Yöntem makalesi

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

3.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67125

⸱

13 Aralık 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen vasküler organoidler, insan vasküler ağlarının hücre tipi çeşitliliğini ve karmaşık mimarisini özetler. Bu üç boyutlu (3D) model, vasküler patoloji modellemesi ve in vitro ilaç taraması için önemli bir potansiyele sahiptir. Son zamanlardaki gelişmelere rağmen, aşağı akış tahlilleri ve uygulamaları için çok önemli olan, tutarlı kaliteye sahip organoidlerin tekrarlanabilir şekilde üretilmesinde önemli bir teknik zorluk devam etmektedir. Burada, vasküler organoid oluşumunun hem homojenliğini hem de tekrarlanabilirliğini artıran modifiye edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Modifiye edilmiş protokol, embriyoid vücut oluşumunu ve hücre sağkalımını iyileştirmek için mikro kuyuların ve CEPT kokteylinin (kroman 1, emricasan, poliaminler ve entegre stres yanıt inhibitörü, trans-ISRIB) kullanımını içerir. Bu protokol kullanılarak oluşturulan farklılaşmış, olgun vasküler organoidler, morfolojilerini ve karmaşık vaskülatürlerini analiz etmek için tam montajlı 3D immünofloresan mikroskobu ile karakterize edilir. Bu protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesini sağlayarak, potansiyel olarak hastalık modellemesi ve ilaç tarama uygulamalarında kullanımlarını kolaylaştırır.

Giriş

Organoid ve çip üzerinde doku sistemleri de dahil olmak üzere in vitro mikrofizyolojik modeller son on yılda ortaya çıkmıştır 1,2,3. Bu üç boyutlu (3D), insan hücresinden türetilmiş sistemler, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modellerindeki, sırasıyla fizyolojik mikro çevrede birçok bileşenin eksikliği ve türler arasındaki genetik farklılıklar gibi sınırlamaları ele alır. Daha fazla fizyolojik içgörü sağlarlar ve geleneksel modellere göre hastalık modellemesi ve ilaç taraması için daha uygundurlar. Mikrofizyolojik modeller arasında, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen organoidlerin, doğal insan dokularının mimari özelliklerini etkili bir şekilde özetlediği kanıtlanmıştır ve beyin 4,5, böbrek6, karaciğer 7,8 ve retina9 dahil olmak üzere farklı insan organlarını taklit etmek üzere geliştirilmiştir. Burada, özellikle hiPSC'lerden vasküler organoidlerin üretilmesine odaklanıyoruz ve farklı organoid numuneleri ve partileri arasındaki varyasyonları en aza indirmeyi ve böylece genel tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi amaçlayan kolaylaştırılmış bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Vaskülatür, tüm insan organlarında fizyolojik homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar. Vaskülatür oluşumu, endotel ve mural (örneğin, perisitler ve vasküler düz kas hücreleri) hücreler arasındaki etkileşimler yoluyla düzenlenen ve çeşitli uyaranlardan etkilenen vaskülogenez ve anjiyogenez süreçlerini içerir10. Penninger, Wimmer ve meslektaşları, bu iki süreci taklit eden ilk vasküler organoid üretim yöntemini11,12 geliştirdiler. Bu yöntemden üretilen organoidlerle, onların grubu12 ve biz13,14, hastalıklardaki vasküler arızaları modellemek için vasküler organoidlerin potansiyelini göstermiştir. Örneğin, son çalışmalarımızda13,14, hastalığı taklit eden vasküler organoidler ile bunların vahşi tip muadilleri arasında damar filizlenmesi ve duvar hücre bileşimi varyasyonları gibi farklı fenotipler gözlenmiştir. Bu örnekler, vasküler organoid modelin, hastalığa bağlı vasküler arızaları taklit ederek ilaç taraması için bir platform görevi görebileceğini vurgulamaktadır.

İlk vasküler organoid üretim çalışmaları11,12 üzerine inşa edilen, aynı organoid üretim partisinde sıklıkla görülen varyasyonları en aza indirmede kritik bir faktör olan homojen embriyoid cisim (EB) oluşumunu kolaylaştırmak için mikrokuyu kullanımını içeren revize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Ek olarak, kroman 1, emricasan, poliaminler ve entegre stres yanıt inhibitörü (trans-ISRIB)15'in bir kombinasyonu olan CEPT kokteyli, EB oluşum süreci sırasında hiPSC'lerin ve farklılaşmış hücrelerin canlılığını iyileştirmek için kullanılır. Bu modifikasyon esas olarak farklı organoid numuneleri ve partileri arasındaki varyasyonları azaltmak içindir. Üniform vasküler organoidler, 1. günde endotelin ilkel tübüler ağlara dönüşmesine yardımcı olmak için vaskülogenezin indüklendiği ve ardından organoidlerde karmaşık vasküler ağlar geliştirmek için 5. günde anjiyogenez indüksiyonunun yapıldığı bu kabaca iki haftalık protokolle üretilebilir. 12-15. günlerde, üretilen organoidler hem endotel hem de duvar hücrelerinden oluşan olgun vasküler ağlar göstermelidir.

Protokol

Şekil 1 , bu protokolde yer alan adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve malzemeler ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosunda verilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm ortamların kullanımdan önce 37 °C'de önceden ısıtılması önerilir. Tüm hücre kültürü materyalleri ve malzemeleri ya otoklavlanmalı ya da steril olmalı ve hücre kullanımı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek olarak, olası katılaşma sorunlarını önlemek için kollajen I karışımının pH değeri dikkatlice pH 7.3'e ayarlanmalıdır.

1. İnsan iPSC bakımı

  1. Bazal membran matris ekstraktını buz üzerinde çözdürün, çözeltiyi karıştırmak için şişeyi hafifçe sallayın ve bir P1000 pipeti ve önceden soğutulmuş uçlar kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 0,5 mL alikotlar yapın. Alikotları -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  2. Buz üzerinde bir matris özütü (0.5 mL) çözdürün. 50 mL'lik bir tüpte 49,5 mL önceden soğutulmuş DMEM / F12 ortamı ile karıştırın. Karışımı her bir oyuğa (1,5 mL / oyuk) 6 oyuklu plakalarda dağıtın ve ardından sıvı çözeltinin tüm kuyuyu kapladığından emin olmak için plakayı hafifçe sallayın. Plakaları parafin film ile kapatın ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
  3. hiPSC genleşme ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Tam ortamın (40 mL / tüp) alikotlarını yapın ve -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın.
  4. HiPSC kültüründen önce 37 ° C'lik inkübatöre 1 saat boyunca önceden kaplanmış bir plaka koyun.
  5. hiPSC genleşme ortamını (40 mL) 37 °C'de önceden ısıtın ve hiPSC tohumlama ortamını Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  6. Kaplanmış plakayı 37 °C'lik inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Kaplanmış plakadaki ortamı hiPSC tohumlama ortamı (1 mL/kuyucuk) ile değiştirin.
  7. Kriyotanktan dondurularak saklanmış bir hiPSC şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 dakika boyunca çözdürün.
  8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından 5 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin, ardından hücreleri toplamak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1.5 mL hiPSC tohumlama ortamı ile yeniden süspanse edin. 15 mL'lik tüpteki hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin.
  10. 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın ve 10 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. 10 μL'lik karışımı hemasitometre lamına aktarın ve üzerini bir lamel ile örtün.
  11. Sürgüyü tutucuya monte edin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. Enstrümanın odağı bulmasını bekleyin veya ekrandaki odak +/- düğmesine basarak odağı manuel olarak ayarlayın. Ardından, varsayılan ayarı kullanın ve Ele geçirmek düğmesine basın. Adım 1.9'dan itibaren hazırlanan hiPSC süspansiyonunun konsantrasyonu olarak CANLI hücre yoğunluğu okumasını kullanın.
  12. Her oyuğa 2 ×10 5 hücre tohumlayın ve hücrelerin kuyuya eşit olarak dağıldığından emin olun.
  13. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin ve ortamı 24 saat sonra hiPSC genleşme ortamı (1.5 mL / kuyu) ile değiştirin.
  14. Hücreler% 80'lik bir birleşmeye ulaşana kadar ortamı günlük olarak değiştirin. Spontan farklılaşma olmadığından emin olmak için hücre morfolojisini ve koloni boyutunu rutin olarak kontrol edin. Kültürü atın ve geniş (%>5) spontan farklılaşma gözlenirse yeni bir hiPSC partisi ile yeniden başlatın.

2. EB oluşumu (Gün 0)

  1. 0. Günde, DMEM/F12 ortamı, hiPSC tohumlama ortamı ve hücre ayırma çözeltisini 37 °C'de 20-30 dakika hazırlayın ve önceden ısıtın.
  2. Kültür ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın ve önceden ısıtılmış hücre ayırma çözeltisi (1.5 mL / oyuk) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 5-7 dakika inkübe edin.
  3. Plakayı biyogüvenlik kabinine aktarın, hiPSC kolonilerini ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve agregaları parçalayın.
  4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4.5 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin. Hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak karışımı beş kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
  5. Hücreleri toplamak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı aspire edin ve bir P1000 pipeti kullanarak hücreleri 1 mL hiPSC tohumlama ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.
  7. Hücre sayımı için 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini hemasitometre lamına aktarın ve bir lamel ile örtün. Sürgüyü tutucuya monte edin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. Cihaz odağı bulduktan sonra, Yakala düğmesine basın ve hiPSC süspansiyonunun konsantrasyonunu belirlemek için CANLI hücre yoğunluğu okumasını kullanın.
  8. EB başına 500-1.000 hücre elde etmek için hücreleri 2.7 ×10 5 hücre / kuyu yoğunluğuna sahip ultra düşük bağlantılı yuvarlak tabanlı mikro kuyu plakasına tohumlayın.
  9. Her oyuğa 2 mL hiPSC tohumlama ortamı ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için çözeltiyi hafifçe karıştırın.
  10. Hücreleri 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 ile kültürleyin.

3. Vasküler farklılaşma (Gün 1 - 5)

  1. 1. Günde, mezoderm indüksiyon ortamını (MIM) Tablo 3 ve Tablo 4'te açıklandığı gibi hazırlayın ve 37 ° C'de 20 dakika önceden ısıtın. MIM besiyeri taze olarak yapılmalıdır.
  2. Alttaki EB'leri rahatsız etmeden ortamı mikro kuyu plakasından dikkatlice aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın.
  3. Bir P200 pipeti kullanarak yavaşça 2,5 mL MIM ekleyin. MIM'deki EB'leri 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de kültürleyin.
  4. 3. Günde, mikrokuyunun dibindeki EB'leri rahatsız etmeden ortamı önceden ısıtılmış, taze yapılmış 2,5 mL vasküler farklılaşma ortamı 1 (VDM1, Tablo 5) ile nazikçe değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 gün daha kültürleyin.

4. Hidrojel gömme (5. Gün)

  1. Kollajen I karışımını Tablo 6'da anlatıldığı gibi hazırlayın. Buzun üzerine 50 mL'lik bir tüp yerleştirin ve ardından kollajen I solüsyonu, H2O, 10× DMEM / F12 ortamı, sodyum bikarbonat ve HEPES ekleyin. Tüpü hafifçe sallayarak iyice karıştırın. pH değerini 7.3'e ayarlamak için karıştırılan çözeltiyi çalkalarken damla damla 1 M NaOH çözeltisi ekleyin ve karışımın pH değerini bir pH metre ile kontrol edin.
    NOT: Tüm çözeltiler kullanılmadan önce buz üzerinde önceden soğutulmalıdır. Prosedürü her zaman biyogüvenlik kabinindeki buz üzerinde gerçekleştirin. NaOH çözeltisinin eklenmesi kritiktir ve kollajen I'in lokal kürlenmesini önlemek için homojen bir çözelti elde etmek için hızlı dispersiyon gereklidir. NaOH hacmi, kullanılan kollajen I çözeltisinin lot sayısına bağlı olarak değişebilir. Karıştırma için kuvvetlice pipetlemeyin, çünkü kesme gerilimi istenmeyen ön kürlemeye neden olabilir.
  2. Kollajen I-bazal membran matris karışımını Tablo 7'de tarif edildiği gibi hazırlayın. Adım 4.1'den hazırlanan 5 mL kollajen I karışımına 1.25 mL bazal membran matrisi ekleyin. Tüpü sallayarak çözeltiyi hafifçe karıştırın.
  3. 12 oyuklu bir plakayı 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  4. Geniş delikli uçları kullanarak kollajen I-bazal membran matris karışımını 12 oyuklu plakaya (1,5 mL/kuyu) yavaşça ekleyin. Karışımın eşit şekilde dağıldığından emin olun.
  5. İlk hidrojel katmanını katılaştırmak için plakayı 37 ° C'lik inkübatöre 2 saat koyun.
  6. Kalan kollajen I-bazal membran matris karışımını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun.
  7. ~ 60 hücre agregasını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 5 dakika buz üzerinde soğutun. Ortamı bir P200 pipet ucuyla dikkatlice çıkarın.
    NOT: Bu adımı, Adım 4.5'ten 1.5 saat sonra başlatın.
  8. Damla damla, agregalara 1,5 mL kollajen I-bazal membran karışımı ekleyin ve bunları geniş delikli P200 pipet uçları kullanarak nazikçe karıştırın.
  9. İlk hidrojel tabakasının bulunduğu plakayı inkübatörden (adım 4.5) biyogüvenlik kabinine aktarın.
  10. Kürlenmiş tabaka üzerine 1.5 mL agrega süspansiyonu ekleyin. Agregaları eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Herhangi bir baloncuk oluşturmaktan kaçının.
  11. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 saat daha inkübe edin.
  12. Vasküler farklılaşma ortamını 2 (VDM2; Tablo 8) ve kullanmadan önce ortamı 37 °C'lik bir su banyosunda 20 dakika önceden ısıtın.
  13. Her oyuğa 2 mL VDM2 ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
  14. Ortamı önceden ısıtılmış, taze yapılmış VDM2 ile her 3 günde bir değiştirin.
    NOT: (İsteğe bağlı) Vasküler organoidler, jelin bir şırınga iğnesi ile çıkarılmasıyla jel karışımından salınabilir. Jeden alınan vasküler organoidler, VDM2 (200 μL / oyuk) ile 96 oyuklu bir plakada ayrı ayrı muhafaza edilebilir. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.

5. 3D İmmünofloresan testi

  1. Vasküler organoidler kabaca 13. günde olgunlaşmalıdır. Hidrojel içine gömülü organoidler için, ortamı dikkatlice aspire edin ve üç kez (her seferinde 10 dakika) 2 mL PBS ile yıkayın. Jelden alınan organoidler için (Adım 4.14'ten sonra), 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 6-10 organoid toplayın, ortamı aspire edin ve 2 mL PBS ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkayın.
  2. Numuneye 2 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve parafin film sızdırmazlığı ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  3. PFA solüsyonunu çıkarın ve numuneyi 2 mL PBS ile dört kez (her seferinde 15 dakika) yıkayın.
  4. 2 mL bloke edici tampon ekleyin (Tablo 9) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. Bloke edici tamponu çıkarın ve 1.5 mL primer antikor ekleyin (antikor bilgisi için Malzeme Tablosuna bakınız; antikorlar bloke edici tamponda seyreltilmelidir). Numuneyi birincil antikorlarla 4 ° C'de 2 gün boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Birincil antikorun (CD31, PDGFRβ ve ERG1) bloke edici tamponda 1:400 oranında seyreltilmesi önerilir (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 2 mL PBST ile 1 saat altı kez yıkayın.
  7. Numuneye 2 mL ikincil antikor ekleyin (antikor bilgisi için Malzeme Tablosuna bakınız; antikorlar PBST'de seyreltilmelidir). Plakayı alüminyum folyo ile sarın ve hafifçe çalkalayarak 2 gün boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: İkincil antikorun PBST'de 1:1000 oranında seyreltilmesi önerilir (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakınız). İnkübasyon sırasında plakayı ışıktan uzak tutun ve daha sonra bu adımdan itibaren yıkayın.
  8. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve altı kez (her seferinde 1 saat) 2 mL TBST ile yıkayın. Çekirdek boyama gerekiyorsa, son yıkama adımı için kullanılan yıkama tamponuna DAPI (1 μg/mL) ekleyin.
  9. Bu jel gömülü organoidler için jeli 4 parçaya bölün ve bir spatula ile dikkatlice 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Alınan organoidler için yıkama tamponunu çıkarın.
  10. Jele veya organoidlere dokunmadan kalan çözeltiyi emmek için mendil kullanın.
  11. Her tüpe 2 mL suda çözünür doku temizleme reaktifi (Kırılma İndeksi = 1.49) ekleyin. Numuneleri, organoidler berraklaşana kadar (genellikle gece boyunca) karanlıkta oda sıcaklığında temizleme reaktifi ile inkübe edin. Numuneleri sallamayın.
  12. Organoidleri temizleme reaktifi ile bir spatula kullanarak dikkatlice cam tabanlı tabağın ortasına aktarın.
  13. Organoidleri veya jel parçasını 24 mm × 24 mm lamel ile örtün.
  14. Lameli düz bir şekilde uzanana kadar yavaşça aşağı doğru itin ve numuneleri cam tabanla sandviçleyin.
  15. Tabaktaki gereksiz temizleme reaktifini çıkarın ve lameli oje ile kapatın.
  16. 3D görüntüleme için 10 × objektifli konfokal bir mikroskop kullanın. Organoidlerin tam montajlı görüntülerini elde etmek için döşeme taraması ve Z-yığını taraması kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1A, her aşamada kullanılan temel bileşenler de dahil olmak üzere bu protokolün şemasını sunar. Farklılaşma EB oluşumu ile başladı, ardından mezoderm indüksiyonu ve vasküler soy spesifikasyonu izledi (Şekil 1B-D). Agregalar zamanla büyüdü ve daha az küresel hale geldi. Organoidler 5. günde pürüzlü kenarlar göstermeye başladı. Kollajen I-bazal membran matris karışımına gömüldükten sonra, vasküler endotel hücreleri ve perisitler filizlendi ve 7. gün gibi erken bir tarihte karmaşık vasküler ağlar oluşturmak üzere büyüdü (Şekil 1E). Bu modifiye edilmiş yöntemin temel amacı, farklı üretim partileri arasındaki varyasyonları en aza indirmek olduğundan, EB boyutunu iki bağımsız partiden ölçtük ve hem boyut ölçümleri hem de istatistiksel analiz, bu yöntemle tutarlılığı ve tekdüzeliği doğruladı (Şekil 1F).

Vasküler farklılaşmayı doğrulamak için, organoidler gömülmeden önce 5. günde toplandı ve CD31, ERG1 ve PDGFRβ dahil olmak üzere vasküler belirteçlerle boyandı. Organoidler, vasküler endotel hücrelerinin ve perisitlerin varlığını gösteren CD31, ERG1 ve PDGFRβ (Şekil 2) eksprese etti.

Doku temizlendikten sonra, vasküler ağlar tam montajlı immünofloresan mikroskobu ile analiz edildi (Şekil 3A). Olgun organoidler, 17. günde (Şekil 3B, jel bloğundaki örnek) ve 28. günde (Şekil 3C, jel bloğundaki örnek) CD31, ERG1 ve PDGFRβ ile boyandı; örnek, jel bloğundan ve kültürden ayrı ayrı 96 oyuklu bir plakada alındı; kenarlardaki vasküler ağın, jel bloğundan alındıktan sonra radyal olarak genişlemek yerine sferoidleri sardığına dikkat edin).

figure-results-1
Şekil 1: Vasküler organoid üretimi. (A) Vasküler organoid üretimi için adımların şeması ve zaman çizelgesi. (B-E) Farklı aşamalarda vasküler organoidlerin temsili parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları: 100 μm. (F) Bu çalışmada sunulan mikrokuyu yöntemi kullanılarak iki farklı EB üretim partisinden EB boyutunda istatistiksel analiz. EB üretimi için, mikrokuyu başına 1.000 hücre ve Parti 1 ve 2 için sırasıyla n = 42 ve n = 40 kullanıldı. Anlamlılık, anlamlı değil, ns olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Jel gömülmeden önce vasküler organoidlerin immün boyama. Sırasıyla endotel belirteçleri (A) CD31 (yeşil) ve (B) ERG1 (yeşil) ve (C) perisit belirteci PDGFRβ (yeşil) ile boyanmış organoidlerin temsili floresan görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı boyandı. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Vasküler organoidlerde vasküler ağın immünofloresan karakterizasyonları. (A) Temsili bir görüntü, doku temizlendikten sonra cam tabakta jele gömülü vasküler organoidleri gösterir. Organoidler şeffaftı ancak 385 nm UV ışığı altında görülebiliyordu. (B) 17. günde vasküler organoidin temsili bir 3D tam montaj görüntüsü. Vasküler organoid DAPI (mavi), vasküler endotel hücre belirteci, CD31 (yeşil) ve perisit belirteci, PDGFRβ (macenta) ile boyandı. (C) 28. günde, endotel belirteçleri CD31 (kırmızı) ve ERG1 (yeşil) ile boyanmış, alınan bir vasküler organoidin temsili bir tam montajlı 3D görüntülemesi. Ölçek çubukları: 150 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

hiPSC genişletme ortamı500 mL
mTeSR Plus bazal ortam400 mL
mTeSR Plus takviyesi100 mL
Gentamisin (50 mg / mL)1 mL

Tablo 1: hiPSC genleşme ortamının bileşimi.

hiPSC tohumlama ortamı20 mL
PSC genleşme ortamı20 mL
Kroman 1 (100 μM)10 μL
Emricasan (1 mM)30 μL
Poliamin takviyesi (1000X)20 μL
trans-ISRIB (1 mM)14 μL

Tablo 2: HiPSC tohumlama ortamının bileşimi.

N2B27 orta100 mL
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesi48,6 mL
Nörobazal ortam48,6 mL
GlutaMAX takviyesi (100x)0,5 mL
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (NEAA, 100x)0,5 mL
2-Merkaptoetanol (1000x)0.1 mL
Gentamisin (50 mg / mL)0.1 mL
N2 takviyesi (100x)0,5 mL
B27 takviyesi eksi A vitamini (50x)1 mL
Heparin, 4 kU/mL0.1 mL

Tablo 3: N2B27 ortamının bileşimi.

Mezoderm indüksiyon ortamı (MIM)3 mL
N2B27 orta3 mL
BMP4 (100 ng/μL)0,9 μL
CHIR99021 (12 mM)3 μL

Tablo 4: Mezoderm indüksiyon ortamının (MIM) bileşimi.

Vasküler farklılaşma ortamı 1 (VDM1)3 mL
N2B27 orta3 mL
Forsklin (12 mM)0,5 μL
VEGFA (100 ng/μL)3 μL

Tablo 5: Vasküler farklılaşma ortamı 1'in (VDM1) bileşimi.

Kollajen I karışımı5 mL
Kollajen I (3.61g/mL)2,77 mL
10x DMEM/F12 orta0,5 mL
Sodyum bikarbonat, %7,50,5 mL
HEPES, 1 M0,5 mL
H2O0.73 mL
NaOH, 1 milyon75 μL

Tablo 6: Kollajen I karışımının bileşimi.

Kollajen I - bazal membran matris karışımı6,5 mL
Kolaj I karışımı5 mL
Matrigel (10 mg / mL)1,5 mL

Tablo 7: Kollajen I-bazal membran matris karışımının bileşimi.

Vasküler farklılaşma ortamı 2 (VDM2)5 mL
DMEM/F-12, GlutaMAX™ takviyesi3,67 mL
Gentamisin (50 mg / mL)5 μL
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (NEAA, 100X)50 μL
2-Merkaptoetanol (1000x)5 μL
Heparin, 4 kU/mL5 μL
Nakavt Serum Değişimi0,75 mL
FBS (FBS)0,5 mL
VEGFA (100 ng/μL)5 μL
FGF2 (100 ng/μL)5 μL

Tablo 8: Vasküler farklılaşma ortamı 2'nin (VDM2) bileşimi.

Engelleme tamponu50 mL
Eşek serumu2,5 mL
Ara 200.25 mL
Triton X-1000.25 mL
Sodyum deoksikolat çözeltisi (%1, ağırlıkça/h)0,5 mL
PBS46,5 mL

Tablo 9: İmmün boyama için bloke edici tamponun bileşimi.

Tartışma

Açıklanan protokol, yüksek kaliteli vasküler organoidlerin homojen ve tekrarlanabilir üretimi için iki temel modifikasyon içerir. İlk modifikasyon, EB homojenliğinin daha iyi kontrol edilmesini sağlamak için bir mikro kuyu plakasının kullanılmasıdır. Vasküler farklılaşmanın başlangıç noktası olarak, EB'lerin boyutu, kök hücre kaderini ve farklı soylara doğru farklılaşma etkinliğini düzenlediği için kritik öneme sahiptir. EB boyutundaki değişiklikler genellikle tutarsız yapı ve organizasyona sahip heterojen organoidlere yol açar16,17. hiPSC kolonilerini11,12 kaldırarak geleneksel EB oluşturma yöntemi, bireysel EB'ler için hücre sayılarını kontrol etmeyi zorlaştırır ve genellikle heterojen EB oluşumu ile sonuçlanır. Bu protokolde, hiPSC'ler tek hücreli süspansiyona ayrıştırılır ve mikro kuyulardayeniden toplanır 16,18. Tohumlama hücresi sayılarını ayarlayarak, EB'lerin boyutu, tutarlı ve etkili mezodermal farklılaşma sağlamak için optimize edilebilir. Mikrokuyu tohumlama için 500-1.000 hücre kullanılır ve bu nispeten küçük EB'ler (100-200 μm çapında) verebilir. Bu yöntem, partiden partiye ve çeşitli hücre hatları arasında istenen boyutlarda tek tip EB'ler tekrarlanabilir şekilde üretebilir (Şekil 1F)13. 0. Günden bu yana, EB'nin morfolojisi farklılaşma sırasında zamanla değişmiştir: şekil daha az küresel hale gelir ve yüzey daha pürüzlü hale gelir (Şekil 1), ancak hacim önemli ölçüde artmaz. 3B damar sistemi morfolojisi, gömme yoğunluğuna ve gömülü organoidlerin boyutlarına bağlıdır. Çok büyük (>500 μm) organoidler genellikle yetersiz vasküler hücre farklılaşmasına neden olurken, çok küçük organoidler az gelişmiş damar sistemine sahip olma eğilimindedir.

İkinci modifikasyon, EB oluşumu sırasında hiPSC canlılığını iyileştirmek için CEPT kokteylini dahil etmektir. Bu işlem sırasında hiPSC kolonilerinin kalitesine ek olarak hücre canlılığı da çok önemlidir. hiPSC'ler tek hücreli bir süspansiyona ayrıldığında, hücre canlılığını artırmak için genellikle ROCK inhibitörü Y27632 eklenir. Bununla birlikte, Y27632'nin düşük yoğunluklu hiPSC'ler için yetersiz olduğu gösterilmiştir ve istenmeyen membran stresine neden olabilirken, CEPT kokteyli (kroman 1, emricasan, poliaminler ve trans-ISRIB'den oluşur) hücre stresini önemli ölçüde azaltabilir ve daha düşük yoğunluklu hiPSC'lerle bu EB oluşum süreci sırasında canlılığı artırabilir15.

Jele organoid gömülmeden önce, organoidler mikrokuyu plakasında tutulur ve olası bozulmayı önlemek için ortam değişikliği yumuşak olmalıdır. İlk 5 gün ortamı değiştirmek için 200 μL'lik bir pipet kullanmak daha iyi olacaktır. Vasküler organoid üretimi için kullanılan tüm ortamlar kullanımdan önce önceden ısıtılmalıdır. Özellikle jel gömüldükten sonra, soğuk ortamın kullanılması bazal membran matrisini kısmen sıvılaştırabilir ve vasküler ağ oluşumu için 3D hidrojel nişini etkileyebilir. Organoidlerin gömme yoğunluğu ve eşit dağılımı da vasküler ağ oluşumu için kritik faktörlerdir. Yoğun organoid gömme, potansiyel olarak vasküler ağların aşırı füzyonuna yol açabilirken, düşük gömme yoğunluğu yetersiz ağ oluşumuna yol açabilir. Oyuk başına 60-80 organoidin tohumlanması ve 3D jelin ilk katmanına eklendikten hemen sonra plakayı nazikçe ileri geri hareket ettirmek, bu organoidleri daha iyi dağıtabilir.

Bu protokol, farklı uygulamalar için daha fazla değiştirilebilir. Örneğin, vasküler endotel hücrelerini BBB arayüzününoluşumundan daha fazla kısıtlamak için kan-beyin bariyeri (BBB) ipuçları uygulanabilir 19,20,21,22,23,24,25. 3D hidrojel bileşimi de ayarlanabilir. Örneğin, fibrin ve vitronektin, in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32'de vasküler ağ oluşumu için yaygın olarak kullanılır. Kollajen I içermeyen bazal membran matrisi, gömme işlemini basitleştirebilen ve farklı mekanik uyaranlar sağlayabilen gömme için kullanılabilir.

Bu protokolden üretilen vasküler organoidler potansiyel olarak hastalık modellemesi veya ilaç tarama uygulamaları için kullanılabilse de, bir sınırlama, bu organoidlerin çoğunlukla birkaç büyük damar ile kapiller vaskülatürü özetlemesidir. Daha büyük damarlara odaklanan araştırmalar için, organoid üretimi ek mekanik uyaranlar gerektirebilir 24,31,32,33. Vasküler organoidlerin hayvanlaratransplantasyon 34 veya perfüzyon pompaları33 ile mikro/makro-akışkan cihazlar gibi devridaim ile bağlanması potansiyel olarak bunu ele alabilir.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Columbia Üniversitesi'ndeki Herbert Irving Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Konfokal ve Özel Mikroskopi Ortak Kaynağı'ndan gelen ve kısmen NIH Center Grant (P30CA013696) aracılığıyla finanse edilen teknik desteğe teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Şekil 1A, BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-Merkaptoetanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152, 0.25 mL% 50 gliserol ile sulandırılır, ve nbsp; -20 °C'de saklayın; 1 yıla kadar C, kullanım için seyreltme oranı: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H + L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147, 0.25 mL% 50 gliserol ile sulandırılır, ve nbsp; -20 ° C'de saklanır; 1 yıla kadar C, kullanım için seyreltme oranı: 1: 1000
B27 takviyesi eksi A vitamini (50x)Gibco12587010 4 ° C'de çözülür; C, alikot ve -20 ° C'de saklayın; C, donma-çözülme döngüsünden kaçının
BMP4ProSpecCYT-081100 ng/&mikro konsantrasyonda steril ddH2O ile sulandırılır; L, aliquot ve -20 &°C'de saklayın; C
CD31 antikoru abcamab28364seyreltme oranı: 1:400
SantrifüjEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10stok çözeltisini DMSO ile 12 mM'de yapar ve -20 °C'de saklar; 1 yıla kadar C.
Chroman 1Tocris7163/10, stok çözeltisini 100 & mikro'da yapar; DMSO ile M ve -20 &°C'de saklayın; 1 yıla kadar C.
Kollajen I Corning40236
Konfokal MikroskopNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlakalarıCorning4441
Kontes II FL otomatik hücre sayacıThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesiGibco10565018
DMEM/F-12, tozGibco12500062biograde ddH2O ile 10x stok çözeltisi yapın ve 0.2 & mikro ile sterilize edin; m filtresi. 4 ° C'de saklayın.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGDMSO ile 1 mM'de stok çözeltisini yapabilir ve -20 ° C'de depolayabilir; 1 yıla kadar C.
ERG antikoruCell Singali Technology97249seyreltme oranı: 1:400
Fetal Sığır Serumu - PremiumAtlanta BiologicalsS111504 ° C'de çözülme; C  ve Aliquot, mağaza  -20 derece & derece; Beş yıla kadar C veya 4 &°C'de saklayın; Bir aya kadar C
FGF2ProSpecCYT557100 ng/&mikro konsantrasyonda steril ddH2O ile sulandırılır; L, aliquot ve -20 &°C'de saklayın; C
Florodish Hücre Kültürü ÇanakDünya Hassas AletlerFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099, 12 mM'lik bir konsantrasyonda DMSO ile sulandırılır, alikot ve -20 °C'de saklanır; C
Gentamisin (50 mg / mL)Gibco15710064
GlutaMAX takviyesi (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KU4 kU / mL konsantrasyonda steril ddH2O ile sulandırılır
HEPES (1 M)Gibco15630080
İnkübatörThermo Scientific13998123
Nakavt Serum DeğiştirmeGibco108280284 ° C'de çözülür; C, aliquot ve -20°'de saklayın; C, donma-çözülme döngüsünden kaçının
Matrigel, GFR Bodrum Membran MatrisiCorning3562304 ° C'de çözülme; C, aliquot ve -80 ° C'de saklayın; C, donma-çözülme döngüsünden kaçının
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA, 100x)Gibco11140050
Moleküler Biyoloji Sınıfı SuCorning46000CV
mTeSR plus kitiSTEMCELL Teknolojileri1001130 4 °C'de çözülme; C, aliquot ve -20°'de saklayın; C, donma-çözülme döngüsünden kaçının
N2 takviyesi (100x)Gibco175020484 ° C'de çözülme; C, aliquot ve -20°'de saklayın; C, donma-çözülme döngüsünden kaçının
NaOH çözeltisi (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs1700012110 mL steril ddH2O ile sulandırılır, 4 ° C'de saklanır; İki haftaya kadar C
paraformaldehit,% 20Elektron Mikroskobu Bilimleri15713S,PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFR ve beta ile seyreltilir; antikorR& DAF385seyreltme oranı: 1:400
poliamin takviyesi (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear temizleme reaktifi, 1.49SUNJIN LABRC149001
Sodyum Bikarbonat (% 7.5)Gibco25080094
Sodyum deoksikolat monohidratThermofisherJ6228822%1 (ağırlıkça / h) stok çözeltisi için ddH2O ile çözülür
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10, stok çözeltisini DMSO ile 1 mM'de yapar ve -20 ° C'de saklar; 1 yıla kadar C.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116100 ng/&mikro konsantrasyonda steril ddH2O ile sulandırılır; L, aliquot ve -20°'de mağaza; Ç
, , , , ,

Kaynaklar

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vask ler Organoidlernsan iPSC leriOrganoid DiferansiyasyonuMikrokuyu K lt rCEPT Kokteyli3D mm nofloresansDoku effafla t rmaI k Sayfas MikroskobisiHastal k Modelleme
İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.