Method Article

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV), hücre kaynaklı, lipid çift tabaka kapalı, kopyalanamayan nanopartiküllerdir. EV, hücreler arası iletişimi düzenlemedeki rolleri nedeniyle şu anda kardiyovasküler araştırmalarda dikkat çekmekte ve potansiyel olarak kardiyovasküler hastalık için değerli biyobelirteçler olarak hizmet etmektedir. Bununla birlikte, EV proteomu ve kardiyovasküler teşhiste bir biyobelirteç olarak potansiyeli tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, büyük bir üniversite hastanesinin Göğüs Ağrısı Ünitesine başvuran hastalardan alınan plazma örnekleri kullanılarak plazma kaynaklı EV'nin izolasyonu ve miktarının belirlenmesi ve protein kargolarının analizi için standart bir yöntem sunar. Rutin flebotomi sonrası EV, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile plazmadan izole edilir. EV izolatlarındaki spesifik EV işaretleyici proteinlerinin zenginleşmesi, immünoblotlama ile görselleştirilir ve ortalama boyut dağılımı ve plazma EV konsantrasyonları, nanopartikül izleme analizi ile ölçülür. Son olarak, EV proteomunun etiketsiz analizi için ultra performanslı sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi kullanılır. Bu nedenle bu protokol, plazmadan türetilmiş EV'leri kritik biyolojik bilginin potansiyel taşıyıcıları olarak incelemek ve kullanmak ve ayrıca yeni biyobelirteçler olarak potansiyellerini keşfetmek için kapsamlı bir yaklaşım sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV), isimlendirme ile düzgün bir şekilde tanımlanmamış, bir lipid çift tabakası ile çevrili ve çeşitli hücre tipleri tarafından salınan,1'i çoğaltma yeteneğinden yoksun nanopartiküllerdir. Bu farklı grup, tipik olarak çapı yaklaşık 40 nm ila 160 nm arasında değişen, endozomal kökenli EV'nin bir alt popülasyonu olan eksozomları içerir2. Çok sayıda vücut sıvısındatespit edilebilen 3 EV'ler, proteinler, mRNA, mikroRNA ve lipitler gibi çeşitli aktif biyomolekülleri transfer ederek hücreler arası iletişimi kolaylaştırır. Bu nedenle, EV, hücreye ö....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için, belirgin veya altta yatan kardiyovasküler hastalık belirtisi olmayan üç sağlıklı kontrol hastası ve ST dışı yüksek miyokard enfarktüsü (NSTEMI) olan iki hastadan oluşan örnek bir hasta kohortu işe alındı. Heidelberg Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından önceden onay verildi (IRB onayı #S-351/2015) ve işe alımdan önce tüm hastalardan yazılı onay alındı. Hastalar, Heidelberg Üniversite Hastanesi Kardiyoloji Anabilim Dalı Göğüs Ağrısı Ünitesi'nden ilk klinik sunum, tıbbi öykü ve tanısal test sonuçlarına göre alındı.

Sağlıklı kontrol hastaları için dahil edilme kriterl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV, açık kardiyovasküler hastalığı olmayan hastaların plazma örneklerinden (n = 3) ve ayrıca ST yükselmemiş miyokard enfarktüsü (NSTEMI; n = 2) olan hastalardan, yerleşik diferansiyel ultrasantrifüj protokolü kullanılarak izole edildi. Plazma EV'nin yeterli ayrılması, aynı hastalardan alınan EV tükenmiş plazmaya kıyasla EV izolatlarında EV ile zenginleştirilmiş proteinler TSG-101, annexin 5 (Anx5) ve CD9'un immünoblotlanması ile doğrulanmıştır (Şekil 1A). Negatif bir kontrol görevi gören tra.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, plazma EV'nin ayrılması ve karakterizasyonu için gerçek dünyada, adım adım, kullanıma hazır bir metodolojinin yanı sıra rutin klinik uygulamaya entegrasyon için uygun, etiketlenmemiş bir proteom analizine giriş sağlar. Plazma örneklerinden EV izolasyonu için ayrıntılı bir açıklama ve birleşik bir metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmak, elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için önemlidir. Mevcut literatür, pre-analitik koşulların, EV izolatlarının sonraki ölçü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG, Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim'dan öğretim görevlileri için onur ödülü aldı; Roche Diagnostik ve Daiichi Sankyo'dan kurumsal araştırma hibeleri almış olup, sunulan çalışma dışında Roche Diagnostik, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis ve Boehringer Ingelheim için danışman olarak görev yapmaktadır. JBK, Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK) ve Roche Diagnostics'ten projeyle ilgili fon aldı. Kalan yazarlar, gönderilen çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu proje sırasındaki organizasyonel destekleri için Heidi Deigentasch, Amelie Werner ve Elisabeth Mertz'e teşekkür eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli numune parlatıcısıBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Ultrasantrifüjleme için Kapak Tertibatlı 26.3 mL Polikarbonat ŞişeBeckman Coulter355654
5810R Masaüstü santrifüjEppendorf5811000015
Asetonitril (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Sigma-AldrichD8537
Formik Asit %99 ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
İyodoasetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Kütle Spektrometresi Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS çalışan tamponThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalitik NS300
Nanosight NTA 3.2 YazılımıMalvern Panalitical 
NuPAGE 4  bis 12 %, Bis-Tris protein jelleriInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 yerde duran ultrasantrifüjBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Boyalı Protein MerdiveniThermo Fisher Scientific26619
Proteaz/Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi5872S
Protein işaretleyiciThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap Kütle SpektrometresiThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Hızlı leke coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & mikro; m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE ticari jelThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l %3,2Sarstedt02.1067.001
Hızlı vakum yoğunlaştırıcıSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, Haziran 2020) protein veritabanıUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifloroasetik asit (TFA) HPLC için >%99, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Tripsin MS SınıfıThermo Fisher90058
Tip 50.2 Ti Sabit Açılı RotorBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
SuBiosolve0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles