Dişi C57BL/6J Farelerde Psikiyatrik Bozukluklar için Çoklu Entegre Sosyal Stres Modeli

Yüz milyonlarca insan psikiyatrik bozukluklarla yaşıyor, en yaygın olanları anksiyete ve depresif bozukluklar. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, 2019 yılında dünya çapında sırasıyla 280 milyondan fazla ve 301 milyondan fazla insan depresyon ve anksiyete ile yaşıyordu¹. COVID-19 salgını nedeniyle, anksiyete ve depresif bozukluklardan etkilenen insan sayısı sadece bir yıl içinde sırasıyla %26 ve %28 oranında önemli ölçüde arttı. Etkilenenler arasında, kadınlarda psikiyatrik bozuklukların yaşam boyu prevalansı erkeklere göre neredeyse iki kat daha yüksektir², kadınlar daha şiddetli semptomlar, daha fazla fonksiyonel bozukluk, atipik depresif fenotipler, daha sık nüksler ve ilaçlara daha düşük yanıt ^3,4,5.

Psikiyatrik bozuklukların birçok yönündeki cinsiyet farklılıkları iyi belgelenmiş olmasına rağmen ^6,7,8, klinik öncesi araştırmaların çoğu, öncelikle uygun dişi hayvan modellerinin olmaması nedeniyle ağırlıklı olarak erkek deneklere odaklanmıştır ^9,10. Sonuç olarak, kadınlarda bu bozuklukların patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, kadınlarda psikiyatrik bozuklukların altında yatan nörobiyolojik mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştıracak kadın denekleri içeren hayvan modellerinin geliştirilmesine acil ihtiyacı vurgulamaktadır.

Tekrarlanan sosyal yenilgi stresi (RSDS) paradigmasına dayalı olarak dişi fareler için artan sayıda sosyal stres modeli geliştirilmiştir 11,12,13,14. Örneğin, dişi farelerde yakın zamanda kurulan iki RSDS modeli, dişi farelere erkek idrarının uygulanması ve erkek saldırganlarda ventromedial hipotalamusun ventrolateral alt bölümünün kemogenetik aktivasyonu yoluyla erkek saldırganlığının yapay olarak arttırılmasını içeriyordu 11,12,13. Bununla birlikte, bu indüklenmiş agresif davranışların doğal olarak meydana gelmediği ve dişi fareler için ilgili stres faktörlerini temsil etmeyebileceği iddia edilmiştir¹⁰. Ek olarak, montaj davranışından kaynaklanan gebelik, sonraki mekanik çalışmaları zorlaştırır.

RSDS tabanlı bir başka değiştirilmiş model, dişi farelerin erkekler arası sosyal yenilgiye görsel olarak tanık olduğu dolaylı sosyal yenilgi stresi paradigmasıdır¹². Çeşitli kemirgen suşlarında dişi-dişi sosyal yenilgi protokolleri de geliştirilmiştir 14,15,16. Bazı endişelere rağmen, bu son iki modelde kullanılan sosyal stresörlerin etiyolojik olarak insan psikiyatrik bozukluklarıyla daha ilgili olduğu görülmektedir¹⁴. İdeal bir depresyon modeli, yapı (etiyolojik) geçerliliği gerektirir, yani modelde kullanılan strese neden olan yöntemlerin, bozukluğun gerçek yaşam nedenlerini yakından yansıtması gerektiği anlamına gelir.

Psikiyatrik bozuklukların etiyolojisinin biyolojik, genetik, çevresel ve psikososyal faktörleri içeren multifaktöriyel olduğuna inanılmaktadır. Laboratuvar hayvanlarında bu risk faktörlerini manipüle etmek, mekanik araştırma ve ilaç taraması için ilgili modellerin geliştirilmesi için çok önemlidir. Bir veya daha fazla stres etkenini simüle eden hem sosyal hem de sosyal olmayan hayvan modelleri, insan psikiyatrik bozukluklarıyla ilişkili temel semptomları ve nörobiyolojik değişiklikleri çoğaltabilir. Örneğin, kronik hafif stres (CMS) modeli, birden fazla fiziksel stres faktörünün rastgele değişen kombinasyonlarını (örneğin, ıslak yataklama, kuyruk süspansiyonu, kuyruk kenetleme, oruç) stabil ve etkili nöropatolojik ve depresif benzeri davranışsal fenotiplere neden olur17,18,19,20,21,22,23. Bu bulgular, çoklu risk faktörlerinin tekrarlanan modellenmesinin, psikiyatrik bozuklukları incelemek için paradigmalar oluşturmak için uygun bir strateji olduğunu göstermektedir. Kronik sosyal yenilgi stresi (CSDS) modeli, sosyal stresörleri simüle eden depresyon için en yaygın kullanılan paradigmalardan biridir 24,25,26. Bu model tek bir stres etkeni türünü taklit etmekle sınırlı olsa da, etiyolojik önemi translasyonel araştırmalarda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Örneğin, CSDS tabanlı çalışmalar, ventral tegmental alandaki dopaminerjik nöronlar üzerindeki potasyum (K⁺) kanallarını depresyona karşı dayanıklılığa aracılık eden anahtar hedefler olarak tanımlamış ve hem depresif benzeri farelerde hem de depresyonu olan hastalarda umut verici antidepresan adaylar olarak retigabin (ezogabin) gibi KCNQ tipi K⁺ kanal açıcılarını vurgulamıştır 27,28,29,30,31. Sonuç olarak, birkaç ufuk açıcı çalışma, kadına yönelik saldırganlığı indükleyerek kadın depresyonunu modellemek için CSDS paradigmasını değiştirmeye çalışmıştır^11,12. Yukarıdaki kanıtlar, çoklu sosyal stres faktörlerinin tekrarlanan maruziyetle entegre edilmesinin, dişi hayvanlarda psikiyatrik modellerin geliştirilmesi için önemli bir yönü temsil ettiği fikrini desteklemektedir.

Dişi C57BL / 6J farelerinde, psikiyatrik bozuklukları modellemek için yakın zamanda 10 günlük çoklu entegre sosyal stres (MISS) paradigması geliştirildi ve güvenilir etiyolojik, yüz, yapı ve öngörücü geçerlilikler gösterdi³². MISS modelini oluşturmak için, dişi C57BL / 6J fareleri, art arda 10 gün boyunca her gün rastgele olarak dört ardışık stresöre maruz bırakıldı: sosyal rekabette başarısızlık (tüp testi), modifiye edilmiş dolaylı sosyal yenilgi stresi, kaçınılmaz aşırı kalabalık stresi ve müteakip sosyal izolasyon³². Bu çalışma, MISS paradigmasını modellemek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Tüm deneysel prosedürler, Xuzhou Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Onay No. 202207S127) tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu deneylerde kullanılan C57BL / 6J dişi fareler (denek fareler için 7-8 haftalık; kazanan adaylar için 10-14 haftalık), C57BL / 6J erkek fareler (agresif CD1 taraması için 7-8 haftalık) ve CD1 emekli damızlık fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Tüm fareler, ad libitum³³ sağlanan yiyecek ve su ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında barındırıldı. MISS paradigmasının başlatılmasından önce, her kohort için zorunlu olmasa da, sonraki davranışsal sonuçların bireysel değişkenlikten ziyade strese maruz kalmaya atfedilebildiğinden emin olmak için temel davranışsal ölçümler alındı. Tam protokole genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur ve tamamlanan deney kurulumları Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Alışkanlık

1. Çevreye alışma
   1. 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsünde sabit bir sıcaklık (23 °C ± 2 °C), nem (%50-%60) ve ışık yoğunluğunu (15-20 lüks) koruyarak MISS protokolü için özel olarak ayrı bir oda belirleyin.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm modelleme süresi boyunca bu odada ev fareleri bulundurun.
   2. Çelik tel kapaklı ve mısır koçanı yataklı standart fare kafesleri (U × G × Y: 37 cm × 16 cm × 12 cm) hazırlayın.
   3. 7-8 haftalık C57BL / 6J dişi fareleri denek faresi olarak kullanın. Fareleri rastgele naif ve MISS gruplarına atayın ve onları kafes başına beş fareye yerleştirin.
      NOT: Deney için karşılaştırılabilir yaş ve vücut ağırlığına sahip dişi fareleri seçin.
   4. 10-14 haftalık C57BL / 6J dişi fareleri kazanan taraması³⁰ için aday olarak kullanın. İstikrarlı sosyal rütbeler oluşturmak için bu fareleri kafes başına dört kişilik gruplar halinde barındırın.
   5. Erkek CD1 emekli damızlık fareleri saldırgan adaylar olarak kullanın. Ev CD1 fareleri, bölgesellik oluşturmak ve kavgayı önlemek için ayrı ayrı. Agresif CD1 taraması için davetsiz misafir olarak kohort tarafından yetiştirilen C57BL / 6J erkek fareleri (kafes başına 5 fare, 7-8 haftalık yaş) kullanın.
   6. Tüm farelerin satın alındıktan sonra 7 gün boyunca alışmasına ve nakliye stresinden kurtulmasına izin verin (Şekil 1A1).
   7. Tüm fareleri ad libitum yiyecek ve su ile barındırın.
2. Tüplere alışma ve kullanım
   1. Dişi denek farelerin ve kazanan adayların her kafesine kısa bir akrilik tüp (Şekil 2A; 10 cm uzunluğunda, 26 mm iç çap) yerleştirin. Farelerin tüplere alışmasına ve 3 gün boyunca içlerinden geçmeyi öğrenmesine izin verin.
      NOT: Tüpün çapı, bir yetişkin farenin dönmeden sorunsuz bir şekilde geçmesine izin vermek için yeterli olmalıdır.
   2. Tanıdık olmayan deneycilerle ilgili stresi azaltmak için dişi denek farelerini ve kazanan adayları 3 gün boyunca 1-2 dakika / gün boyunca ele alın (Şekil 1A2).
   3. Alışma süresinin sonunda, her farenin kuyruğunu kırmızı veya siyah yağ bazlı bir işaretleyici ile işaretleyin.
      NOT: İşaretleri düzenli olarak kontrol edin ve gerekirse yeniden uygulayın.

2. Tüp yarışması, kazanan taraması ve CD1 saldırgan taraması için eğitim

1. Tüp yarışması için eğitim
   NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için önceki raporlara^{bakın 32,34}.
   1. Dişi denek fareleri, dişi kazanan adayları, şeffaf akrilik tüpler (Şekil 2B; 30 cm uzunluğunda, 26 mm iç çap), plastik çubuklar, %75 etanol ve kağıt havlular hazırlayın. Koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için masayı, tüpleri ve plastik çubukları %75 etanol ile temizleyin.
   2. Her bir kadın denek faresinin veya kazanan adayın kuyruğunu nazikçe kavrayın ve fareyi masanın üzerine yerleştirin. Çevresel iklimlendirme için yaklaşık 1 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin.
   3. Fareyi kuyruğundan tutun ve tüpün bir ucuna yerleştirin.
      NOT: Stresi en aza indirmek ve girişi kolaylaştırmak için farenin kafasının tüpün ucuna baktığından ve ön pençeleri masaya değecek şekilde emin olun.
   4. Fare tüpe girdiğinde kuyruğu serbest bırakın ve gönüllü olarak geçmesine izin verin.
      NOT: Fare durursa veya geri gitmeye çalışırsa kuyruğa hafifçe dokunmak için plastik bir çubuk kullanın.
   5. Fareyi tüpün diğer ucuna yerleştirin ve 2.1.4 adımını tekrarlayın. 2.1.3 - 2.1.5 arasındaki adımları bir döngü olarak sayın.
   6. İki döngü için 2.1.3 ve 2.1.5 adımlarını tekrarlayın (Şekil 1B1).
   7. Fareyi ev kafesine geri koyun. Kokuları, idrarı ve dışkıyı gidermek için tüpü %75 etanol ile temizleyin.
      NOT: Bir sonraki fare ile kullanmadan önce tüpün temiz, kuru ve artık alkol kokusundan arınmış olduğundan emin olun.
   8. Tüm dişi fareler için 2.1.2-2.1.7 adımlarını art arda 3 gün boyunca tekrarlayın ve her farenin tüpten geçmeye alıştığından emin olun.
2. Kazanan gösterimi
   NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için önceki raporlara^{bakın 32,34}.
   1. Kazanan kadın adaylar, tüpler (30 cm uzunluğunda, 26 mm iç çap), plastik çubuklar, %75 etanol, kağıt havlu ve zamanlayıcı hazırlayın. Koku ipuçlarını en aza indirmek için ekipmanı temizleyin ve kurulayın.
   2. Taramadan önce, her fareyi bir döngü boyunca tüpten geçecek şekilde yeniden eğitin. Tüpün üzerine görünür bir orta çizgi çizin.
   3. Her iki fareyi de kuyruklarından tutun ve tüpün zıt uçlarına yerleştirin. Orta noktaya girmelerine ve buluşmalarına izin verin, ardından aynı anda serbest bırakın ve zamanlayıcıyı başlatın.
      NOT: Her yarışma için aynı kafesten fareler kullanın.
   4. "Kazananı", diğerini tüpten dışarı iten fare olarak tanımlayın; 1 puan verin. "Kaybeden" 0 puan alır.
      NOT: Kazananın geri çekilmesini önlemek için plastik bir çubuk kullanın. Her iki fare de donar ve 1 dakika içinde geri çekilmezse, hemen harekete geçmek için her farenin kuyruğuna plastik çubuklarla hafifçe dokunun.
   5. Farelerin başlangıç pozisyonlarını tersine çevirin ve 2.2.3-2.2.4 adımlarını tekrarlayın, sonucu tekrar puanlayın (Şekil 1B2).
   6. Her iki fareyi de ev kafeslerine geri koyun ve tüpü %75 etanol ile iyice temizleyin.
   7. Her fareyi diğer tüm kafes arkadaşlarıyla eşleştirmek için hepsini bir kez deneme formatı kullanın ve her çift için 2.2.3-2.2.5 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Bu yaklaşım, kapsamlı ve adil bir sıralama sağlar.
   8. Fareleri toplam puanlara göre sıralayın. Sonraki deneyler için her kafesteki en yüksek puanlı fareyi "kazanan" olarak seçin.
3. CD1 saldırgan taraması
   NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için, önceki rapora^{bakın 35}.
   1. CD1 emekli damızlık fareler, C57BL / 6J erkek fareler (davetsiz misafirler) ve bir zamanlayıcı hazırlayın.
   2. Bir C57BL/6J erkek fareyi 3 dakika boyunca doğrudan bir CD1 erkeğinin (yerleşik saldırgan) ev kafesine yerleştirin.
      NOT: Davetsiz misafir oturum sırasında kaçamaz.
   3. İlk saldırının gecikme süresini, saldırı sayısını ve 3 dakikalık süre içinde saldırgan davranışların süresini saldırganlık göstergeleri olarak kaydedin.
   4. Her gün farklı davetsiz misafir fareler kullanarak art arda 3 gün boyunca 2.3.2-2.3.3 adımlarını günde bir kez tekrarlayın (Şekil 1B3).
   5. İki kritere dayalı daha fazla deney için CD1 farelerini saldırgan olarak seçin: (1) üç oturumdan en az ikisinde saldırmış olmaları gerekir ve (2) saldırı gecikmeleri her oturumda 1 dakikadan az olmalıdır.

3. Modelleme

NOT: Bu adım, tüp testinde sosyal rekabet başarısızlığına rastgele maruz kalmayı, modifiye edilmiş dolaylı sosyal yenilgi stresini ve kaçınılmaz aşırı kalabalık stresini ve ardından art arda 10 gün boyunca sosyal izolasyonu içerir.

1. Sosyal rekabet başarısızlığı
   NOT: Ayrıntılar için önceki raporlara^{bakın 32,34}.
   1. Dişi denek fareleri, ekranlanmış "kazanan" fareler, tüpler (30 cm uzunluğunda, 26 mm iç çap), plastik çubuklar, %75 etanol, kağıt havlu ve bir zamanlayıcı hazırlayın.
   2. Dişi denek farelerini tek tek (kafes başına 1 fare) ve saf fareleri gruplar halinde (kafes başına 5 fare) yeniden barındırın.
      NOT: Modellemenin başlangıcında saf fareleri yeni grup kafeslerine taşıyın. Modelleme süresi boyunca yeni bir kafese geçmek gerekli değildir.
   3. Koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için masayı, tüpleri ve plastik çubukları %75 etanol ile temizleyin.
   4. Fareleri ev kafeslerinden dikkatlice çıkarın. Tüpün zıt uçlarına bir MISS fare ve bir "kazanan" fare yerleştirin, böylece ileri doğru yürürler ve orta noktada buluşurlar. MISS fare, "kazanan" tarafından tüpün dışına itilecektir.
      NOT: "Kazananın" daha büyük boyutu, daha yüksek vücut ağırlığı ve baskın sosyal rütbesi, deneysel MISS faresinin neredeyse her zaman tüp yarışmasını kaybetmesini sağlar. Fareler 30 saniyeden fazla hareketsiz kalırsa, itmeyi teşvik etmek için kazananın kuyruğuna plastik bir çubukla hafifçe dokunun.
   5. İki farenin konumlarını değiştirin ve 3.1.4 adımını tekrarlayın. 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını bir döngü olarak sayın.
   6. MISS ve "kazanan" fareleri ev kafeslerine geri koyun. Kokuları gidermek için masayı, tüpü ve plastik çubuğu temizleyin.
   7. Yeni bir kazanan fareyi tanıtın ve aynı MISS fare ile 3.1.4-3.1.5 adımlarını tekrarlayın. Böylece her MISS faresi, art arda iki başarısız tüp yarışması döngüsüne tabi tutulur (Şekil 1C1, Şekil 2E).
   8. Arka arkaya 10 gün boyunca tüm MISS fareleri için 3.1.4-3.1.7 adımlarını tekrarlayın.
2. Değiştirilmiş dolaylı sosyal yenilgi stresi
   1. Elenmiş agresif CD1 emekli damızlık fareler (tek başına barındırılan), erkek C57BL / 6J fareler, dişi MISS fareler ve delikli akrilik örtüler hazırlayın (Şekil 2C; L × G × Y: 8 cm × 8 cm × 5,5 cm) delikli (üst panelde 5 × 5, yan duvarlarda 3 × 5; her delik 0,5 cm çapında).
   2. Agresif etkileşimlerin dolaylı olarak gözlemlenmesine izin vermek için bir CD1 saldırganının kafesine, delikli bir akrilik örtünün altına yerleştirilmiş bir dişi MISS faresi yerleştirin.
      NOT: Akrilik kapağın CD1 veya MISS fare ile olası devrilme olasılığını izleyin. CD1 kafeslerindeki mısır koçanı yataklarının azaltılması, devrilmeyi önlemeye yardımcı olur.
   3. CD1 faresi tarafından 10 dakika boyunca fiziksel saldırıya uğramak üzere bir erkek C57BL/6J davetsiz misafir fareyi kafese sokun. Dişi MISS fare, delikli kapaktan etkileşimi gözlemler (Şekil 1C2, Şekil 2F).
      NOT: Davetsiz misafir fare ciddi şekilde yaralanırsa, seansı hemen sonlandırın ve hayvanı tedavi edin. Küçük mısır koçanı peletlerinin kullanılması, dövüşler sırasında yatak takımlarının yer değiştirmesini artırarak MISS fare için sürükleyici deneyimi geliştirir.
   4. 10 dakika sonra, erkek davetsiz misafiri çıkarın ve dişi MISS farenin CD1 faresine 5 dakika daha duyusal maruz kalmasına izin verin.
   5. 3.2.3-3.2.4 adımlarını farklı erkek davetsiz misafirlerle iki kez daha tekrarlayın.
   6. MISS fareyi ev kafesine geri koyun. Erkek davetsiz misafirlerdeki herhangi bir yaralanmayı izleyin ve tedavi edin.
   7. Delikli akrilik kapakları temizleyin ve dökülen yatak takımlarını süpürün.
   8. Art arda 10 gün boyunca yeni bir CD1 emekli yetiştirici kullanarak 3.2.2-3.2.5 adımlarını tekrarlayın.
3. Kaçınılmaz aşırı kalabalık stresi
   1. Beyaz opak bir kılıf olan dişi MISS fareleri hazırlayın (Şekil 2D; L × G × Y: 14 cm × 10 cm × 20 cm), mısır koçanı yataklı standart fare kafesleri, %75 etanol, kağıt havlu ve zamanlayıcı.
   2. Opak manşonu yataklı standart bir kafesin içine yerleştirin.
   3. 12-15 dişi fareyi (tüm MISS fareleri veya diğer dişilerle karışık) günde 30 dakika boyunca manşonun içine sokun (Şekil 1C3, Şekil 2G).
      NOT: Çiğneme olmadan kalabalığı sağlamak için fare sayısını boyutlarına göre ayarlayın. Gerekirse manşonu şeffaf delikli bir kapakla kaplayarak kaçışı önleyin.
   4. Fareleri ev kafeslerine geri koyun ve kılıfı% 75 etanol ile temizleyin.
   5. 3.3.3 adımını art arda 10 gün boyunca tekrarlayın.
4. Sosyal izolasyon
   1. Dişi MISS fareleri ve mısır koçanı yataklı standart fare kafeslerini hazırlayın.
   2. Ev MISS fareleri, 10 günlük modelleme süresinin geri kalanında sosyal rekabet başarısızlığı, dolaylı yenilgi stresi veya aşırı kalabalık stresi yaşamadıklarında bireysel olarak (Şekil 1C4, Şekil 2H).
      NOT: Saf fareler kuyruk tarafından nazikçe geçici bir kafese aktarılır, daha sonra herhangi bir strese maruz kalmadan ev kafeslerine geri gönderilir. MISS farelerinde olduğu gibi yiyecek ve su ad libitum sağlayın.

4. Davranış testleri

NOT: Farelerde depresif benzeri ve anksiyete benzeri davranışları değerlendirmek için modellemeyi takip eden bir hafta içinde davranışsal deneyler yapılır. Her testten önce, dişi fareler 1 saatlik alışkanlık için davranışsal test odasına (15-20 lüks aydınlatma) taşınır. Her testten sonra, fareler orijinal barınma tesislerine geri gönderilir.

1. Sakkaroz tercih testi
   NOT: Ayrıntılar için önceki^{raporlara bakın} 36,37,38.
   1. Dişi denek fareleri, bilyeli tüplü içme şişeleri (50 mL), çelik tel üstleri olan standart fare kafesleri, sakaroz, elektronik terazi, dereceli silindir, karıştırma çubuğu, tartı kağıdı, su, defter ve kalem hazırlayın.
   2. Tüm dişi denek farelerini (saf ve MISS fareler) ayrı ayrı barındırın.
   3. Şişeleri içme suyuyla doldurun (hacmin ~ 2 / 3'ü).
      NOT: Deneye başlamadan önce şişelerde sızıntı olmadığından emin olun.
   4. Her fareye 2 günlük alışkanlık için yan yana yerleştirilmiş iki su dolu şişe sağlayın.
   5. % 1 sükroz suyu hazırlayın (99 mL su için 1 g sükroz).
   6. Testin başında, bir şişedeki suyu% 1 sükroz çözeltisi ile değiştirin. Her iki şişenin ilk ağırlıklarını kaydedin.
   7. 12 saat sonra, şişe ağırlıklarını tekrar kaydedin ve konumsal sapmayı önlemek için şişelerin konumlarını değiştirin.
   8. 24 saat sonra, son ağırlıkları kaydedin ve sükroz tercihini şu şekilde hesaplayın: Sükroz tercihi (%) = (Sükroz alımı / Toplam sıvı alımı) × 100
   9. Testin sonunda, fareleri normal su şişeleriyle ev kafeslerine geri koyun.
   10. Tüm şişeleri ve tükenmez tüpleri suyla iyice temizleyin.
2. Kuyruk süspansiyon testi
   NOT: Bu test³² , deney tasarımına bağlı olarak aynı veya ayrı bir fare kohortu üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada sakkaroz tercih testinden 3 gün sonra gerçekleştirilmiştir.
   1. Dişi denek fareleri, bir kuyruk süspansiyonu test kutusu (55 cm yüksekliğinde × 60 cm genişliğinde × 12 cm derinliğinde), yapışkan bant, kronometre, %75 alkol ve kağıt havlu hazırlayın.
   2. Video izleme sisteminin kurulması³⁹. Aktif bir bölge tanımlayın ve kaydı başlatın.
   3. Test kutusunu %75 etanol ile temizleyin.
   4. Fareyi kuyruğun ucundan ~2 cm uzağa nazikçe bantlayın ve başının kutunun altından ~25 cm uzakta olduğundan emin olarak baş aşağı asın.
      NOT: Sallanmayı en aza indirin ve gereksiz stresten kaçının.
   5. İzleme yazılımını kullanarak davranışı kaydedin³⁵ 6 dk. Analiz için son 4 dakikadan itibaren hareketsizlik süresini kullanın.
      NOT: Hareketsizlik, vücudun pasif olarak asılı kalmasıyla hareketin olmaması olarak tanımlanır. Fare düşerse veya yukarı çıkarsa verileri hariç tutun.
   6. Bandı dikkatlice çıkarın ve fareyi ev kafesine geri koyun.
3. Açık alan testi
   NOT: Ayrıntılar için önceki^{raporlara bakın 40,41}.
   1. Dişi denek fareleri, açık alan test kutusu (40 cm × 40 cm × 40 cm),% 75 etanol ve kağıt havlu hazırlayın.
   2. Video izleme sistemini kurun. Arenayı sanal olarak 4 × 4 alt alana bölün; Merkezi 4 birimi merkezi bölge ve geri kalanını çevresel bölge olarak tanımlayın.
   3. Test kutusunu %75 etanol ile temizleyin.
   4. Nesne faresini, başı aynı yöne bakacak şekilde nazikçe kutunun ortasına yerleştirin. 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
      NOT: Taşıma stresini azaltmak için transfer için bir palet kullanın.
   5. Video izleme sistemini kullanarak merkezi bölgede kat edilen toplam mesafeyi ve geçirilen süreyi kaydedin.
   6. Testin sonunda fareyi ev kafesine geri koyun ve cihazı temizleyin.
4. Yükseltilmiş artı labirent testi
   NOT: Ayrıntılar için önceki rapora^{bakın 32}.
   1. Dişi denek fareleri, yükseltilmiş bir artı labirent,% 75 etanol ve kağıt havlu hazırlayın.
      NOT: Labirent, her biri iki kollu (30 cm uzunluğunda × 5 cm genişliğinde) iki dikey pistten (yerden 50 cm yukarıda) oluşur. Bir set 15 cm yüksekliğinde duvarlara (kapalı kollar) sahipken, diğer set açıktır. Orta alan 5 cm × 5 cm'dir.
   2. Video izleme sistemini kurun ve açık kolları, kapalı kolları ve merkezi alanı tanımlayın.
   3. Labirenti% 75 etanol ile temizleyin.
   4. Fareyi nazikçe labirentin ortasına, açık bir kola bakacak şekilde yerleştirin. 5 dakika boyunca ücretsiz keşfe izin verin.
      NOT: Yerleştirme sırasında stresi en aza indirmek için bir palet kullanın.
   5. Takip sistemini kullanarak her bir kolda geçirilen süreyi kaydedin.
      NOT: Bir fare labirentten düşerse, verilerini hariç tutun.
   6. Fareyi ev kafesine geri koyun ve labirenti iyice temizleyin.

MISS maruziyetinin depresif benzeri davranış değişikliklerine neden olup olmadığını araştırmak için, MISS paradigmasına tabi tutulan dişi C57BL / 6J fareleri (grup başına n = 16; güç analizi ile belirlenen örneklem büyüklüğü, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'ye bakınız) sırasıyla depresyon-anhedoni ve davranışsal umutsuzluğun temel semptomlarını değerlendiren sükroz tercihi ve kuyruk süspansiyon testleri kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3A-F). Naif kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, MISS'e maruz kalan fareler, su alımında karşılık gelen bir değişiklik olmaksızın sakaroz tercihinde önemli bir azalma göstermiştir (Şekil 3C-D). Ek olarak, MISS grubundaki fareler, kuyruk süspansiyon testinde artan hareketsizlik süresi gösterdi (Şekil 3F), bu da davranışsal umutsuzluğun arttığını gösteriyor.

MISS maruziyetinin aynı zamanda kaygı benzeri davranışlara yol açıp açmadığını değerlendirmek için, fareler açık alanda test edildi ve artı labirent paradigmaları yükseltildi. MISS'e maruz kalan fareler, açık alanın merkezi bölgesinde (Şekil 4A-C) ve yükseltilmiş artı labirentin açık kollarında (Şekil 4D, E) saf kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha az zaman harcadılar.

Toplu olarak, bu bulgular MISS paradigmasına maruz kalmanın dişi farelerde hem depresif hem de anksiyete benzeri davranışlara neden olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: MISS modelinin şematik diyagramı. (A) Alışkanlık: Deney fareleri 7 gün boyunca taşıma stresinden kurtuldu, ardından 3 gün boyunca tüp alışkanlığı ve kullanımı izledi. (B) Eğitim ve tarama: (B1) Tüp eğitimi-deney fareleri, art arda 3 gün boyunca günde 2 döngü tüpten geçecek şekilde eğitildi. (B2) Kazanan tarama prosedürünün şeması. (B3) Agresif CD1 emekli damızlık tarama prosedürünün şeması. (C) Üç stres etkenine randomize maruziyet ve ardından art arda 10 gün boyunca sosyal izolasyondan oluşan modelleme aşaması: (C1) Tüp yarışmasında başarısızlık. (C2) Vekaleten sosyal yenilgi stresi. (C3) Önlenemez aşırı kalabalık stresi. (C4) Sosyal izolasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MISS paradigması için deney düzeneği. (A) Alışkanlık için kullanılan 10 cm uzunluğunda bir akrilik tüp (iç çap: 26 mm). (B) Boru yarışması için kullanılan 30 cm uzunluğunda bir akrilik tüp (iç çap: 26 mm). (C) Dolaylı sosyal yenilgi stresi için delikli kapak (L × W × H: 8 × 8 × 5,5 cm). (D) Aşırı kalabalık stres için kullanılan akrilik kılıf. (E) Tüp yarışma prosedürünün temsili görüntüsü. (F) Dolaylı sosyal yenilgi stres kurulumunun fotoğrafı. (G) Aşırı kalabalık stres kurulumunun yukarıdan aşağıya görünümü. (H) Sosyal izolasyonda barındırılan bir farenin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dişi C57BL/6J farelerinde MISS maruziyetinin neden olduğu depresif benzeri davranışlar. (A) Deneysel zaman çizelgesi. (B) Sükroz tercih testinin şeması. (C) Naif vs. MISS'e maruz kalan fareler (eşleşmemiş Student t-testi, t30 = 3.108, ** P < 0.01; n = grup başına 16 fare). (D) Sükroz tercih testinde toplam sıvı alımı (eşleşmemiş Öğrenci t-testi, t30 = 0.8669, P > 0.05; n = grup başına 16 fare). (E) Kuyruk süspansiyon testinin şeması. (F) Kuyruk süspansiyon testinde hareketsizlik süresi (eşleşmemiş Öğrenci t-testi, t30 = 2.589, *P < 0.05; n = grup başına 16 fare). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Dişi C57BL / 6J farelerinde MISS maruziyetinin neden olduğu anksiyete benzeri davranışlar. (A) Açık alan testinde naif ve MISS'e maruz kalan farelerin temsili aktivite yörüngeleri. (B) Merkezi bölgede geçirilen süre (eşleşmemiş Öğrenci t-testi, t30 = 2.365, *P < 0.05; n = grup başına 16 fare). (C) Kat edilen toplam mesafe (eşleşmemiş Öğrenci t-testi, t30 = 1.467, P > 0.05; n = grup başına 16 fare). (D) Yükseltilmiş artı labirent testinde temsili yörüngeler. (E) Açık kollarda geçirilen süre (eşleşmemiş Öğrenci t-testi, t30 = 2.786, **P < 0.01; n = grup başına 16 fare). Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Sakkaroz tercih testi için varyans testlerinin normalliği ve homojenliği. SPSS kullanılarak gerçekleştirilen Shapiro-Wilk testinin (Tablo A) ve Levene'nin testinin (Tablo B) sonuçları, verilerin eşleştirilmemiş Student t-testi için gerekli varsayımları karşıladığını doğruladı. Sonuçlar, verilerin normal olarak dağıldığını ve homojen bir varyans sergilediğini ve parametrik testin kullanımını doğruladığını göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Sükroz tercih testi için örneklem büyüklüğü tahmini. (A) Örneklem büyüklüğü, çevrimiçi bir örneklem boyutu hesaplayıcısı (https://www.trialstats.com/statbox/index.htm/samplesize/estimation?sid=4) kullanılarak hesaplanmıştır. (B) Deneysel verilere dayanarak, grup başına en az 15 farenin yeterli istatistiksel güce ulaştığı tahmin edilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.