen 4 ° C'de taşındı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Diferansiyel santrifüjleme kullanarak EV izolasyonu

NOT: EV'yi insan plazma örneklerinden izole etmek için bir diferansiyel santrifüjleme protokolü kullanıldı. Elde edilen EV peletinin saflığını en üst düzeye çıkarmak için artan merkezkaç kuvvetine sahip iki ultrasantrifüjleme (UC) döngüsü gerçekleştirildi.

  1. Plazma izolasyonu
    1. Plazma EV bütünlüğünü sağlamak için toplandıktan sonraki 120 dakika içinde 4 °C'de soğutulan tam kan örneklerini işlemeye başlayın. Pıhtılaşmayı önlemek için sitrat takviyeli kan alma tüpleri (0.106 mol/L sitrat) kullanın.
    2. Viskoziteyi azaltmak için 9 mL sitratlı tam kanı buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 1 oranında seyreltin. Santrifüjleme sırasında ayırmak için 5 mL yoğunluk gradyan ortamı (1.077 g / mL) ekleyin.
    3. 600 × g'da 4 °C'de 25-30 dakika santrifüjleyin. Plazma fraksiyonunu her bir sütunun üstünden özel santrifüj tüplerine dikkatlice pipetleyin. Sonraki adımlara geçin veya -80 °C'de dondurun.
  2. Hücre kalıntılarının ve apoptotik cisimlerin uzaklaştırılması
    1. Plazmayı 20.000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca sabit açılı rotorlu bir ultrasantrifüj kullanarak, frenlemeden santrifüjleyin. Tüpün dibinde görünür bir hücre kalıntısı ve apoptotik cisim peleti oluşmalıdır.
  3. EV izolasyonu
    1. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Tüp duvarında görünür bir pelet oluşturacak olan EV'yi izole etmek için 4 ° C'de 2 saat boyunca 100.000 × g'da frenleme yapmadan ultrasantrifüj edin.
    2. Elektronik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve yaklaşık 1 mL EV tükenmiş plazma bırakın. Kalan plazma için 1000 μL'lik bir pipete geçin ve EV peletini rahatsız etmemek için yavaşça pipetleyin. Tüpte plazma kalmadığından emin olmak için pipetleme sırasında tüpü kademeli olarak eğin.
  4. Aşağı akış analizi için hazırlık
    1. İzole edilmiş EV peletini aşağı akış analiz gereksinimlerine göre yeniden süspanse edin: nanopartikül takibi için, EV peletini 200 μL PBS'de 9 mL tam kandan yeniden süspanse edin; LC-MS/MS için,% 1 proteaz / fosfataz inhibitörü ile 50 μL 1x RIPA tamponunda 36 mL tam kandan izole edilen EV'yi yeniden askıya alın
    2. Yeniden askıya alınmış EV peletini 1.5-2 mL'lik bir tüpe aktarın. Daha fazla analize kadar -80 °C'de saklayın veya gerektiği kadar devam edin.

2. Nanopartikül izleme analizi

NOT: İnsan plazma örneklerinde ortalama EV boyut dağılımının nicelleştirilmesi, nanoparçacıkların Brown hareketini analiz eden lazer tabanlı bir algılama yöntemi olan Nanoparçacık İzleme Analizi (NTA) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

  1. NTA için çalışma dilüsyonları
    1. EV stok çözeltisini (200 μL PBS'de yeniden süspanse edilmiş EV peleti) buz gibi soğuk PBS ile 1:10, 1:50, 1:100 ve 1:200 oranlarında seyreltin. Nanoparçacık izleme sırasında çerçeve başına 10-100 nanoparçacıklık bir nihai sayım elde etmek için en uygun seyreltmeyi belirlemek için çeşitli çalışma seyreltmeleri oluşturun.
  2. NTA'yı çalıştırma
    1. NTA cihazını açın ve bağlı bilgisayarda ilgili yazılımı başlatın. Hazneyi lazer tabutunun içine yerleştirin ve etkinleştirmek için Kamerayı Başlat'a tıklayın.
    2. Bir şırıngaya 1 mL PBS çekin. Şırıngayı ön boruya takın ve haznede hava kalmadığından emin olarak boru sistemini iyice yıkayın. Herhangi bir hava kabarcığı veya kirletici parçacık tespit etmek için kamerayı izleyin.
    3. Hazırlanan EV çalışma seyreltmesini 1 mL'lik bir şırınga içinde hazırlayın ve hazneye enjekte edin.
    4. Ekran Kazancı'nı, Capture (Yakala) ve Process (İşleme) sekmelerinde monitörün parlaklığıyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Nanopartikülleri ekranda net bir şekilde ayırt etmek için Kamera Seviyesini değiştirin.
    5. Parçacıkları arka plan gürültüsünden ayırt etme hassasiyetini ayarlamak için İşlem sekmesinde uygun bir Algılama Eşiği ayarlayın. Aynı deney içindeki tüm ölçümler için bu değeri sabit tutun.
    6. Nanopartiküller ekranda keskin görünene kadar cihazın her iki yanındaki tekerleği kullanarak kamerayı odaklayın.
    7. Brown hareketi sıcaklığa bağlı olduğundan, Donanım ayarlarındaki tüm ölçümler için sabit bir sıcaklık (ideal olarak 22 °C) ayarlayın.
    8. Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Açılır pencereye numune kimliğini ve çözücüyü girin.
    9. Her örnek çalıştırması için en az üç adet 30 sn video kaydedin. Nanopartikül çözeltisinin temsili bir örneğini yakalamak için numuneyi ölçümler arasında ilerletin. Bir şırınga pompası varsa, sabit bir hıza ayarlayın ve sürekli olarak kaydedin.
    10. Kayıttan sonra, yazılım nanopartiküllerin konsantrasyonunu ve boyut dağılımını otomatik olarak hesaplar. Örnek için kullanılan seyreltme faktörünü girmek için Değiştir'e tıklayın ve ardından Dışa Aktar'a tıklayarak sonuçları kaydedin.
  3. Veri analizi
    1. İstatistiksel bir yazılım programındaki çıktı dosyalarını kullanarak sonuçları analiz edin.

Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi

NOT: Etiketsiz EV proteom analizi, membran lizizini takiben EV proteinlerinin jel elektroforezi yoluyla ilk protein ayrımı kullanılarak gerçekleştirildi. Tripsin ile jel içi protein sindiriminden sonra, peptitler, bir insan proteom veri tabanıyla eşleştirilen bireysel spektrumlarla LC-MS/MS kullanılarak analiz edildi. Özellikle, EV lizatlarının hedeflenmemiş bir analizi isteniyorsa, önceden belirli bir moleküler ağırlık aralığı seçilmeden av tüfeği proteomikleri önerilir ve bu protokolün 3.1.1-3.1.7 adımlarını gereksiz kılar.

  1. Jel içi tripsin sindirimi
    1. Üreticinin talimatlarına göre Laemmli yükleme tamponu ekleyerek 1x RIPA tamponunda yeniden süspanse edilmiş bir EV çözeltisi hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
    2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için %4-12 Bis-Tris jellerinin üzerine yükleme tamponu ile desteklenmiş EV numunelerini bir protein merdiveni ile birlikte yükleyin14. Protein bantlarını görselleştirmek için jeli Coomassie Blue ile 1-4 saat boyayın. Gece boyunca inkübe ederek jeli suyla lekeleyin.
    3. Bir neşter bıçağı kullanarak ilgilenilen proteinleri içeren jel bölgelerinden Coomassie lekeli bantları çıkarın.
    4. Jel parçalarını 60 μL 1:1 (h/h) 50 mM trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB) ve asetonitril (ACN), pH 8.5 ile 10 dakika yıkayın. Jel parçalarını 60 μL ACN'de her biri 10 dakika boyunca üç kez küçültün. 60 μL 50 mM TEAB, pH 8.5 ile tekrar yıkayın.
    5. Proteinleri 100 mM TEAB'de 100 mM TEAB'de 57 dakika boyunca 30 mM ditiotreitol (DTT) ile azaltın ve jel parçalarını kurutun.
    6. Proteinleri 10 mM iyodoasetamid (IAA) ile 100 mM TEAB içinde 25 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca alkilleyin.
    7. Jel parçalarını 60 μL 100 mM TEAB ile yıkayın ve her biri 60 μL ACN'de 10 dakika boyunca iki kez küçültün.
    8. Kuru jel parçalarına uygun şekilde konsantre edilmiş 50 mM TEAB tripsin çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin. 20 μL %0.1 trifloroasetik asit (TFA) ekleyerek reaksiyonu söndürün.
    9. Elde edilen peptitleri 30 μL 1: 1 (h / v)% 0.1 TFA ve ACN ile 30 dakika inkübe ederek ekstrakte edin. Jelleri 20 μL ACN ile 20 dakika kurutun, ardından 30 μL 100 mM TEAB ile 20 dakika tekrar yıkayın.
    10. Jeli her biri 20 dakika boyunca 20 μL ACN ile iki kez küçültün.
    11. Her ekstraksiyon adımından toplanan süpernatanı bir vakum santrifüjünde konsantre edin ve numuneyi 15 μL% 0.1 TFA'da çözün.
  2. LC-MS/MS analizi
    1. Elektrostatik iyon tuzağı analizörüne bağlı yüksek çözünürlüklü bir sıvı kromatografisi kütle spektrometresi kullanarak nanoflow LC-MS/MS analizi gerçekleştirin.
    2. Çözücü A olarak% 0.1 formik asit (FA)/% 1 ACN ve çözücü B olarak% 0.1 FA /% 89.9 ACN kullanın.
    3. Peptitleri 25 dakikalık doğrusal bir gradyanda ayırın:% 3 çözücü B'den başlayın,% 21 dakika boyunca% 23'e, daha sonra 4 dakikada% 38'e yükseltin ve% 95 B'de bir yıkama ile devam edin.
    4. Kütle spektrometresini, MS ve MS2 arasında otomatik olarak geçiş yaparak veriye bağlı toplama modunda çalıştırın. m/z 400'de 60.000 çözünürlüğe sahip MS spektrumları (m/z 400-1600) elde edin, 27 m/z normalleştirilmiş çarpışma enerjisi ve 1,4 m/z izolasyon genişliği kullanarak 15 öncüye kadar MS2 spektrumu oluşturun.
  3. Protein veritabanı araması
    1. Sequest HT ile Proteome Discoverer 2.5 kullanarak MS/MS spektrumlarını Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, Haziran 2020) protein veritabanına ve özelleştirilmiş bir kirletici veritabanına (MaxQuant, MPI Martinsried 15,16'nın bir parçası) karşı arayın.
    2. Program ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın: parça iyon kütle toleransını 0,02 Da'ya ve ana iyon kütle toleransını 5 ppm'ye ayarlayın. Tripsin'i sindirim için kullanılan enzim olarak belirtin ve karbamidometili, değişken modifikasyonlar olarak oksidasyon (metiyonin) ve deamidasyon (asparagin, glutamin) ile sistein için sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın. Asetilasyon, metiyonin kaybı ve bunların kombinasyonlarını protein terminalinin değişken modifikasyonları olarak dahil edin.
    3. Protein bolluğu hesaplaması için En İyi N Ortalama (n = 3) yöntemini kullanarak, öncü iyon niceleyici modunu kullanarak peptitleri ölçün17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV, açık kardiyovasküler hastalığı olmayan hastaların plazma örneklerinden (n = 3) ve ayrıca ST yükselmemiş miyokard enfarktüsü (NSTEMI; n = 2) olan hastalardan, yerleşik diferansiyel ultrasantrifüj protokolü kullanılarak izole edildi. Plazma EV'nin yeterli ayrılması, aynı hastalardan alınan EV tükenmiş plazmaya kıyasla EV izolatlarında EV ile zenginleştirilmiş proteinler TSG-101, annexin 5 (Anx5) ve CD9'un immünoblotlanması ile doğrulanmıştır (Şekil 1A). Negatif bir kontrol görevi gören tra...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, plazma EV'nin ayrılması ve karakterizasyonu için gerçek dünyada, adım adım, kullanıma hazır bir metodolojinin yanı sıra rutin klinik uygulamaya entegrasyon için uygun, etiketlenmemiş bir proteom analizine giriş sağlar. Plazma örneklerinden EV izolasyonu için ayrıntılı bir açıklama ve birleşik bir metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmak, elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için önemlidir. Mevcut literatür, pre-analitik koşulların, EV izolatlarının sonraki ölçü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG, Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim'dan öğretim görevlileri için onur ödülü aldı; Roche Diagnostik ve Daiichi Sankyo'dan kurumsal araştırma hibeleri almış olup, sunulan çalışma dışında Roche Diagnostik, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis ve Boehringer Ingelheim için danışman olarak görev yapmaktadır. JBK, Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK) ve Roche Diagnostics'ten projeyle ilgili fon aldı. Kalan yazarlar, gönderilen çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu proje sırasındaki organizasyonel destekleri için Heidi Deigentasch, Amelie Werner ve Elisabeth Mertz'e teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli numune parlatıcısıBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Ultrasantrifüjleme için Kapak Tertibatlı 26.3 mL Polikarbonat ŞişeBeckman Coulter355654
5810R Masaüstü santrifüjEppendorf5811000015
Asetonitril (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Sigma-AldrichD8537
Formik Asit %99 ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
İyodoasetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Kütle Spektrometresi Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS çalışan tamponThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalitik NS300
Nanosight NTA 3.2 YazılımıMalvern Panalitical 
NuPAGE 4  bis 12 %, Bis-Tris protein jelleriInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 yerde duran ultrasantrifüjBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Boyalı Protein MerdiveniThermo Fisher Scientific26619
Proteaz/Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi5872S
Protein işaretleyiciThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap Kütle SpektrometresiThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Hızlı leke coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & mikro; m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE ticari jelThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l %3,2Sarstedt02.1067.001
Hızlı vakum yoğunlaştırıcıSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, Haziran 2020) protein veritabanıUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifloroasetik asit (TFA) HPLC için >%99, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Tripsin MS SınıfıThermo Fisher90058
Tip 50.2 Ti Sabit Açılı RotorBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
SuBiosolve0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367, 6478(2020).
  3. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).
  4. Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).
  5. Ontoria-Oviedo, I., et al. Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility. Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).
  6. Zara, M., et al. Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest. Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).
  7. Anselmo, A., et al. Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release. Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).
  8. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review. Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).
  9. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).
  10. Deddens, J. C., et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).
  11. Gidlof, O., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone. Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).
  12. Byrne, R. A., et al. ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).
  13. Garcia-Castrillo, L., et al. Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase. Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment. J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  16. Cox, J., Mann, M. Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Blein-Nicolas, M., Zivy, M. Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics. Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).
  18. Lacroix, R., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop. J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  19. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  20. Lacroix, R., et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol. J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).
  21. Coumans, F. aW., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  22. Clayton, A., et al. Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).
  23. Lucien, F., et al. Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).
  24. Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions. PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).
  26. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).
  27. Davidson, S. M., et al. Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles. Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).
  28. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  29. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  30. Palviainen, M., et al. Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery. PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).
  31. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  32. Gemoll, T., et al. Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation. J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).
  33. Kreimer, S., et al. Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics. J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Bateman, N. W., et al. Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda). Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).
  36. Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries. Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles