Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

DOI:

10.3791/67115

⸱

9 Ağustos 2024

 , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, C. elegans'taki uçucu seks feromonuna verilen yanıtların çıkarılması ve ölçülmesi için yöntemler oluşturur ve kimyasal iletişim ve navigasyon yörüngesini incelemek için araçlar sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal iletişim, organizma sağlığı, üreme ve genel refah için hayati önem taşır. Bu sinyalleri yöneten moleküler yolları, sinirsel süreçleri ve hesaplamaları anlamak aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. Nematod Caenorhabditis elegans, uçucu bir seks feromonu ürettiği için bu süreçleri incelemek için güçlü bir model sağlar. Bu feromon, bakire dişiler veya spermi tükenmiş hermafroditler tarafından sentezlenir ve erkekler için cezbedici görevi görür.

Bu protokol, uçucu seks feromonunu birkaç C. elegans suşundan (WT suşu N2, daf-22 ve sis-2) ve C. remanei'den izole etmek için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Ayrıca, uçucu seks feromonuna karşı erkek kemotaksis yanıtını ölçmek için bir protokol de sağlıyoruz. Analizimiz, çeşitli koşullar altında erkek tepkilerini doğru bir şekilde karşılaştırmak için kemotaksis indeksi (CI), varış zamanı (AT) ve bir yörünge grafiği gibi ölçümleri kullanır. Bu yöntem, farklı genetik geçmişlere veya gelişim aşamalarına sahip erkekler arasında sağlam karşılaştırmalara izin verir. Ayrıca, burada özetlenen deney düzeneği, diğer kemocazibe kimyasallarının araştırılmasına uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal iletişim ve üreme başarısı arasındaki etkileşim, hayvanlar alemindetemel bir ilkedir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Seks feromonları, eş bulmak, bir eş bulma ve çekme ile ilgili adımları koordine etmek ve nihayetinde bir türün yayılmasını teşvik etmek için gerekli olan çok çeşitli cinsel olarak dimorfik davranışları tetikler 11,12,13,14,15,16,17. Feromon sinyallemesinin anlaşılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, ancak bu etkileşimleri yöneten moleküler mekanizmalar, nöral devreler ve hesaplama süreçleri genellikle tam olarak tanımlanmamıştır 18,19,20,21,22,23,24,25,26.

Nematod Caenorhabditis elegans, bu soruları incelemek için güçlü bir model sağlar. Özellikle, C. elegans alışılmadık bir üreme stratejisi sergiler - hermafroditler kendi kendine döllenebilir, ancak aynı zamanda erkeklerle de çaprazlanabilir 27,28,29,30,31,32,33. Bu esneklik, üreme durumunu bildirmek için sağlam bir iletişim sistemi gerektirir. C. elegans, gelişim, davranış ve sosyal etkileşimlerde çeşitli roller oynayan iyi karakterize edilmiş suda çözünür feromonları, ascarosidleri ile bilinir. Son keşifler, nematodlar tarafından kullanılan farklı bir uçucu seks feromonları sınıfını ortaya çıkardı. Bu feromonlar özellikle cinsel olarak olgun C. elegans ve C. remanei bakire dişiler ve spermi tükenmiş hermafroditler tarafından üretilir ve yetişkin erkekler için cezbedici görevi görür 29,34,35. Bu cezbedici, üretiminde ve algılanmasında dikkate değer bir cinsel dimorfizm sergiler. Dişi somatik gonad, bu uçucu seks feromonunun sentezini yönetir ve üretim dinamik olarak üreme durumunu yansıtır, çiftleşmeden sonra durur ve birkaç saat sonra devam eder29,34.

Nematod cinsiyet feromon iletişimini anlamak, kimyasal iletişim sistemlerinin evrimi, üreme durumu ve davranış arasındaki etkileşim ve cinsel olarak dimorfik nöral işlemenin altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlar 24,26,36,37,38,39 . Çalışmalar, erkeklerde amfid nöron AWA'nın feromon tespiti için kritik olduğunu ve G-proteinine bağlı reseptör SRD-1'in erkeklerde feromon tespitinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir24. C. elegans, eş arama için koku alma sistemine dayanması nedeniyle, hayvan kimyasal iletişimini, özellikle seks feromon sinyalini incelemek için çok uygundur. Ascaroside sinyalizasyonu hakkında çok şey bilinmesine rağmen, uçucu seks feromon sistemi karşılaştırma için benzersiz fırsatlar sunar 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Ayrıca, C. elegans, tam dizilenmiş genomu, açıkça tanımlanmış hücresel soyu ve iyi karakterize edilmiş koku alma mutantları nedeniyle güçlü bir genetik model organizmadır.

Bununla birlikte, bu feromonun işlenmesinde yer alan tüm nöral devre, algısını hedeflenen eş arama davranışlarına dönüştüren hesaplamalar ve biyosentez düzenlemesi tam olarak açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir. Bu süreçlerle ilgili daha fazla araştırma, hayvan iletişimini ve üreme davranışlarını yöneten çeşitli mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Feromon sentezi, salgılanması ve algılanmasında yer alan anahtar genlerin tanımlanması, hayvan iletişiminde yeni moleküler oyuncuları ortaya çıkarmayı vaat ediyor. Burada açıklanan tahliller, bu soruları ele almak için bir temel sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dişilerden ve hermafroditlerden ham seks feromonu ekstraksiyonu

  1. C. elegans Senkronizasyonu için Protokol
    1. Yetişkin dişilerin veya hermafroditlerin hazırlanması
      1. Büyük bir yetişkin dişi/hermafrodit popülasyonu oluşana ve OP50 besin kaynağı tükenene kadar kültür plakalarını günlük olarak izleyin. Ham seks feromon ekstraksiyonu için fog-2 C. elegans ve WT C. remanei dişilerini kullanarak, çiftleşmiş dişilerden senkronize yumurtalar hazırlayın.
        NOT: Bu protokolde kendi kendine sperm üretmeyen C. elegans fog-2 mutant XX hayvanları C. elegans dişileri olarak adlandırılmaktadır.
    2. Solucanların yıkanması ve peletlenmesi
      1. Yetişkin solucanları M9 tamponu ile karışık bir popülasyon plakasından yıkayın. Solucan süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Solucanları peletlemek için 1.500 × g'da 0,5-1 dakika santrifüjleyin.
        NOT: Ağır kirlilik için ön temizleme (isteğe bağlı): Çok kirlenmişse solucanların tüpe yerleşmesine izin verin. Bakterileri uzaklaştırmak için süpernatanı pipetleyin ve süpernatan berraklaşana kadar tekrarlayın.
    3. Beyazlatma
      1. Solucan peletine 200 μL M9 tamponu ekleyin. Ev tipi çamaşır suyu ve 1 M NaOH'yi 1:1 oranında karıştırarak lizis tamponu hazırlayın. Karışıma bu lizis tamponundan 500 μL ekleyin, 10 saniye boyunca girdap yapın ve ardından diseksiyon mikroskobu altında lizis durumunu izlemek için duraklayın. Bu 10 saniyelik girdap işlemini tekrarlayın ve ardından yetişkin solucanlar tamamen parçalanana kadar gözlem yapın.
    4. Embriyoların ağartılmasını ve peletlenmesini durdurmak
      1. Yetişkin solucanlar küçük parçalara ayrıldığında (ancak tamamen çözünmediğinde), reaksiyonu yavaşlatmak için hemen 500 μL M9 tamponu ekleyin. Embriyoları peletlemek için 30-60 saniye boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin.
        NOT: Aşırı lizis embriyolara zarar verebilir. Yetişkin solucan gövdeleri küçük parçalara ayrıldığında reaksiyonu durdurun. Lizis, santrifüj ve yıkama adımları sırasında tüm lizis tamponu çıkarılana kadar devam eder.
    5. Embriyoları 5x 1 mL M9 tamponu ile yıkayın, her yıkamadan sonra 30-60 saniye boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın.
    6. Senkronizasyon
      1. Embriyoları 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 800 μL M9 tamponunda yeniden süspanse edin. Tüp tüpünü 20 °C'de 12-15 saat döndürün, L1 kuluçka ve L1 aşamasında gıda kaynağı olmadığı için solucan tutuklaması. Solucanları L4 aşamasına ulaşana kadar 3 gün boyunca 20 ° C'de serbest bırakın ve kültürleyin.

2. Bir günlük bakire dişilerden ham seks feromon ekstraksiyonu (Şekil 1A)

NOT: C. elegans'ın bir günlük bakire sis-2 (germ hattının dişileşmesi) mutant dişilerinden ve C. remanei'nin WT dişilerinden seks feromonlarını çıkarmak için daha önce kurulmuş bir protokol24'ü benimsiyoruz.

  1. Yetişkin dişilerin hazırlanması
    1. Feromon ekstraksiyonundan 1 gün önce yaklaşık 200 L4 evre sis-2 dişi seçin ve izole edin. Sadece bakire dişilerin toplandığından emin olmak için, bu L4 fog-2 dişilerini cinsiyetlerine göre dikkatlice ayırın ve üç ayrı 6 cm OP50 NGM plakasına dağıtın. Her plakanın ortasına az miktarda OP50 bakteri yerleştirin.
      NOT: Tabağa yanlışlıkla bir erkek solucan sokma riskini önlemek için 200 L4 dişi solucanı üç ayrı plakaya dağıtın. Bir erkek seçilirse, birçok dişiyle çiftleşmesi muhtemeldir, bu da dişilerin çoğunun yetişkin olduklarında ertesi gün döllenmesine neden olur. Döllenmiş dişiler, sperm tükenene kadar uçucu seks feromonları yaymazlar, bu da ekstraksiyon sonuçlarını etkiler. Sınırlı besin kaynağı, hermafroditleri plakanın merkezinde daha küçük bir alanla sınırlayarak, izolasyon süresi boyunca plakadan kaçma şansını en aza indirir.
  2. Ekstraksiyon işlemi
    1. Ekstraksiyon gününde (üreme olgunluğunun 1. günü, solucanların L1 tutuklamasından serbest bırakılmasından 3 gün sonra), 100 bakire, 1 günlük sis-2 dişisini 1 mL M9 tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne alın ve izole edin. Bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için dişileri 5 kez M9 tamponu ile yıkayın ve feromon üretimine ve ortamda birikmesine izin vermek için 20 ° C'de 6 saat boyunca 100 μL M9 tamponunda inkübe edin.
    2. Benzer bir ekstraksiyon işlemi gerçekleştirin C. remanei dişiler, ekstraksiyondan bir gün önce üç plakaya izole edilen sadece 15-20 L4 aşaması dişisini kullanarak ve ertesi gün, beş bakire dişiyi 100 μL M9 tamponunda 25 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin ( C. remanei için en uygun büyüme sıcaklığı)58.
      NOT: C. remanei dişileri, C. elegans dişilerine kıyasla daha yüksek miktarda uçucu seks feromonu üretir. Bu nedenle, 100 μL ham uçucu seks feromonunu çıkarmak için sadece beş dişi yeterlidir.
  3. Depolama
    1. Solucanları peletlemek için numuneleri 15.000 × g'da 30-60 saniye santrifüjleyin. Süpernatanı (feromon içeren) dikkatlice pipetle temiz bir tüpe aktarın ve solucan peletini içeren tüpü atın. İzole edilmiş süpernatanı sonraki kemoretraksiyon testleri için saklayın.
      NOT: Ham uçucu seks feromon özütü, buharlaşmayı en aza indirmek için parafilm ile sarılmış bir mikrosantrifüj tüpünde -80 °C'de en az 1 yıl saklanabilir.
  4. Kalite kontrol
    1. Ekstraktı kullanmadan önce, kemoçekiciliğini doğrulamak için N2 erkekleri veya him-5 erkekleri kullanarak bir kalite kontrol testi yapın (bkz. bölüm 4).

3. 6 günlük bakire hermafroditlerden büyük miktarda ham seks feromonu ekstraksiyonu (Şekil 1A)

  1. Solucan kültürü
    1. Yaklaşık 20 mL ham C. elegans seks feromonu elde etmek için, yukarıda belirtilen ağartıcı protokolünü kullanarak sağlıklı yetişkin C. elegans (N2 veya daf-22 mutant) solucanları içeren yirmi 10 cm'lik NGM plakasını senkronize edin ve ardından 5x M9 tamponu ile yıkayın.
      NOT: Bu işlem feromon ekstraksiyonu için yeterli embriyo hazırlar. N2: Hem suda çözünür askarosid feromonları hem de askarosid olmayan uçucu seks feromonları üreten standart WT C. elegans suşu. daf-22 mutantı: Çok sayıda ascaroside feromon üretme yeteneğinden yoksun bir mutant, bu da onları ascaroside olmayan uçucu seks feromonlarını izole olarak incelemede yardımcı kılar.
    2. L1 aşamasında solucanları senkronize etmek için, gelişimi durdurmak için embriyoları M9 tamponunda 12-15 saat döndürün. Tutukladığınız L1 solucanlarını büyüme ve gelişme için OP50 bakterisi ile tohumlanmış 10 cm'lik NGM kültür plakalarına aktarın.
    3. Hermafrodit plakalarda erkeklerin varlığını en aza indirmek için, solucan salınımından 2 gün sonra, L4 aşamasında plakaları kontrol edin ve gözlenen erkekleri (çok nadir) çıkarın.
    4. Üç günlük gelişimden sonra, solucanların üreme açısından olgun yetişkinler haline geldiğini gösteren embriyoların görünümünü arayın.
      NOT: C. elegans'ın fog-2 mutant dişileri ve C. remanei'nin WT dişileri toplu uçucu seks feromon ekstraksiyonu için uygun değildir. fog-2 mutantı C. elegans ve C. remanei, popülasyonlarında yüksek oranda erkeğe sahiptir ve erkekler sürekli olarak dişilerle çiftleşir. Döllenmiş dişiler uçucu seks feromonları üretmezler. Erkek varlığı bu bileşiklerin ekstraksiyonunu zorlaştırır.
  2. Solucan yıkama ve embriyo ayırma
    1. Embriyoları M9 tamponu ile tekrar tekrar yıkayın ve yetişkinlerin çoğu tüpün dibine gelene kadar çökmelerine izin verin (1 g sedimantasyon); 5-7x tekrarlayın. Yetişkin solucanların çökelmesini kolaylaştırmak ve yetişkin solucan popülasyonunun süpernatantta asılı kalan embriyolardan ayrılmasını sağlamak için mikrosantrifüj tüplerinin birkaç dakika boyunca bir rafta rahatsız edilmeden yerleşmesine izin verin.
    2. Ayrılan yetişkinleri pipetleyin ve yeni OP50 tohumlu NGM plakalarına aktarın.
    3. Kendi spermini tüketmek için bu yıkama işlemini 5-6 gün boyunca tekrarlayın.
      NOT: Uçucu seks feromonlarının çıkarılması için 5-6 günlük hermafroditleri kullanın. Bu zamanlama, mevcut kendi spermine sahip hermafroditler uçucu seks feromonları üretmediğinden, kendi spermlerinin tükenme olasılığının yüksek olmasını sağlar. 5. veya 6. güne kadar plakadaki çok sayıda ölü veya yumurtadan çıkmamış embriyo, feromon ekstraksiyonuna başlamak için uygun bir zamanı gösterir.
  3. Seks feromon ekstraksiyonu
    1. Seks feromonunu modifikasyonlarla bölüm 1'de açıklandığı gibi çıkarın.
    2. 100 μL'ye 100 C. elegans dişi eklemek yerine, son solucan pelet hacmine bağlı olarak M9 tamponu ekleyin. Her 50 μL paketlenmiş solucan için 1 mL M9 tamponu ekleyin.
  4. Kalite kontrol ve homojenizasyon
    1. N2 erkekleri veya him-5 erkekleri ile kemorekattraction testi kullanılarak ekstrakte edilen feromonun kalite kontrol test partileri (bkz. bölüm 4).
    2. Tarama veya mikroakışkan deneyler gibi büyük miktarda feromon gerektiren deneyler için homojen bir ham uçucu seks feromonu oluşturmak üzere tüm partileri karıştırın. Ham seks feromonu ekstraktını buharlaşmayı en aza indirmek için parafilm ile sarılmış 50 mL'lik tüplerde -80 °C'de en az 1 yıl saklayın.
  5. Ham seks feromon ekstraktının standardizasyonu için kemocazibe tahlili bazlı titrasyon yöntemi
    1. Her bir feromon ekstraktının seri dilüsyonlarını hem WT N2 hem de him-5 erkek C. elegans üzerinde test ederek bir titrasyon testi gerçekleştirin. Kontrol suşlarında sürekli olarak sağlam ve tekrarlanabilir bir kemotaksis tepkisi ortaya çıkaran en yüksek seyreltmeyi (en düşük konsantrasyon) belirleyin.
    2. M9 tamponunda her ham ekstrakttan (örn. 1:2, 1:4, 1:8, vb.) bir dizi seyreltme hazırlayın.
    3. Kemotaksis testleri
      1. Erkeklerin referans suşu üzerindeki her seyreltmeyi kullanarak standartlaştırılmış kemotaksis testleri yapın (bkz. bölüm 4). Tekrarlanabilirliği sağlamak için üç çoğaltma gerçekleştirin. Feromon konsantrasyonundaki tutarlılığı değerlendirmek için farklı ekstraksiyon partileri arasındaki optimum seyreltmeleri karşılaştırın.
        NOT: Bu, her bir ekstraktın biyoaktivitesini değerlendirmek için bir referans noktası oluşturur. Standart seks feromon kemoreaksiyon testinde, orijinal seyreltilmemiş ekstraktlar sonraki deneyler için kullanılacak ve titrasyon, partiler arasında tutarlı feromon aktivitesi sağlamak için bir kalite kontrol adımı olarak hizmet edecektir. Seyreltme serisi, belirli deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir. Standart ekstraksiyon protokolünün sürekli olarak doymuş ham feromon ekstraktları verdiği göz önüne alındığında, ekstraktı standartlaştırmak için bir titrasyon testi çoğu deney için gerekli olmayabilir. Tutarlılığı korumak ve feromon aktivitesindeki değişkenliği en aza indirmek için bir dizi ilgili deney boyunca aynı ham seks feromonu partisinin kullanılması önerilir.

4. Uçucu seks feromon kemoreziva testi

NOT: Uçucu seks feromon kemorevaksiyon testi, diğer kemorekattraction çalışmalarında 24,29,59,60,61 kullanılan daha önce kurulmuş yöntemlerden uyarlanmıştır. Bu modifikasyonlar, uçucu seks feromonlarına verilen yanıtları tespit etmek için testin duyarlılığını ve özgüllüğünü optimize etmek için uygulandı. Bu özel yaklaşım, testin belirli araştırma ihtiyaçlarına uygulanabilirliğini artırır.

  1. Yetişkin dişi / hermafroditler bol olana kadar kültür plakalarını günlük olarak gözlemleyin. Solucanların sağlığı, seks feromonuna verdikleri tepkiyi etkiler.
  2. Onun-5 erkeğin hazırlanması
    1. Him-5 solucanlarını senkronize etmek için standart ağartma protokolünü kullanın. Senkronizasyondan sonra, solucanları 5x M9 tamponu ile yıkayın. Testten bir gün önce L4 erkeklerini izole edin; daha sonra, bir günlük yetişkin erkek solucanları tohumlu plakalarından aktarın ve tahlilden önce M9 tamponunda durulayın. Kalıntı bakterileri ortadan kaldırmak ve tahlil sırasında gıdalardan kaynaklanan etkileşimi önlemek için tahlilden önce bunları tohumlanmamış NGM plakalarına yerleştirin.
      NOT: Solucanları testten önce bir saatten fazla aç bırakmayın, çünkü bu onların iç durumlarını değiştirebilir ve seks feromon kemorevivites testinin sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, tek bir günde 10'dan fazla tahlil yapmayı düşünüyorsanız, solucan örneklerini her saat değiştirin. Ayrıca, bir deneysel test ile bir kontrol testi arasında tekrar tekrar geçiş yapın.
  3. Kemoretraksiyonel agar test plaklarının hazırlanması
    1. İlgili literatürde açıklandığı gibi% 1.5 agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-baz ve 3.5 mM Tris-Cl içeren kemorezientif test plakaları hazırlayın24.
    2. Agarı kemorezive çözeltisi içinde tamamen eriyene kadar bir mikrodalga kullanarak ısıtın. Solüsyonun oda sıcaklığında 5 dakika soğumasına izin verin.
    3. Kemoçekim agar solüsyonunu Petri kaplarına eşit olarak dağıtmak için bir pipet yardımcısı kullanın: her 10 cm'lik tabağa 30 mL ve her 6 cm'lik tabağa 20 mL dökün.
    4. Kemocazibe agar solüsyonunu Petri kaplarına döktükten sonra, agar yüzeyinin hafifçe kurumasını sağlamak için kapakları temiz bir alanda en az 40 dakika açık bırakın. Yüzey uygun şekilde kuruduktan sonra kapakları kapatın.
      NOT: Bu kuruma süresi laboratuvar ortamının nem ve sıcaklığına bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
  4. Plaka saklama ve tahlil öncesi hazırlık
    1. Hazırlanan tahlil plakalarını kutulayın ve 1 haftaya kadar soğuk bir odada saklayın. Kullanmadan önce plakaları soğuk hava deposundan çıkarın ve bir saatten fazla oda sıcaklığına alışmalarına izin verin. Tahlilden 20 dakika önce agardan kalan nemin temiz bir alanda buharlaşmasını sağlamak için kapakları açın ve tahlili yapmadan önce yüzeyde belirgin bir su olmadığından emin olun.
  5. Deneysel tasarım ve kemocazibe deneyi
    1. Kemorekreaksiyon testini yapmak için, kapakta ve Petri kabının alt tarafında üç ayrı noktayı işaretleyin veya tabağın altına yerleştirilmiş veya diseksiyon mikroskobuna bağlı şeffaf plastik kağıda basılmış bir şablon kullanın. Bu işaretler, solucanlar için başlangıç noktası olarak bir orta nokta (•), deney noktası için bir artı işareti (+) (kapakta 2 μL seks feromonu ve plaka üzerinde 2 μL 1 M sodyum azid) ve kontrol noktası için bir eksi işareti (-) (kapakta 2 μL M9 tamponu ve 2 μL 1 M sodyum azid) içerir (Şekil 2A). Bu işaretler arasındaki mesafeyi tabak boyutuna ve özel deneysel ihtiyaçlara göre ayarlayın. Tipik olarak, 6 cm'lik Petri kapları için, pozitif kontrol testleri için başlangıç noktasından her bir test maddesine 1,5 cm'lik sabit bir mesafe ayarlayın.
  6. Testi gerçekleştirmek için ayrıntılı adımlar (Şekil 2)
    1. Plaka üzerindeki her deney ve kontrol noktasına 2 μL 1 M sodyum azid uygulayın.
    2. Bir solucan toplayıcı ile 20 sağlıklı ve serbestçe hareket eden erkek solucan seçin. Bir diseksiyon mikroskobu altında başlangıç noktasında 20 erkek solucanı aynı anda serbest bırakın.
    3. Kapaktaki deney ve kontrol noktalarına sırasıyla 2 μL seks feromonu ve 2 μL M9 tamponu ekleyin.
    4. Kapağı yavaşça kapatın ve tahlil plakasını mikroskobun yanındaki sessiz, sıcaklığa dayanıklı bir alana yerleştirin.
    5. 30 dakika sonra, her noktadaki solucan sayısını sayarak testi puanlayın.
      NOT: Erken toplanan solucanların kurumasını ve sağlıksız hale gelmesini önlemek için 20 solucan toplama işlemi 1-2 dakikayı geçmemelidir, bu da sonuçları etkileyebilir. Erkeklerin toplanmasından kapağın kapatılmasına kadar tüm süreç 2 ila 5 dakika sürmelidir.
  7. Pozitif kontrol taraması
    1. Kemotaksis duyarlılıklarını doğrulamak için erkek solucanları 1.000 kat seyreltilmiş diasetil çözeltisine (%10 etanol ve %90 M9 tamponunda çözülmüş) test edin. Testi başlattıktan 30 dakika sonra kemoreziva testinin sonuçlarını değerlendirin. Belirlenen noktalarda felç olan solucanları konumlarına göre puanlayın: Kontrol noktasındakiler için 'C' ve deney noktasındakiler için 'E'. Solucanları hiçbir noktada 'N' olarak puanlayın (Şekil 2C).
    2. Kemocazibe İndeksini (CI) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      figure-protocol-1
    3. Yalnızca kemotaksis indeksi 0.4 ≥ olan erkek numuneleri seçin (C.I., bkz. Şekil 2C). Sonraki seks feromon testi için aynı partiden erkeği kullanın.
      NOT: Deney sonuçlarının tutarlılığını ve güvenilirliğini sağlamak için her biri 20 solucan içeren üç ayrı test yapın. Tutarlılık elde etmek için tipik olarak üç tahlil yeterlidir.

5. Kemorezive testi için zamanlama ve skorlama kılavuzları

  1. Solucanların kemoçekim tepkisini son konumlarına göre değerlendirin. Testin sonunda, genellikle başladıktan 30 dakika sonra, her noktadaki solucan sayısını puanlayın.
    NOT: Deney ve kontrol noktalarında sodyum azid kullanımı, gelen solucanları felç ederek doğru puanlamayı kolaylaştırır. Çoğu WT N2 ve him-5 erkekleri, feromon kaynağını 1,5 cm mesafe kurulumuna sahip 6 cm'lik bir plakada 6-8 dakika içinde bulabilir.
  2. Kemotaksis verimliliğindeki kusurları yakalamak, özellikle ince kusurları tespit etmek için, testi 3-5 dakikalık düzenli aralıklarla izlemeyi düşünün.
    NOT: Bu sık gözlem, solucanların test noktalarına ne zaman ulaştığının belgelenmesini sağlar. Bu tür ayrıntılı izleme, solucanların düşük kemotaksis verimliliği sergilediği, ancak yine de inceleme penceresi içindeki test noktasına ulaşmayı başardığı durumları ortaya çıkarabilir.

6. İsteğe bağlı değişiklikler

  1. Kemotaksisin gelişmiş bir değerlendirmesi için, test boyunca solucanların yörüngelerini kaydetmek için plakanın üzerine yerleştirilmiş bir kamera kullanın.
    NOT: Bu değişiklik, hareket modellerinin kapsamlı bir analizini mümkün kılarak, kemoçekim davranışı ve yörüngesi hakkında daha derin bir içgörü sağlar (Şekil 3).

7. Veri analizi

  1. Kemorevive İndeksi (C.I.) skorlaması ve hesaplanması
    1. 4.7.1 ve 4.7.2 adımlarını izleyin.
  2. Varış zamanı grafiği
    1. Kemoreziva tahlillerinin daha kapsamlı bir analizi için, tahlili 3-5 dakikalık aralıklarla izlemeyi veya tahlil boyunca solucanların yörüngelerini kaydetmek için plakanın üzerine yerleştirilmiş bir kamera kullanmayı düşünün.
      NOT: Bu yaklaşımlar sadece solucanların tasarım noktalarına varış zamanlarının puanlanmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda ortalama varış zamanlarının karşılaştırılmasına ve bu sürelerin dağılımının analiz edilmesine de izin verir.
  3. Video tabanlı yörünge analizi ve veri görselleştirme
    NOT: Hareket kalıplarını analiz etmek için C. elegans kemocazibe tahlilleri sırasında, yörüngeleri kaydedin ve çıkarın (bkz. Malzeme Listesi) ve daha fazla analiz (Şekil 3).
    1. Kayıt sistemini kurun.
    2. Yeni bir kayıt başlatın ve kayıt ayarları penceresine erişin.
    3. İstenen kayıt parametrelerini tanımlayın:
      1. Dosya Öneki: Video dosyaları için açıklayıcı bir ad seçin (ör. "experiment1_").
      2. Kare Hızı (FPS): Solucanın hareketini yakalamak için saniyede uygun kareyi seçin (örneğin, agar plakasındaki solucanlar için 7,5 FPS ve yüzen solucanlar için 30 FPS).
      3. Süre: Kaydın uzunluğunu saniye cinsinden ayarlayın (örneğin, toplu kemoreziva testi için 1.800 s [30 dk]).
    4. Görüntü kalitesini optimize edin: Solucanların arka planda net bir şekilde görülebilmesini sağlamak için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın ve solucanların keskin bir görüntüsünü elde etmek için odakta ince ayar yapın.
    5. Test plakasını hazırlamak için önce kontrol solüsyonunu belirlenen kontrol noktasına dağıtın. Ardından, solucanları dikkatlice toplayın ve yavaşça plakanın ortasına bırakın. Solucan(lar) yerleştikten sonra, seks feromon solüsyonunu belirlenen deney noktasına uygulayın.
    6. Plakayı yerleştirin: Yakalama alanını en üst düzeye çıkarmak için solucanları içeren plakayı kayıt alanının ortasına dikkatlice yerleştirin.
    7. Kemotaksis tahlilleri sırasında solucanlar üzerindeki stresi azaltmak için aşağıdaki iki yaklaşımı göz önünde bulundurun.
      1. Tek solucan tahlili için, solucanı tahlil plakasına yerleştirin ve seks feromon çözeltisini belirlenen mesafeye (solucanın mevcut konumuna bağlı konum) vermeden önce 5 dakika alışmasına izin verin.
        NOT: Bu, kullanımı en aza indirir ve solucanın yeni ortamına uyum sağlaması için zaman sağlar.
      2. Toplu kemorezivasyon deneyi: Solucanların 5 dakika boyunca plaka üzerinde doğal olarak yerleşmesine ve dağılmasına izin verin. Bu alışma süresinden sonra, feromon çözeltisini belirlenen sabit konuma getirin. Video analizi sırasında, her bir solucanın feromona olan başlangıç mesafesini ölçün ve daha fazla analiz için bunları buna göre gruplandırın.
    8. Video analiz prosedürü
      1. İçe aktarma ve kurulum: Kaydedilen videoyu yazılıma aktarın. Sıra bilgilerini yapılandırın (örn. kare hızı); Görüntüleme ölçeğini belirtin (ölçü birimi başına piksel).
      2. Görüntü ayarı: Solucan algılamayı optimize etmek için, yeşil etiket arka plan gürültüsünü veya artefaktları yakalamadan solucanları sıkıca özetleyene kadar algılama eşiğini ayarlayın. Ek olarak, görüntüdeki gürültüyü ve düzensizliği azaltmak için arka plan yumuşatma algoritmaları uygulayın ve solucanlar ile arka plan arasındaki kontrastı artırın. Gürültü azaltma ve solucan ayrıntılarının korunması arasındaki en uygun dengeyi bulmak için farklı yumuşatma seviyeleriyle denemeler yapın.
        NOT: İdeal eşik, yabancı elementleri hariç tutarken her solucanın vücudunun çoğunu kapsamalıdır.
      3. Algılama parametresi optimizasyonu: Algılama parametrelerini otomatik olarak oluşturmak için temsili bir solucan seçin. 5-10 rastgele kareyi görsel olarak inceleyerek algılama doğruluğunu doğrulayın. Algılama tatmin edici değilse, algılama parametrelerini manuel olarak iyileştirin, gerekirse görüntü ayarlama ayarlarını yeniden gözden geçirin ve algılama güvenilir olduğunda izlemeye devam edin.
      4. İzleme yörüngelerinin düzeltilmesi ve onarılması: Otomatik izleme işlemi tamamlandıktan sonra, oluşturulan yörüngelerin manuel olarak düzeltilmesini gerçekleştirin. Düzeltme okuması sırasında tutarsızlıklar bulunursa, yörüngeyi düzeltmek için onarım işlevini kullanın ve aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin: Katıl: Yanlış bir şekilde farklı tanımlayıcılar atanmış ancak aynı kişiye ait olan yörünge segmentlerini bağlayın. Bölme: Yanlış bir şekilde aynı tanımlayıcıya atanmış ancak farklı kişilere ait olan ayrı yörünge segmentleri.
        NOT: Amaç, her bir benzersiz tanımlayıcının (sayı) tüm izleme süresi boyunca tutarlı bir şekilde aynı kişiye atanmasını sağlamaktır.
        Örnek: Bir solucan bir dönem için "3" olarak etiketlenirse ve sonraki bir dönem için yanlış bir şekilde "7" olarak etiketlenirse, onarım işlevi bu iki segmenti "3" tanımlayıcısı altında birleştirir. Tersine, iki solucanın her ikisi de bir süre için "12" olarak etiketlenirse, onarım işlevi bu segmenti her biri benzersiz bir tanımlayıcıya sahip iki ayrı yörüngeye böler. Dikkatli bir şekilde yeniden okuyarak ve gerekli onarımları uygulayarak, izleme verilerinin doğruluğu ve güvenilirliği önemli ölçüde iyileştirilebilir.
      5. Sonuç görselleştirme ve dışa aktarma: Görselleştirme ve temel analiz için yazılım kullanın. Tercih edilen araçlar veya kodla daha fazla analiz için verileri CSV dosyaları olarak dışa aktarın. Bu yöntem, beş temel parametreye dayalı olarak solucan hareketi yörüngesini görselleştirmek için temel bir kod (bkz. https://github.com/edmondztt/pheromone-traj-analysis.git) sağlar (Şekil 3). Zaman: Deneyin başlamasından bu yana geçen süreyi belirtmek için renk kodlu yörüngenin ilerlemesi. Feromona Olan Mesafe: Her zaman noktasında solucan ile feromon kaynağı arasındaki mesafe. Hız: Solucanın her noktadaki hızı, aynı zamanda dönme ve durma olaylarını da gösterir. Düzlük: Solucanın yolunun ne kadar düz olduğu. Yön Doğruluğu: Solucanın hareketi feromon hedefinin yönü ile ne kadar uyumlu? Bu kod, solucan davranışını anlamak için temel bir görselleştirme sağlar ve daha derin analiz için özelleştirilebilir ve genişletilebilir.
        NOT: Bu gelişmiş yaklaşım, seks feromonlarına yanıt olarak solucan navigasyon yörüngesini detaylandırarak geleneksel kemocazibe indeksine kapsamlı bir alternatif sunar. Navigasyonun keyfi uç noktalarına ve zaman penceresi belirlemesine güvenmeden hareket kalıplarının anlaşılmasına olanak tanır ve tahlilin davranışsal dinamikleri hakkında daha derin bilgiler sunar. Verilerin, vücut bükülmesinin neden olduğu hareketi filtrelemek için belirli deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilen 20 kare üzerinde ortalaması alındı.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemoattraction testinde uçucu seks feromon algısı kusurlu suşun yörünge analizi
Bu kemorekreaksiyon testi, uçucu seks feromonlarına tepkilerinde C. elegans'ın vahşi tip ve mutant suşları arasında güvenilir bir şekilde ayrım yapar. Him-5 erkekleriyle yapılan başarılı deneyler, feromon kaynağına karşı sürekli olarak sağlam kemotaksis göstermektedir. Bu, yüksek bir kemotaksis indeksi (C.I.) ile yansıtılır (Şekil 2), genellikle 0.5'i aşar, bu da feromon kaynağı için güçlü bir tercihi gösterir. Tersine, feromon reseptörü mutant srd-1 ile yapılan deneyler sürekli olarak olumsuz sonuçlar vermektedir. SRD-1 erkekleri için C.I. tipik olarak sıfır24 civarındadır. Bu, tahlilin kemotaktik bir yanıtın yokluğunu tespit etme yeteneğini doğrular.

Optimal olmayan deneylerde, sonuçları çok sayıda faktör etkileyebilir. Örneğin, yetersiz feromon konsantrasyonu him-5 erkeklerinde zayıf tepkilere yol açabilirken, kontaminasyon veya yanlış kullanım her iki suşta da öngörülemeyen harekete neden olabilir. Bu senaryolar, him-5 erkekler için daha düşük C.I. değerleri ve srd-1 erkekler için potansiyel olarak yanıltıcı sıfır olmayan değerler ile sonuçlanır. Bu nedenle, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, davranışsal farklılıkları görsel olarak doğrulayan yörünge analizi ile desteklenen, vahşi tip ve mutant suşlar arasındaki kemotaksis indekslerinde açık bir ayrım ile işaretlenmiştir (Şekil 3). Veri analizi, gözlemlenen farklılıkların önemli olduğundan emin olmak için C.I. değerlerinin istatistiksel karşılaştırmalarını içermelidir.

Video tabanlı kemocazibe testinin gösterilmesi, veri analizi ve görselleştirme
Başarılı tahlil sonuçları: Şekil 3 , him-5 erkeklerinin uçucu bir seks feromonuna karşı sağlam kemotaktik tepkisini göstermektedir. Renk kodlu yörüngeler, (A) zaman maliyetini, (B) mesafeyi ortaya çıkarır: zamanla feromon kaynağına artan yakınlık, solucanların çekiciliğini doğrular. (C) hız: yörüngeler boyunca değişen hızlar, kemotaktik yanıtların dinamikleri hakkında içgörü sağlar. (D) düzlük: solucanların doğrudan feromon kaynağına doğru hareket etmesi. Yol ne kadar düz olursa, kimyasal cezbediciye yanıt olarak hareketleri o kadar verimli ve hedefli olur. (E) Yön doğruluğu: Bu, solucanların kendilerini kimyasal cezbedici olan feromonun kaynağına doğru doğru yönlendirme ve hareket ettirme yeteneğini gösterir. Esasen solucanların kimyasal gradyanı ne kadar iyi algılayabildiklerini ve hedeflerine ulaşmak için bu gradyan boyunca ne kadar iyi ilerleyebildiklerini ölçer.

Hızın sıfıra düşmesi tipik olarak bir durma veya dönüşü gösterir. Hız bilgilerini doğrusallık verileriyle birleştirmek, dönüş olaylarının belirlenmesine yardımcı olabilir. Spesifik olarak, hız sıfıra düştüğünde ve düzlük de çok düşük olduğunda bir dönüş olayı belirtilir. Buna karşılık, duyusal kusurlu mutantlarla veya optimal olmayan koşullar altında (örneğin, düşük feromon konsantrasyonu, uygun olmayan solucan yoğunluğu) yapılan deneyler farklı sonuçlar verebilir.

Araştırmacılar, yörüngeleri karşılaştırarak ve yönlülük, hız ve doğrusuzluk gibi parametreleri ölçerek, kemotaksisin altında yatan mekanizmalar hakkında fikir edinebilirler. Feromon kaynağına doğru net, yönlendirilmiş yörüngelerle yapılan başarılı deneyler, tahlilin çekici uyaranları tespit etme yeteneğini doğrular. Tersine, negatif kontrollerde veya mutant suşlarda bu tür modellerin olmaması, testin özgüllüğünü ve duyusal kusurları tanımlama yeteneğini doğrular. Şekil 3'te gösterildiği gibi video tabanlı toplu kemocazibe testi, solucan kemotaksisi davranışının ayrıntılarını incelemek için güçlü bir araç sağlar. Araştırmacılar, bireysel yörüngeleri analiz ederek, yalnızca çekimin varlığını veya yokluğunu değil, aynı zamanda tepkideki farkı da ortaya çıkarabilir ve kemotaksisiyi yöneten altta yatan genetik ve sinirsel mekanizmaların daha derin bir anlayışını sunar.

figure-results-1
Şekil 1: Ham seks feromon ekstraksiyonunun iş akışı. Ham seks feromonu, solucanların senkronize edildiği, yıkandığı, izole edildiği ve feromon üretimi için M9 tamponunda inkübe edildiği C. elegans'ın senkronize bir günlük bakire sis-2 mutant dişilerinden ve C. remanei'nin WT dişilerinden ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen feromon içeren süpernatant, kemorezive deneylerinde kullanılmak üzere 1 yıla kadar -80 ° C'de saklanır ve çekiciliği doğrulamak için N2 veya him-5 erkekler kullanılarak yapılan kalite kontrol testleri yapılır. 6 günlük bakire C. elegans hermafroditlerinden büyük ölçekli ekstraksiyon için, solucanlar senkronize edilir ve 6 gün boyunca tekrar tekrar yıkanır, seks feromonu benzer şekilde ekstrakte edilir, ancak solucan peletlerinin hacmine göre modifiye edilir ve deneysel kullanım için homojen bir şekilde karıştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Uçucu seks feromon kemoreaksiyon testi ve kemocazibe İndeksi hesaplaması. (A) Bu test, uçucu seks feromon kemoretraksiyon testinden önce pozitif bir kontrol maddesine yanıtlarını test ederek, standart bir ağartıcı senkronizasyon protokolü ile WT N2 veya him-5 erkeklerinin hazırlanmasını içerir. Deney, kontrol ve test noktaları için plakaların işaretlenmesini ve doğru puanlama için bu noktalardaki solucanları hareketsiz hale getirmek için sodyumun bir kenara kullanılmasını içerir. Sonuçlar genellikle deneye başladıktan 30 dakika sonra puanlanır (kapağın kapatılmasıyla gösterilir). (B) İki farklı mesafeye sahip kemorezidans testi kurulumunun yandan görünümü. (C) C.I. hesaplama ve yorumlama. C.I., bir test uyaranının çekiciliğinin veya iticiliğinin nicel bir ölçüsüdür. CI, güçlü çekimi gösteren 1'den güçlü itmeyi gösteren -1'e kadar değişir. Düşük bir C.I. değeri iki senaryodan ortaya çıkabilir: ya hem deney hem de kontrol noktalarında az sayıda solucan ya da iki nokta arasında eşit bir solucan dağılımı. (D) Ohim-5 ve srd-1 için kemoçekim indeksleri C. elegans erkekleri, C. remanei ve C. elegans dişilerinden uçucu seks feromonlarına yanıt olarak. Farklı genetik geçmişlere sahip erkekler, seks feromon uyaranına farklı tepki verir. him-5 erkekleri, C. remanei dişilerinden gelen feromonlara karşı belirgin derecede daha yüksek bir indeks ile her iki feromona da bir yanıt sergiler. Buna karşılık, kemoreseptör mutant suşu srd-1 erkekleri bu analizde her iki feromona da yanıt göstermez. p < 0.01. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; M.Ö. = kemocazibe indeksi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Uçucu seks feromonuna yanıt olarak him-5 erkeğinin yörünge analizi. Bu şekil, uçucu bir seks feromon uyaranı ile bir kemorekreaksiyon testi sırasında him-5 erkek solucanlarının hareket modellerini göstermektedir. Bireysel yörüngeler, (A) Zaman: Deney boyunca yörüngenin ilerlemesini temsil edecek şekilde renk kodludur. Renk, testin başlangıcından bu yana geçen süreyi temsil eder. (B) Feromona olan mesafe: Her zaman noktasında feromon kaynağına yakınlık. (C) Hız: Her noktadaki solucan hızı. (D) Doğruluk: Solucanın izlediği yolun doğrudanlığı. (E) Yön doğruluğu: Hareketin feromon kaynağının yönü ile hizalanması. Her üç örnekte de, erkek solucanlar feromonun bulunduğu yere başarıyla ulaştı. Vücut bükülmesinin neden olduğu hareketi filtrelemek için verilerin ortalaması 20 kare üzerinden alındı. Deneyler 10 cm'lik bir petri kabı üzerinde gerçekleştirilir ve bu protokolde belirtilen video tabanlı toplu kemorezidans testi yöntemi (bkz. protokol bölüm 7.3.7.2) izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, erkek kemoçekitivite yanıtlarını ölçmek için sağlam bir kemorekattraction testi oluşturmanın yanı sıra C. elegans'tan uçucu seks feromonlarının ekstraksiyonu için sağlam bir metodoloji sağlar. Ek bilgiler WormLab kullanıcı kılavuzunda bulunabilir (Malzeme Tablosuna bakın); Solucan hareketinin yörüngesini görselleştirmek için temel bir kod için protokol bölüm 7.3.8.5'e bakın. Protokoldeki birkaç önemli adım sonuç için önemlidir. İlk olarak, solucan popülasyonlarının dikkatli bir şekilde senkronize edilmesi, yaşı ve üreme durumunu kontrol etmek, bakire dişilerden veya spermi tükenmiş hermafroditlerden uçucu seks feromonlarının başarılı bir şekilde çıkarılmasını sağlamak için gereklidir29,34. İkinci olarak, bakterileri tamamen uzaklaştırmak için tekrarlanan yıkama adımları gereklidir ve sonraki kemotaksis deneylerinde feromon sinyaline müdahale edebilecek kontaminasyonu en aza indirir. Daha sonra, cezbedici konsantrasyonu, plaka boyutu ve test süresi gibi tahlil parametrelerinin seçimi, sonuçları etkileyebilir ve belirli deneysel hedeflere göre uyarlanmalıdır.

Doğru kuruma süreleri ve test noktalarının tutarlı aralıkları, güvenilir kemotaksis tahlil sonuçları için kritik öneme sahiptir. Islak plakalar kemotaksis indeksini önemli ölçüde etkiler. Agar yüzeyinde bir su tabakası kalırsa, kılcal kuvvetler solucanları başlangıç noktasında hapsedebilir. Bu, hareketlerini engelleyebilir ve tahlilde yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, uzun süreli kuruma süreleri, daha sonra serbest bırakılanlar için farklı bir zorluk teşkil eder. Plaka kurudukça, uçucu feromon bileşenleri buharlaşır ve yayılır, bu da daha az belirgin bir konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bu, daha sonra salınan solucanların, daha sonra hareket etmekte özgür olsalar bile, hedef feromonu bulmasını zorlaştırır. Bu nedenle, deneyin sonuçlarını etkileyebilecek herhangi bir yüzey nemini ortadan kaldırmak için plakaların yeterince kuru olduğundan emin olun.

Plakalara eklenen agar çözeltisinin hacmi, optimum tahlil koşulları sağlamak için deneyin özel gereksinimlerine göre ayarlanmalıdır. Agar tabakasının kalınlığı, tabağa dökülen agar çözeltisinin miktarı değiştirilerek ayarlanır. Tipik olarak, cezbedici ve agar plakası arasındaki daha kısa bir mesafe daha sağlam sonuçlara yol açar. Tersine, daha uzun bir mesafe, uçucu olmayan bileşenlerin etkilerini ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir ve uçucu cezbedici maddenin etkisinin daha net bir değerlendirmesini sağlar. Agar kalınlığı, Şekil 2B'de gösterildiği gibi özel deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanabilir.

Erken toplanan solucanların kurumasını ve sağlıksız hale gelmesini önlemek için 20 solucan toplama işlemi 1-2 dakikayı geçmemelidir, bu da sonuçları etkileyebilir. Erken salınan solucanların başlangıç noktasından rastgele çok uzağa yürümesini önlemek için solucanların test plakasına aynı anda salındığından emin olun. Bu adımdaki gecikmeler, numuneler arasında değişken başlangıç konumlarına yol açarak haksız karşılaştırmalara neden olabilir. Erkeklerin toplanmasından kapağın kapatılmasına kadar tüm süreç 2 ila 5 dakika sürmelidir.

Deneysel/kontrol noktaları ile test plakası üzerindeki başlangıç noktası arasındaki boşluğu, plaka boyutuna ve deneyin özel hedeflerine göre uyarlayın. Noktalar arasındaki mesafeyi artırmak, testi daha zor hale getirebilir, bu da ince etkileri tespit etmek için faydalıdır. Tersine, mesafeyi azaltmak, ciddi kusurları vurgulayan daha sağlam bir tahlil testi oluşturur.

Protokolün çeşitli noktalarında sorun giderme gerekli olabilir. Ekstrakte edilen feromon bir kemotaksis tepkisine neden olmazsa, kaynak dişilerin ve hermafroditlerin yaşını ve üreme durumunu dikkatlice doğrulayın. Sadece bakire dişiler veya spermi tükenmiş hermafroditler hedef feromonu üretecektir. C. elegans erkeklerinin yüksek çiftleşme verimliliği nedeniyle, L4 dişi izolasyon plakasında tek bir erkeğin bile bulunması sonuçları büyük ölçüde etkileyebilir. Ek olarak, ekstraksiyon işlemi boyunca bakteriyel kontaminasyonun kontrolünü sağlayın. Bu ekstraksiyon protokolü, ham uçucu seks feromonları elde etmek için basit bir yol sunarken, belirli sınırlamaları vardır. Ham feromon özütü, diğer sinyal moleküllerinin izlerini içerebilir, bu da seks feromonunun kendisinin spesifik etkilerini kesin olarak izole etmeyi zorlaştırır. Uçucu seks feromonunun fonksiyonel bileşenleri henüz tanımlanmamıştır. Bir günlük bakire dişilerin ve altı günlük hermafroditlerin cinsiyet feromonları arasında işlevsel bir fark bildirilmemiş olsa da, ince bir fark olasılığı göz ardı edilemez.

Kemocazibe testinde, düşük bir kemotaksis indeksi, test edilen erkeklerin sağlık veya gelişim aşaması ile ilgili bir sorunu gösterebilir. En iyi sonuçları elde etmek için, kontaminasyon olmadan temiz bir OP50 plakasında 20 ° C'de yetiştirilen sağlıklı bir günlük yetişkin erkekleri kullanın. Daha düşük depolama sıcaklıklarından (15 °C gibi) 20 °C'ye kadar ani sıcaklık değişiklikleri, üç nesle kadar kemoçekim davranışını olumsuz etkileyebilir. En iyi uygulama için, yakın zamanda çözülen veya daha düşük sıcaklıklarda tutulan suşların, kullanmadan önce üç nesilden fazla bir süre boyunca 20 °C'ye uyum sağlamasına izin verin. Test erkeklerinin test gününden bir gün önce L4 aşamasında izole edilmesi tavsiye edilirken, kesinlikle gerekli değildir. Yetişkin hermafroditlere ön maruziyet, kemorezidans test sonuçlarını önemli ölçüde etkilemez. Bir günlük hermafroditler, kendi kendine spermin varlığından dolayı uçucu seks feromonları üretmezler. Bu nedenle, büyük ölçekli tarama yapılırken L4 erkek izolasyonu atlanabilir. Bununla birlikte, önceki çiftleşme deneyiminin veya diğer ilgili çalışmaların etkilerini özel olarak araştıran çalışmalar için, test gününden 1 gün önce L4 evresindeki erkekleri izole etmek gereklidir.

C. elegans'taki him-5 mutasyonu, erkeklerin ebeveyninde mayoz bölünme sırasında X kromozomu ayrılmama oranının artması nedeniyle erkeklerde yüksek insidansa neden olur. Bu nedenle, erkeklerin kemotaksis için gerekli olan kemosensör sistemi hala sağlamdır. Bu, tahlil için çok sayıda erkek elde etmeyi kolaylaştırır. Sonuç olarak, him-5 erkekleri, WT N2 erkekleriyle karşılaştırılabilir sağlam kemotaksis sergiler ve bu da onları seks feromon kemotaksisi deneylerinde uygun bir kontrol haline getirir.

Dikkat edilmesi gereken diğer noktalar:
Sodyum azid değişimi: Video kaydı sırasında solucanları felç etmek için kullanılan sodyum azidden kaçınılabilir. Bunun yerine, solucanları geçici olarak hareketsiz hale getirmek için bir damla M9 solüsyonu kullanın, ancak yüzey gerilimi video tabanlı test için yeterlidir.

Solucan yoğunluğu: Aşırı kalabalığı önlemek ve optimum koşulları korumak için plaka başına solucan sayısını sınırlayın. Aşırı kalabalık, video sonrası analizi etkileyecektir, çünkü program, birbirleriyle örtüşürlerse solucanları tanımlamada zorluk çekecektir. 6 cm'lik bir Petri kabı için en fazla 20 solucan, 10 cm'lik bir tabak için 100 solucan önerilir.

Geleneksel kemocazibe tahlilleri, veri toplama için minimum çaba gerektiren basit bir yaklaşım sunar. Bu tahliller, kemotaksis yanıtına hızlı bir genel bakış sağlarken, yalnızca karmaşık bir davranışsal yanıtın son noktasını yakalarlar. Bu, feromon algısının ve lokomotor tepkinin ayrıntılarını ortaya çıkarma yeteneklerini sınırlar. Buna karşılık, gelişmiş yörünge analizi, bireysel ve kolektif hareket kalıpları hakkında içgörüler sağlar. Bu yaklaşım, yalnızca uç nokta tabanlı ölçümlerin gözden kaçırdığı farklılıkları ortaya çıkarır. Bu yöntem, test popülasyonları içindeki ayrıntılı kinetik modellerin ve yanıt değişkenliğinin ayrıntılı olarak araştırılmasına izin vererek, kemosensoriyel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde geliştirir. Bu, testin çeşitli araştırma sorularına uygulanabilirliğini vurgular ve deneysel tasarımda bireysel değişkenliği dikkate almanın önemini vurgular.

Bu metodoloji, C. elegans'ta uçucu seks feromonlarını incelemek için bir çerçeve sunar. Uçucu seks feromon sentezi, salgılanması ve algılanması ile ilgili gen keşfini kolaylaştırabilir ve moleküler ve nöral devre düzeyinde kimyasal iletişim anlayışımızı ilerletebilir. Ek olarak, kemocazibe tahlili ve yörünge veri analizi, C. elegans'taki diğer kemoatraktanları araştırmak için kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizimizde kullanılan yörünge görselleştirmeleri için kod tasarladığı ve yazdığı için Dr. Tingtao Zhou'ya minnettarız. Bu çalışma, R01 NS113119 (PWS), Chen kıdemli doktora sonrası bursu ve Tianqiao ve Chrissy Chen Sinirbilim Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm Petri dishesFalcon25373-100Falcon bakteriyolojik Petri kabı 100 x 15 mm
6 cm Petri dishesFalcon25373-085Falcon bakteriyolojik Petri kabı 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)CGC
SantrifüjEppendorfsantrifüj 5418 Her marka çalışmalıdır.
Kemoseçicilik analiz plakalarıEv yapımı çözeltiN/A% 1.5 agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-baz ve 3.5 mM Tris-Cl
KolesterolAlfa Aesar57-88-5
Diseksiyon MikroskobuLeicaLeicaMZ75 Her marka çalışmalıdır.
E. Coli OP50CGC
EtanolKoptec64-17-5
fog-2(q71) (JK574)CGC
him-5(e1490)(CB4088)CGC
Ev temizleyiciClorox Germicidal konsantre temizleyici Bleach
M9 tamponuEv yapımı çözeltiN/A3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O 1 L'ye. Sterilize by autoclaving. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin.
Magnezyum Sülfat, Susuz, TozMacronM1063-500GM-EA
MikrodalgaTOSHIBAN/A Her marka çalışmalıdır.
N2CGC
NaOHSigma-aldrichS318-31 M
NGM plaka çözeltisiEv yapımı çözeltiN/A2.5 g Pepton, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O 1 L'ye. Sterilize by autoclaving. Otoklav bittiğinde (2 saat), ortamın sıcaklığı 65 °C'ye düşene kadar bekleyin. 65 °C'de bir hotplate'e koyun ve karıştırın. Ardından aşağıdakileri ekleyin, her birini beş dakika bekletin, kristalleşmeyi önlemek için: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Kolesterol (etanol içinde 5 mg/mL).
ParafilmBemis13-374-10Bemis Parafilm M Laboratuvar Sargı Filmi
PeptonVWR97063-324
Pipet- aidDrummond Scientific 4-000-100 Her marka çalışmalıdır.
Plastik kağıt OctagoSu Geçirmez Ekran Baskı Inkjet Şeffaflık Filmihttps://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potasyum klorürSigma-aldrichSLBP2366V
Potasyum fosfatSpectrum7778-77-0
PipetEppendorfSKU: EPPR4331; MFG#: 223130000620 - 200 µL, 100 - 1000 µL, herhangi bir marka çalışmalıdır.
RotatörLabnetSKU: LI-H5500 Labnet H5500 Mini LabRoller Çift Yönlü Rotator. Her marka çalışmalıdır.
Sodyum klorürVWR7647-14-5
sodyum fosfat dibazikSigma-aldrichSLCG3888
Tris-bazSigma-aldrich77-86-1
Tris-Cl Roche1185-53-1
TriptonVWR97063-390
VortexScientific industriesVortex-Genie 2 Her marka çalışmalıdır.
WormLab sistemi MBF BioscienceN/Ahttps://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
WormpickerEv yapımı N/APlatin ve cam pipet uçlarıyla yapıldı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Audesirk, T. E. Chemoreception in Alphysia californica. Iii. Evidence for pheromones influencing reproductive behavior. Behav Biol. 20 (2), 235-243 (1977).
  2. Traynor, K. S., Le Conte, Y., Page, R. E. Jr Queen and young larval pheromones impact nursing and reproductive physiology of honey bee (Apis mellifera) workers. Behav Ecol Sociobiol. 68 (12), 2059-2073 (2014).
  3. Cowley, J. J., Wise, D. R. Pheromones, growth and behaviour. Ciba Found Study Group. 35, 144-170 (1970).
  4. Epple, G. Pheromones in primate reproduction and social behavior. Adv Behav Biol. 11, 131-155 (1974).
  5. Levinson, H. Z. Possibilities of using insectistatics and pheromones in pest control. Naturwissenschaften. 62 (6), 272-282 (1975).
  6. Roelofs, W. Manipulating sex pheromones for insect suppression. Environ Lett. 8 (1), 41-59 (1975).
  7. Marchlewska-Koj, A. Pheromones and mammalian reproduction. Oxf Rev Reprod Biol. 6, 266-302 (1984).
  8. Keverne, E. B. Neuroendocrinology briefings 11: Pheromones and reproduction. J Neuroendocrinol. 12 (11), 1045-1046 (2000).
  9. Rekwot, P. I., Ogwu, D., Oyedipe, E. O., Sekoni, V. O. The role of pheromones and biostimulation in animal reproduction. Anim Reprod Sci. 65 (3-4), 157-170 (2001).
  10. Gomez-Diaz, C., Benton, R. The joy of sex pheromones. EMBO reports. 14 (10), 874-883 (2013).
  11. Shorey, H. H., Gaston, L. K., Jefferson, R. N. Insect sex pheromones. Adv Pest Control Res. 8, 57-126 (1968).
  12. Bruce, H. M. Pheromones and behavior in mice. Acta Neurol Psychiatr Belg. 69 (7), 529-538 (1969).
  13. Shorey, H. H., Bartell, R. J. Role of a volatile female sex pheromone in stimulating male courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 18 (1), 159-164 (1970).
  14. Bobadoye, B., et al. Evidence of aggregation-sex pheromone use by longhorned beetles (coleoptera: Cerambycidae) species native to Africa. Environ Entomol. 48 (1), 189-192 (2019).
  15. Saunders, J. R. Sex pheromones in bacteria. Nature. 275 (5682), 692-694 (1978).
  16. Schulz, S., Toft, S. Identification of a sex pheromone from a spider. Science. 260 (5114), 1635-1637 (1993).
  17. Finnegan, D. E., Chambers, J. Identification of the sex pheromone of the guernsey carpet beetle, Anthrenussarnicus mroczkowski (coleoptera: Dermestidae). J Chem Ecol. 19 (5), 971-983 (1993).
  18. Vaillancourt, L. J., Raudaskoski, M., Specht, C. A., Raper, C. A. Multiple genes encoding pheromones and a pheromone receptor define the b beta 1 mating-type specificity in Schizophyllum commune. Genetics. 146 (2), 541-551 (1997).
  19. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-22 (2013).
  20. Sakai, N., et al. A sexually conditioned switch of chemosensory behavior in C. elegans. PLoS One. 8 (7), e68676(2013).
  21. Sengupta, S., Smith, D. P. How Drosophila detect volatile pheromones: signaling, circuits, and behavior. Neurobiology of chemical communication. Mucignat-Caretta, C. , CRC Press. (2014).
  22. Zhang, Y. K., Reilly, D. K., Yu, J., Srinivasan, J., Schroeder, F. C. Photoaffinity probes for nematode pheromone receptor identification. Org Biomol Chem. 18 (1), 36-40 (2019).
  23. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Dynamic regulation of adult-specific functions of the nervous system by signaling from the reproductive system. Curr Biol. 29 (23), 4116-4123.e3 (2019).
  24. Wan, X., et al. SRD-1 in AWA neurons is the receptor for female volatile sex pheromones in C. elegans males. EMBO Rep. 20 (3), e46288(2019).
  25. Peckol, E. L., Troemel, E. R., Bargmann, C. I. Sensory experience and sensory activity regulate chemosensory receptor gene expression in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (20), 11032-11038 (2001).
  26. Jang, H., et al. Neuromodulatory state and sex specify alternative behaviors through antagonistic synaptic pathways in. C. elegans. Neuron. 75 (4), 585-592 (2012).
  27. Liu, K. S., Sternberg, P. W. Sensory regulation of male mating behavior in Caenorhabditis elegans. Neuron. 14 (1), 79-89 (1995).
  28. Chasnov, J. R., Chow, K. L. Why are there males in the hermaphroditic species Caenorhabditis elegans. Genetics. 160 (3), 983-994 (2002).
  29. Chasnov, J. R., So, W. K., Chan, C. M., Chow, K. L. The species, sex, and stage specificity of a Caenorhabditis sex pheromone. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (16), 6730-6735 (2007).
  30. Susoy, V., et al. Natural sensory context drives diverse brain-wide activity during C. elegans mating. Cell. 184 (20), 5122-5137.e17 (2021).
  31. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  32. Click, A., Savaliya, C. H., Kienle, S., Herrmann, M., Pires-Dasilva, A. Natural variation of outcrossing in the hermaphroditic nematode Pristionchus pacificus. BMC Evol Biol. 9, 75(2009).
  33. Anderson, J. L., Morran, L. T., Phillips, P. C. Outcrossing and the maintenance of males within C. elegans populations. J Hered. 101 (suppl_1), S62-S74 (2010).
  34. Leighton, D. H., Choe, A., Wu, S. Y., Sternberg, P. W. Communication between oocytes and somatic cells regulates volatile pheromone production in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 17905-17910 (2014).
  35. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  36. Fagan, K. A., et al. A single-neuron chemosensory switch determines the valence of a sexually dimorphic sensory behavior. Curr Biol. 28 (6), 902-914.e5 (2018).
  37. Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: A genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24 (34), 7427-7434 (2004).
  38. Frady, E. P., Palmer, C. R., Kristan, W. B. Jr Sexual attraction: Sex-specific wiring of neural circuitry. Curr Biol. 22 (22), R953-R956 (2012).
  39. Liu, Q., et al. Two preputial gland-secreted pheromones evoke sexually dimorphic neural pathways in the mouse vomeronasal system. Front Cell Neurosci. 13, 455(2019).
  40. Ludewig, A. H., et al. Pheromone sensing regulates Caenorhabditis elegans lifespan and stress resistance via the deacetylase sir-2.1. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5522-5527 (2013).
  41. Golden, J. W., Riddle, D. L. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
  42. Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nat Chem Biol. 3 (7), 420-422 (2007).
  43. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
  44. Butcher, R. A., Ragains, J. R., Kim, E., Clardy, J. A potent dauer pheromone component in Caenorhabditis elegans that acts synergistically with other components. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14288-14292 (2008).
  45. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Counteracting ascarosides act through distinct neurons to determine the sexual identity of C. elegans pheromones. Curr Biol. 27 (17), 2589-2599.e3 (2017).
  46. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Sex pheromones of C. elegans males prime the female reproductive system and ameliorate the effects of heat stress. PLoS Genet. 11 (12), e1005729(2015).
  47. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  48. Kaplan, F., et al. Ascaroside expression in Caenorhabditis elegans is strongly dependent on diet and developmental stage. PLoS One. 6 (3), e17804(2011).
  49. Pungaliya, C., et al. A shortcut to identifying small molecule signals that regulate behavior and development in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (19), 7708-7713 (2009).
  50. Srinivasan, J., et al. A modular library of small molecule signals regulates social behaviors in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10 (1), e1001237(2012).
  51. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  52. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
  53. Von Reuss, S. H., et al. Comparative metabolomics reveals biogenesis of ascarosides, a modular library of small-molecule signals in C. elegans. J Am Chem Soc. 134 (3), 1817-1824 (2012).
  54. Choe, A., et al. Sex-specific mating pheromones in the nematode panagrellus redivivus. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20949-20954 (2012).
  55. Hsueh, Y. P., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Sternberg, P. W. Nematode-trapping fungi eavesdrop on nematode pheromones. Curr Biol. 23 (1), 83-86 (2013).
  56. Hong, M., et al. Early pheromone experience modifies a synaptic activity to influence adult pheromone responses of C. elegans. Curr Biol. 27 (20), 3168-3177.e3 (2017).
  57. Ryu, L., et al. Feeding state regulates pheromone-mediated avoidance behavior via the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 37 (15), e98402(2018).
  58. Diaz, S. A., Lindström, J., Haydon, D. T. Basic demography of Caenorhabditis remanei cultured under standard laboratory conditions. J Nematol. 40 (3), 167(2008).
  59. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook : the online review of C.elegans biology. , 1-29 (2006).
  60. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. JoVE: J Vis Exp. (74), e50069(2013).
  61. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

U ucu FeromonKemotaksi DeneyiErkek ekimiFeromon KantifikasyonuSolucan SenkronizasyonuY r nge AnaliziNematod leti imi

İlgili makaleler