Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67110

⸱

23 Ağustos 2024

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

Bu makalede

Özet

Bu protokol, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen DNA hasarının derecesini araştırmak için tasarlanmıştır. Nötr koşullar altında, DNA kırılmalarının indüksiyonu kısa bir zaman dilimi içinde kolayca değerlendirilebilir. Ek olarak, protokol diğer hücre tiplerine ve çeşitli replikasyon stres reaktiflerine uyarlanabilir.

Özet

DNA replikasyonu, DNA'ya zarar verebilecek çok çeşitli endojen ve eksojen stresörler tarafından sürekli olarak sorgulanmaktadır. Genom duplikasyonu sırasında karşılaşılan bu tür lezyonlar, replizomları durdurabilir ve replikasyon çatallarını çift iplikli kırılmalara dönüştürebilir. Onarılmadığı takdirde, bu toksik DNA kırılmaları kromozomal yeniden düzenlemeleri tetikleyebilir, bu da genom kararsızlığının artmasına ve hücresel dönüşüm olasılığının artmasına neden olabilir. Ek olarak, kanser hücreleri kalıcı replikasyon stresi sergiler ve bu da tümör hücrelerindeki replikasyon çatalı güvenlik açıklarının hedeflenmesini kemoterapi için çekici bir strateji haline getirir. Replikasyon sırasında DNA kırılmalarını incelemek için çok yönlü ve güçlü bir teknik, kuyruklu yıldız testidir. Bu jel elektroforez tekniği, tek hücre düzeyinde DNA kırılmalarının indüksiyonunu ve onarımını güvenilir bir şekilde tespit eder. Burada, araştırmacıların, birden fazla hücre tipinde çatal durdurucu ajanlar kullanarak insan hücrelerini mitotik olarak bölmedeki DNA hasarının derecesini ölçmelerine olanak tanıyan bir protokol özetlenmiştir. Bunu otomatik kuyruklu yıldız puanlaması ile birleştirmek, hızlı analizi kolaylaştırır ve DNA kırılmalarının indüksiyonunun incelenmesinde güvenilirliği artırır.

Giriş

Kuyruklu yıldız testi, tek hücre düzeyinde DNA kırılmalarını tespit etmek için kullanılan bir jel elektroforez yöntemidir. Açık uçlu DNA kırılmalarının elektroforetik koşullar altında göç etmesi, bozulmamış DNA'nın ise büyük ölçüde statik kalması ilkesine dayanır. Kırık DNA göç eder, çünkü kırılmalar süper sarmal DNA'nın gevşemesine neden olur ve elektroforetik odadaki anoda doğru kademeli olarak uzaysal yer değiştirmesine neden olur, bu da immünofloresan 1,2 tarafından gözlemlenen kuyruklu yıldız benzeri bir görünüme neden olur. DNA hasarının derecesi daha sonra kompakt DNA'ya göre göç eden kırık DNA miktarının ölçülmesiyle ölçülür.

En yaygın olarak kullanılan iki kuyruklu yıldız tahlili yöntemi, alkali kuyruklu yıldız (AC) tahlili ve nötr kuyruklu yıldız (NC) tahlilidir. AC testi, yüksek alkali pH çözeltisi kullanılarak denatüre etme koşulları altında gerçekleştirilirken, NC testi, nötr pH'lı bir çözelti içinde gerçekleştirilir. Hem NC hem de AC tahlilleri, çekirdekte meydana gelen DNA kırılmalarını güvenilir bir şekilde tespit edebilir. Bununla birlikte, alkali versiyon, alkali-kararsız bölgeleri tespit etmek için de avantajlıdır3. Testin her iki formatı da, elektroforezden önce DNA'nın protein içermediğinden emin olmak için lizis koşullarının kullanılmasını gerektirir.

Bu test, DNA kırılmalarını tespit etmek için basit bir yöntemdir ve hücresel DNA hasarını belirlemek için birkaç benzersiz avantaj sunar. Yöntemin kurulumu nispeten kolaydır ve laboratuvarda hazırlanabilen veya ticari satıcılardan satın alınabilen reaktifler gerektirir. Tek hücreli bir çözünürlük tekniği olarak, tahlil çok az başlangıç materyali gerektirir. Özellikle, NC testi, hücre başına 50 ila 10.000 kırılmayı tespit ettiği bildirilen yüksek hassasiyetle kırılmaları ölçebilir4. Bu tekniğin çok yönlülüğü, ekotoksikoloji5, insan biyoizleme6 ve genotoksisite çalışmaları7 dahil olmak üzere geniş uygulama yelpazesi ile gösterilmiştir. Test ayrıca çeşitli hücre tiplerinde güvenilir bir şekilde kullanılabilir ve yüksek verimli tahliller8 ve belirli genomik bölgelerdekikırılmaları değerlendirmek için 9 uyarlanabilir. Bu nedenle, bu tahlil, tek hücre düzeyinde kırılma oluşumunu araştırmak için hızlı ve güvenilir bir teknik olarak hizmet eder.

DNA replikasyonu süreci, çeşitli endojen ve eksojen stresörler tarafından sürekli olarak sorgulanmaktadır10,11. Bu tür lezyonlara bağlı olarak replizomların durması, DNA kırılmalarına neden olabilir ve genom kararsızlığının artmasına neden olabilir. DNA kırılmaları da sıklıkla DNA onarımını kolaylaştırmak için replikasyon ara ürünleri olarak ortaya çıkar12. Ek olarak, kamptoteksin (CPT)13,14,15 ve PARP inhibitörleri 16,17 gibi çeşitli kemoterapötik ajanlar, replikasyona bağlı çift iplikçik kırılmalarını (DSB'ler) indükler. Bu nedenle, bu tahlil, DNA lezyonlarının doğasını incelemek, replikasyon çatallarının işlenmesini değerlendirmek ve DNA'ya zarar veren ajanların terapötik potansiyelini araştırmak için güçlü bir metodoloji görevi görür. Yeni sentezlenmiş DNA'nın BrdU ile etiketlenmesini içeren testin adaptasyonları, replikasyonla ilişkili stres fenotiplerini incelemek için yararlı olmuştur 18,19,20,21. Özellikle, NC testi, çatal proteinlerininkarakterizasyonunu içeren çalışmalarda gösterildiği gibi, replikasyon bağlamında DNA kırılma indüksiyonunu incelemek için güvenilir bir yöntemdir 22,23, replikasyon ara ürünlerinin analizi24,25 ve genom bakımında transkripsiyon-replikasyon çatışmalarının araştırılması26,27. Burada, insan hücrelerinde replikasyon sırasında DNA kırılmalarını ölçmek amacıyla bir NC test protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, çok çeşitli bölünen insan hücrelerinde replikasyon stresi ile ilişkili hasarı değerlendirmekle ilgilenen araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol (Şekil 1) esas olarak yapışık U2OS kanser hücre hatlarını kullanır, ancak doku kültüründe yetiştirilen çok çeşitli yapışık ve süspansiyon hücrelerine uyarlanabilir. Bu çalışmada kullanılan çözeltiler ve tamponlar Tablo 1'de detaylandırılmıştır. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Deney gününden önce, agarozun tamamen eridiğinden emin olmak için verilen düşük erime noktalı agaroz (PBS'de %1 düşük erime noktalı agaroz) şişesini 5-10 dakika sıcak su banyosuna koyun.
    NOT: Şişeyi mikrodalgada ısıtmayın.
  2. Eridikten sonra, 100 μL agarozu gerektiği gibi 1.5 mL santrifüj tüplerine hızlı bir şekilde ayırın ve tüpleri 4 °C'de saklayın. Katılaşmış agaroz 4 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  3. Deney günü, gerekli sayıda santrifüj tüpünü 4 °C'lik depodan çıkarın. Tüpleri 42 °C'de bir ısı bloğuna veya su banyosuna yerleştirerek agarozu eritin.
    NOT: Agarozun yeniden süspansiyon için tamamen eridiğinden emin olmak için hücreleri toplamadan önce tüpleri 42 °C'ye yerleştirin (adım 3.7).
  4. Deney günü taze lizis tamponu ve TAE tamponu hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar sırasıyla oda sıcaklığında ve 4 ° C'de saklayın. Ek olarak, 15 mL'lik konik tüpte 1x PBS'yi ayırın ve yeniden süspansiyon adımında kullanmak üzere buzdolabına koyun (adım 3.5).
  5. 2 oyuklu kuyruklu yıldız slaytlarının buzlu ucundaki numune tanımlamalarını işaretleyin ve kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.

2. Numunelerin hazırlanması

  1. Deney gününden önce, hücreleri 6 oyuklu bir tabakta tohumlayın ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin. U2OS hücreleri için, her örnek için yaklaşık 2-3 x 105 hücre tohumlandı.
    NOT: Analizler için kullanılan hücre türüne bağlı olarak hücre numaralarının ayarlanması gerekebilir.
  2. Deney gününde, hücreleri deney tasarımına göre koşullarla tedavi edin. Replikasyona bağlı kırılma indüksiyonunu göstermek için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 1 saat boyunca 1 μM CPT ile tedavi edin. CPT, replikasyona bağlı bir şekilde çift iplikli kopmaları indükleyen bir topoizomeraz-1 inhibitörüdür14.

3. Hücre yeniden süspansiyonu ve lizisi

  1. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 1x PBS ile iki kez durulayın.
  2. Her kuyucuğa 300 μL tripsin ekleyin. Çanağı bir doku kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin.
    NOT: Tripsin içinde uzun süreli inkübasyon, kuyruklu yıldız analizleri sırasında sahte sonuçlar üretebilir.
  3. Her oyuğa 700 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Yavaşça yeniden süspanse edin ve numuneleri 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
    NOT: Analiz sırasında çakışan kuyrukların sıklığını azaltmak için adım 3.6'da uygun hücre yoğunluğunu elde etmek için bu adımda hücrelerin sayılması önerilir.
  4. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'da santrifüjleyin.
  5. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
  6. Adım 3.4 ve adım 3.5'i iki kez tekrarlayın ve hücreleri ml başına 2 x 105 hücre hücre yoğunluğunda soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
    NOT: Yeterli sayıda canlı hücrenin mevcut olduğundan emin olmak için bu adımda hücre canlılığının değerlendirilmesi önerilir. En az% 90 canlılık önerilir.
  7. 10 μL hücre süspansiyonunu 100 μL erimiş agaroz alikotunda yeniden süspanse edin ve aynı pipet ucunu kullanarak hafifçe karıştırın ve karışımı slaydın bir oyuğuna eşit şekilde yayın. Gerektiği gibi tüm örnekler için bu adımı tekrarlayın.
    NOT: Agarozun katılaşmasını önlemek için tüm alikotları 42 ° C su banyosundan bir kerede çıkarmaktan kaçının. Bu adım tercihen su banyosu ile gerçekleştirilmelidir ve her numune yeniden askıya alınır ve kademeli bir şekilde yayılır. Hava cepleri elektroforez sırasında kuyruklu yıldız kuyruklarının göçünü etkileyeceğinden (adım 4.5) ve kurutma adımında çatlaklara neden olacağından, agarozu slayt üzerine yayarken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının (adım 5.3)
  8. Agarozun tamamen katılaştığından emin olmak için slaytları 4 °C'de karanlıkta 15-20 dakika saklayın (Şekil 2A).
  9. Slaytları Coplin kavanozlarına yerleştirin ve slaytları oda sıcaklığında 1 saat boyunca lizis tamponuna daldırın.
  10. Slaytları soğuk TAE tamponu ile bir kez durulayın ve slaytları 4 °C'de 30 dakika boyunca soğuk TAE tamponuna daldırın.

4. Elektroforez

  1. Elektroforetik odayı düz bir yüzeye kurun ve aparatın kenarlarındaki dört tesviye düğmesini kullanarak sistemi düzleştirin. Elektroforez sırasında çözeltiyi soğuk tutmak için alt hazneye soğuk paketler yerleştirin.
  2. Aparatın içine yaklaşık ~ 850 mL soğuk 1x TAE tamponu dökün.
  3. Slaytları 4 °C'den çıkarın ve kırık DNA'nın göçüne izin vermek için elektroforez tepsisine uygun yönde yerleştirin.
    NOT: Tepside on adet 2 oyuklu slayt bulunur. Daha az sayıda örnekle çalışıyorsanız, slaytları tepsinin ortasına yerleştirin. Tek sayıda slaytla çalışıyorsanız, her kuyuya 2 slayt sığacak şekilde boş bir slayt ekleyin.
  4. Slaytları kaplamak için sağlanan kaydırma tepsisi kaplamasını yavaşça tepsinin üzerine yerleştirin.
    NOT: Aparatın düzgün çalışması için, TAE tamponunun hacmi, kaplamanın alt yüzeyinden daha düşük olmamalı ve kaplamanın üst yüzeyini aşmamalıdır.
  5. Kabloları bağladıktan sonra gücü 21 V'a ayarlayın ve 1 dakika boyunca elektroforez (40 V/cm) gerçekleştirin.
    NOT: Elektroforez süresinin, analizler için kullanılan hücre tipine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. İşlenmemiş numunelerdeki uzun kuyruklar, aşırı çalışma süresini gösterir. Tersine, pozitif kontrol numunelerindeki kısa kuyruklar yetersiz çalışma süresini yansıtabilir.

5. Boyama

  1. Elektroforezin tamamlanmasından sonra, slaytları cihazdan çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA çökeltme çözeltisine daldırın.
  2. DNA çökeltme solüsyonunu atın ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 70 etanol solüsyonuna batırın.
  3. % 70 etanol çözeltisini atın. Slaytları çıkarın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 45 °C'de bir hibridizasyon fırınında kurutun (Şekil 2B).
    NOT: Kurutma adımı için slaytlar gece boyunca karanlık ve kuru bir yerde bırakılabilir.
  4. Kuyucukları 100 μL 1x SYBR Green solüsyonu ile karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  5. Slaytları eğerek ve kuyunun kenarını tüy bırakmayan bir bezle hafifçe vurarak fazlalığı gidererek SYBR Green solüsyonunu boşaltın.
  6. Slaytları bir çekmeceye yerleştirin ve 30 dakika kurumaya bırakın.
  7. Slaytları görüntülemeye devam edin.

6. Görüntüleme ve analizler

  1. Mikroskobu görüntüleme amacıyla ayarlayın.
    NOT: Tüm görüntüler epifloresan mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. 0.45 sayısal diyafram açıklığına sahip 10x büyütme, 1/40s pozlama süresi ve +6dB kazanç ile kullanıldı. Monokrom 8 bit'in yakalama modu, 2 x 2 gruplama ve siyah dengesi düzeltmesi ile kullanıldı.
  2. Slaytları mikroskop tablasına yerleştirin ve FITC filtresini kullanarak görüntülemeye başlayın.
    NOT: Maruz kalma süresini test etmek için önce işlenmemiş numuneyi kullanın. DNA daha kompakt olduğu için çoğu hücre kuyruklu yıldız kuyruğu göstermez. CPT ile muamele edilmiş hücrelerle kuyuya geçin ve aynı pozlama süresini kullanarak görüntü alın. Kırık DNA uçlarının göçü nedeniyle bu örnekte artan uzunluklara sahip kuyruklu yıldız kuyrukları gözlenecektir.
  3. Üç teknik kopyada aynı pozlama süresini kullanarak numune başına en az 100 kuyruklu yıldız için görüntü elde edin.
    NOT: Lamellerin sonundaki kuyruklu yıldız kuyrukları eşit olmayan bir şekilde göç etme eğilimindedir ve numune dağılımında aykırı değerler olarak hareket eder. Analizler için yakalanan kuyruklu yıldızların çoğu, lamel merkezine yakın bir yerde bulunur (Şekil 3).
  4. Görüntüleri dışa aktarın ve kuyruklu yıldızları manuel olarak (Görüntü J'yi kullanarak) veya ücretsiz olarak kullanılabilen kuyruklu yıldız puanlama yazılımını kullanarak puanlayın. Puanlama için ayrı ayrı ayırt edilebilen ve görüş alanında tamamen yer alan kuyruklu yıldızlar seçilir. Üst üste binen veya kısmen görülebilen kuyruklu yıldızlar daha sonraki analizler için dikkate alınmamıştır (Şekil 4).
    NOT: Kullanıcılar, aşağıdaki eklentiyi kullanarak Image J'de kuyruklu yıldızları puanlayabilir: https://cometbio.org/index.html. CometScore yazılımını kullanarak kuyruklu yıldızları puanlamak için ayrıntılar Şekil 5'te yer almaktadır.
  5. Analizlerden elde edilen kuyruk momentlerini, 10-90 yüzdebirlik değerleri gösteren kutu ve yatay çizgi grafikleri olarak çizin. İstatistiksel analizler için parametrik veya parametrik olmayan testlerin kullanılması gerekip gerekmediğini belirlemek için normallik testleri yapın.
    NOT: Çoğu durumda, parametrik olmayan testler, yalnızca iki numuneyi karşılaştırıyorsanız Mann-Whitney testi veya üç veya daha fazla numuneyi karşılaştırıyorsanız Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi kullanılarak uygulanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Replikasyon gerilimi reaktifleri ile kırılma indüksiyonunun analizi
U2OS hücreleri 4 saat boyunca DMSO, 4 mM hidroksiüre (HU) veya 100 nM CPT ile muamele edildi ve NC testi ile kırılma birikimi açısından analiz edildi (Şekil 6A). CPT, topoizomeraz-113'ü bloke ederek S fazı sırasında kırılmalara neden olurken, HU'nun neden olduğu nükleotid havuzlarının tükenmesi, aşamalı olarak DSB'lere28 dönüştürülen replikasyon çatallarını ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, aktif replikasyon geçiren insan hücrelerindeki DNA kırılmalarını değerlendirmek için bir NC testini ana hatlarıyla belirtir. Protokolün gerçekleştirilmesi nispeten basittir ve araştırmacılar bunu alkali analizler için yüksek pH koşullarına kolayca uyarlayabilirler8. Adım 3.7 ve 4.5'te açıklandığı gibi iki kritik adım içerir. Adım 3.7'de, analiz sırasında kuyruklu yıldızların üst üste binmesini önlemek için erimiş agarozun hücrelerle birlikte kuyu boyunca eşit şekilde yayılması esastır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Dungrawala laboratuvar üyelerine katkıları ve geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibesi R35GM137800 HD'ye tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Kuyruklu Yıldız LMAgarose (LMA)R& D sistemleri4250-050-02
Kuyruklu Yıldız Testi Elektroforez Sistemi IIR& D sistemleri4250-050-ESElektroforez tankı, güvenlik kapağı, kablolar, 2/20 kuyu kayar tepsileri ve kayar tepsi yerleşimi içerir
CometScore yazılımıTriTekaçık kaynaklı
CometSlideR& D sistemleri4250-050-03
DMEM, yüksek glikozluGibco11965092
DMEM / F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
Epifloresan mikroskobuKeyenceBZ-X810
Fetal Sığır Serumu - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T hücreleriATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 hücreleriATCCCRL-4000
HidroksiüreMillipore SigmaH8627
PARP inhibitörü OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac ve nbsp;FisherSciFB300Q
Yüzey İşlem Görmüş Steril Doku Kültürü PlakasıFisherSciFB012927
SYBR Green I Nükleik Asit Jel Lekesi (10.000x)FisherSciS7567
U2OS hücreleriATCCHTB-96
UVP  HB-1000 Hibridizasyon İnkübatörüFisherSciUVP95003001

Kaynaklar

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180(2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391(2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860(2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Replikasyon StresiGenom KararsızlığıDNA Hasar TespitiReplikasyon ÇatallarıKromatin Yeniden ŞekillendiricilerTek Zincirli DNA Boşluklarıİnsan Hücre BölünmesiJel Elektroforezi
Nötr Kuyruklu Yıldız Deneyi ile İnsan Hücrelerini Bölmede DNA Kırılmalarının Tespiti
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.