Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Mevcut protokol, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit ve hassas bir oransal Förster rezonans enerji transferi (FRET) testini tanımlar. Oransal FRET ölçümleri, verici ve alıcı emisyon sinyallerinin oranını kullanır. Tahlil, gerçek zamanlı bir DNA bölünme sensörü olarak kullanılan, zımba şeklinde, çift etiketli 38 mer FRET oligoprobu kullanarak tek sarmallı DNA kırılmalarını tespit eder. Açıklanan yaklaşımın ana uygulaması, pH, sıcaklık ve tampon bileşimi gibi reaksiyon koşullarının DNaz aktivitesi üzerindeki etkilerinin kantitatif değerlendirmesidir. Küçük ve yavaş DNA bölünmesini bile tespit etme kabiliyeti nedeniyle, tahlil, uzun süreli gözlem gerektiren zayıf nükleolitik aktiviteyi araştırmak ve pH'ın DNaz aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için özellikle uygundur. Bu oransal FRET protokolünün bu spesifik avantajları, lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesinin tespiti ve analizine uygulanmasıyla gösterilmektedir.
Giriş
Oransal floresan yaklaşımı, yalnızca tek bir sinyalin 1,2 yoğunluğuna güvenmek yerine floresan sinyallerinin oranlarını kullanan analitik bir yöntemdir. Oranları kullanmanın avantajı, dahili kalibrasyon sağlamaları ve numune ve prob konsantrasyonlarındaki değişiklikler, cihaz parametreleri vb. gibi birçok rastgele faktörü telafi etmeleridir. Bu, floresan probların doğruluğunu ve hassasiyetini artırır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET) problarının özel bağlamında, "ratiometric" terimi, ölçümün FRET donör ve alıcı florofor çiftinden gelen iki emisyon sinyalinin oranına dayandığı gerçeğini ifade eder. Hedef analitin aktivitesini ölçmek için, oransal FRET probları, alıcı/verici emisyon yoğunluklarının oranını (veya bazı durumlarda ters çevrilmiş verici/alıcı oranını) kullanır. Oran doğrudan FRET verimliliği ile ilgilidir. Arka plan gürültüsünü en aza indiren ve aydınlatma koşullarındaki ve prob konsantrasyonundaki değişiklikleri hesaba katan kendi kendini normalleştiren bir mekanizma sağlar3.
Oransal yöntemin son zamanlardaki ilginç uygulamaları arasında, dolaşımdaki tümör DNA'sının (ctDNA) saptanması için oransal elektrokimyasal biyosensörlerde4,5, apoptozun fagositik fazının FRET tespiti için Brown hareketle çalışan biyo-nanomakinelerde kullanılması ve FRET etiketlemesi ve fagositik klerens7'nin analizi yer almaktadır. Bu çalışmada açıklanan oransal FRET yaklaşımı, DNaz aktivitesinin kantitatif değerlendirmesi için yararlıdır. Tahlil ölçümleri, FRET çifti emisyonlarının oranlarına dayanmaktadır. Küçük ve yavaş DNA bölünmesini bile tespit etme kabiliyeti nedeniyle, tahlil özellikle daha uzun gözlem süreleri gerektiren zayıf nükleolitik aktivitenin araştırılması ve farklı pH seviyelerinde deneyler için çok uygundur.
Burada, ratiometrik FRET testinin bazı spesifik avantajları, zayıf bir nükleaz-lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesini incelemek için uygulanmasıyla gösterilmektedir. Rapor, adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol ve oransal veri analizinin bir açıklamasını içerir.
Oransal FRET probu açıklaması
Oransal FRET probu, FAM-TAM'ın (Floresein-Tetrametilrodamin) donör-alıcı FRET çiftini taşıyan, kendi kendini tamamlayan bir 38-mer DNA oligosudur. Sırası 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3' şeklindedir. Kendiliğinden hibridize olan 38-mer, iki floroforunu birbirinden 23.8 şkonumlandıran 23 ve 15 nükleotidlik iki bağlantılı saç tokası içeren zımba şeklinde bir konformasyon varsayar. Bu, bu çift için Förster yarıçapından önemli ölçüde daha yakındır, R0 = 55 Å8. Bu tür bir konumlandırma, vericiden alıcıya çok yüksek bir enerji transferi verimliliğine karşılık gelir7: EFRET = 0.993477. Sonuç olarak, FAM uyarma dalga boyunda (488 nm) aydınlatıldığında, FRET probu, alıcı TAM'ın (580 nm) emisyon dalga boyunda floresan yayarken, FAM emisyonu (525 nm) bastırılır.
Şekil 1A , sıkı eğrilikten kaynaklanan sterik engel nedeniyle her iki saç tokası tepesinde küçük halkalar ile probun UNAFold tarafından tahmin edilen ikincil yapısını göstermektedir. FRET probu ile DNA kırılması tespitinin şeması Şekil 1B'de sunulmuştur. Oligoprobun bir DNaz tarafından kırılmasının FRET çiftini ayırdığını gösterir. Bu ayırma, probdaki her iki floroforun emisyon spektrumlarında ciddi değişiklikler üretir. Şekil 1C , bölünmeden önce ve sonra prob emisyon spektrumlarını sunar ve DNase II prob bölünmesinden sonra FRET çiftinin bölünmesinin 525 nm'de (ID 525 nm) donör emisyonunu artırdığını ve aynı anda 580 nm'de (IA 580 nm) alıcı emisyonunu azalttığını gösterir. Şekil 1D , emisyon spektrumlarına karşılık gelen PAGE jel ve FRET oranlarını göstermektedir. DNase II prob bölünmesi, 12-16-mer FAM (yeşil) ve 20-24-mer TAM (kırmızı) fragmanlarına karşılık gelen iki geniş bant üretti, bu da saç tokaları arasındaki bağlantı alanının yakınında T23'ün her iki tarafında 38-mer'in rastgele kesildiğini gösteriyor.
Şekil 1: Oransal FRET probunun yapısı ve çalışması. (A) UNAFold tarafından oluşturulan FRET probunun tahmin edilen ikincil yapısı. (B) Çalışan FRET probunun şematik gösterimi. Oransal FRET probu, 23,8 Å'lik etkili bir FRET mesafesinde bir FRET donörü (FAM) ve alıcısı (TAM) ile etiketlenmiş zımba şeklinde bir 38 mer oligonükleotiddir ve %>99 FRET verimliliği sağlar. Oligoprobun bir DNaz tarafından bölünmesi, FRET çiftini ayırarak FRET'i ortadan kaldırır. (C) DNase II aracılı bölünmeden önce ve sonra FRET probunun emisyon spektrumları. Bölünmeden önce, FAM emisyonu baskılanır ve TAM emisyonu belirgindir. DNaz aracılı bölünme, FAM ve TAM'ı ayırır, FAM emisyonunu geri yükler (525 nm tepe noktası) ve TAM emisyonunu (580 nm düşüş) ortadan kaldırır. λuyarılma = 488 nm. (D) DNase II bölünmesinden önce ve sonra FRET probunun oransal ve elektroforetik değerlendirmesi. Üst panel: FRET oranları (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), prob durumunun kantitatif bir ölçüsünü temsil eder. Kırmızı: ayrılmamış; yeşil: DNase II bölünmüş. Alt panel: Florometrik verilere karşılık gelen denatüre edici PAGE jeli. DNase II bölünmesi, FAM etiketli fragmanlar (12-16 nt, yeşil) ve TAM etiketli fragmanlar (20-24 nt, kırmızı) verir, bu da T23'ü çevreleyen saç tokaları arasındaki bağlantıya yakın bölünmeyi gösterir. Ayrılmamış kontrol sarı floresan gösterir. Merdiven: 38-mer probunun 5' ve 3' segmentlerine karşılık gelen FAM ve TAM etiketli oligonükleotidler, orijinal konumlarında floresan etiketlerle birlikte. Reaksiyon koşulları: 10 mM sodyum asetat tamponu (pH 5.2), 1 pmol/μL FRET probu, 0.0033 U/μL DNaz II, 37 °C'de 24 saat. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λuyarılma = 488 nm. UNAFold koşulları: 1 μM FRET probu, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bireysel test emisyon spektrumlarındaki değişiklikler açık olsa da, çok sayıda emisyon spektrumu arasındaki nicel karşılaştırmalar daha kullanıcı dostu ve kompakt bir nicel parametre gerektirir. Bu rol FRET oranı tarafından oynanır. Sunulan floresan yöntemi, kantitatif değerlendirmeleri için FRET çifti üyelerinin floresan emisyonlarının doğrudan (iki kanallı) oranlarına dayanan bir grup oransal yaklaşıma aittir 2,9.
Yaklaşım, FRET verimliliği ile ilgili olan ve 38-mer'in durumunu (kırık veya sağlam) kantitatif olarak karakterize eden donör/alıcı emisyonlarının oranını (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm) kullanır. ID / IA oranı, prob konsantrasyonu, uyarma yoğunluğu ve foto ağartma3 gibi faktörlerdeki varyasyonları doğal olarak açıklayan kendi kendini normalleştiren bir mekanizma sağlar. Yaklaşım, yalnızca oranlarının bilindiği ve sabit olduğu, aynı prob içinde bağlı verici ve alıcıya sahip FRET probları için uygundur. Bu nedenle, yaklaşımın ne alıcının ne de vericinin karışmasının doğrudan uyarılmasını dikkate alması gerekmez2. Probun sabit verici-alıcı stokiyometrisi, verici/alıcı emisyon oranlarının bu varyasyonlardan etkilenmemesini ve probun durumunu doğrudan yansıtmasını sağlar. Sonuç olarak, verici-alıcı emisyonlarının oranı, yerleşik sinyal normalizasyonu 2,3 ile kantitatif bir DNA bölünme parametresi sağlar.
Tahlil, ID / IA oranını kullanır (zıt I A / ID oranı yerine), çünkü bu oran prob bölünmesinden sonra FRET kesilmesini tanımlar ve bu nedenle, artan bölünme ile DNaz aktivitesinin artmasıyla aynı yönde değişir. Bu, her ikisi de Şekil 1C'deki spektrumlara karşılık gelen, oransal probun FRET oranını ve DNaz II tarafından bölünmesinden önce ve sonra PAGE elektroforezini gösteren Şekil 1D ile gösterilmiştir. Oransal FRET testinin rahatlığını, zaman ekonomisini ve kullanım kolaylığını göstermek için, zayıf bir nükleaz-lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesini ortaya çıkarmak ve incelemek için uygulanmıştır.
Zayıf nükleaz LEI
Proteaz inhibitörü LEI doğal olarak yarı kararlıdır, yani topolojik olarak dengesizdir. Bu özellik, inhibitör mekanizması için gereklidir. Hedef proteazı LEI reaktif bölge döngüsünü (RSL) parçaladığında, proteaz inhibitör molekülü ciddi bir konformasyonel değişikliğe uğrar ve proteazı mekanik olarak inaktif bir formagerer 10,11. Dikkat çekici bir şekilde, bu aynı zamanda LEI molekülünün kendisini kırar ve şişirir ve yerel kıvrımıyla kaplı şifreli bir DNaz bölgesinin maskesini çıkarır, böylece LEI'yi aktif bir endonükleaz L-DNaz II'ye (LEI'den türetilmiş DNaz II) dönüştürür11,12. Kriptik DNaz bölgesi, sülfürik asit10,13 içinde pH 2'de gece boyunca inkübe edilmesinin neden olduğu LEI'nin denatürasyonu ve kırılması ile de açığa çıkabilir. LEI'yi incelemek için bu FRET testinin kullanılması, LEI'nin gizli nükleolitik aktivitesini maskelemek için sert kimyasal denatürasyon işlemlerinin ve hedeflenen enzimatik bölünmenin kesinlikle gerekli olmadığını göstermiştir.
Ratiometrik FRET yaklaşımının sunulan uygulaması ve protokolü, normal, denatüre edilmemiş LEI'de doğal olarak mevcut olan zayıf DNaz aktivitesinin ortaya çıkarılmasını açıklamaktadır. Bölünmemiş LEI'nin içsel nükleolitik yeteneğinin keşfi ve analizi, testin farklı asidik pH seviyelerinde uzun süreli gözlemler için uygunluğu sayesinde mümkün olmuştur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi
Yöntem, çözünür bir proteinin nükleolitik özelliklerinin tespiti ve analizi için uygundur. İncelenen DNazın pH bağımlılığını incelemek için, prosedür aynı anda bir dizi pH değerinde DNaz aktivitesini değerlendirir. Teknik, zayıf ve yavaş nükleaz aktivitelerini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Florometrik değerlendirme sistemi için inkübasyon karışımı bileşenlerinin hazırlanması
- Tampon çözeltilerini istenen pH aralıklarında hazırlayın. 6.8 ila 8.0 pH aralığı için Tris-HCl veya fosfat tamponları kullanın. Stabilitesi ve enzim aktivitesi ile minimum etkileşimi nedeniyle fizyolojik pH koşulları (pH 7.2 ila 8.0) için Tris-HCl tamponu kullanın.
NOT: Fosfat tamponları bu pH aralığı için uygundur ancak tamponlama kapasitesi sınırlamaları nedeniyle daha yüksek pH değerleri (>7.5) için daha az uygundur.
4.2 ila 7.2 pH aralığı için asetat veya sitrat tamponları kullanın. Asetat tamponu, pH 4.2'ye kadar daha düşük pH koşulları için etkilidir.
NOT: Sitrat tamponu biraz daha yüksek pH değerlerinde (pH 5.6 ila 7.2) kullanılabilir ve iyi tamponlama kapasitesi sunar. Bu tamponlar, asidik ila nötr koşullar altında DNaz aktivitesini incelemek için uygundur. LEI'nin nükleolitik aktivitesine ilişkin sunulan çalışmada, pH'ı 4,8 ile 6,5 arasında değişen 10 mM sodyum asetat tamponları kullanılmıştır. - Protein örneğini her tampon çözeltisinde uygun bir konsantrasyona seyreltin. Numunedeki aktivite tamamen bilinmediğinde, proteinin bir dizi seyreltmesini hazırlayın. Optimal seyreltme, DNaz aktivitesinin gücüne bağlıdır ve birkaç protein konsantrasyonunun test edilmesiyle deneysel olarak belirlenmelidir.
NOT: LEI'nin ultra zayıf nükleolitik aktivitesine ilişkin sunulan çalışmada LEI, 1 μM'lik bir konsantrasyonda kullanılmıştır.- Yüksek konsantrasyonlu tamponlar kullanırken her zaman nihai çözeltinin pH'ını kontrol edin, çünkü konsantre tamponların pH'ı seyreltme üzerine değişebilir.
- Oransal FRET prob çözeltisini nükleaz içermeyen suda hazırlayın. 1 μM'ye (1 pmol/μL) yakın FRET prob konsantrasyonları kullanın. Çok yüksek prob konsantrasyonları kullanmaktan kaçının.
İstenmeyen baz eşleşmelerinin tamamen ayrışmasını sağlamak için uygulamadan önce prob çözeltisini hızla ısıtın ve soğutun.
NOT: LEI'nin nükleolitik aktivitesine ilişkin sunulan çalışmada, nükleaz içermeyen suda 1 μM (1 pmol/μL) FRET probu konsantrasyonu kullanılmıştır.
2. Substrat olarak ratiometrik FRET probu kullanılarak DNaz reaksiyonunun indüksiyonu
- Test edilecek her pH koşulu için 96 oyuklu bir plakada üç kuyucuk hazırlayın. Her biri pozitif ve negatif kontroller için üç ek kuyu ekleyin.
- PH serisi için her bir kuyucukta aşağıdakileri birleştirin:
70 μL nükleaz içermeyen su
10 μL 10X Tampon (seçtiğiniz tampon)
10 μL proteinli numune
10 μL oransal prob çözeltisi (10 pmol/μL stok konsantrasyonu)
NOT: Asidik pH'da LEI'nin nükleolitik aktivitesine ilişkin sunulan çalışmada aşağıdaki 10X Tampon kullanılmıştır: 100 mM Na Asetat pH 5.2 - Her pozitif kontrol kuyusunda, aşağıdakileri birleştirin:
79 μL nükleaz içermeyen su
10 μL 10X DNase II Tamponu (100 mM Na Asetat pH 5.2)
0,33 μL DNaz II (1 U/μL stok)
10 μL oransal prob çözeltisi (10 pmol/μL stok konsantrasyonu)
NOT: Asidik pH'taki çalışmalar için, pozitif kontrol olarak DNaz II'yi kullanın. pH 7'ye (özellikle pH 6.5-8) yakın DNaz aktivitesini değerlendirirken, DNaz I ve ilişkili tamponuna geçin (ör., 10 mM Tris-HCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, pH 7.6) DNaz II ve asetat tamponu yerine. - Her negatif kontrol kuyusunda protein numunesi yerine nükleaz içermeyen su ekleyin.
- PH serisi için her bir kuyucukta aşağıdakileri birleştirin:
- Farklı pH değerlerinde DNaz proteini içeren reaksiyon karışımlarına prob çözeltilerini ekleyerek DNaz reaksiyonunu indükleyin.
NOT: Kabarcık oluşumunu önleyerek tüm numuneleri iyice karıştırın. Aktif DNaz numuneleri için, tüm reaksiyonları mümkün olduğunca aynı anda başlatın. LEI gibi ultra zayıf faaliyetler için katı zamanlama daha az kritiktir.
NOT: Tutarlı inkübasyon süreleri sağlamak için, özellikle aktif nükleazlarla uğraşırken, her ölçüm için gereken süreye bağlı olarak numunelerin eklenmesini kademelendirin. Örneğin, her ölçüm 10 saniye sürüyorsa, ikinci örneği ilkinden 10 saniye sonra ekleyin.
3. Kuluçka
- Çalışılan DNazı, çeşitli zaman periyotları boyunca bir su banyosunda veya sıcaklık ayarlı inkübatörde 37 ° C'de ratiometrik FRET probu ile inkübe edin. Enzim devir oranlarını doğru bir şekilde değerlendirmek ve artefaktları en aza indirmek için düzenli örnekleme aralıklarına sahip birden fazla zaman noktası kullanın. LEI'nin ultra zayıf nükleolitik aktivitesine ilişkin sunulan çalışmada, yavaş nükleolitik reaksiyonu kaydetmek için 24 saatlik inkübasyon kullanılmıştır.
NOT: Ön deneylerde en uygun inkübasyon süresini belirleyin, çünkü bu, çalışılan DNazın gücüne bağlıdır. Aktif bir nükleaz, prob bölünmesini tamamlamak için çok kısa bir süre gerektirir, bu nedenle 15-30 dakikalık bir inkübasyon ile başlayın. Numune çok konsantreyse ve reaksiyon çok hızlıysa, protein konsantrasyonu azaltılmalıdır. Örnek protein çok zayıfsa, inkübasyon süresi gerektiği gibi artabilir.
4. Aynı pH koşullarına sinyal normalizasyonu
- 100 μL 250 mM Tris-HCL (pH 8.0) ekleyerek tüm inkübasyon reaksiyonlarını durdurun. Bu adım aynı zamanda tüm numunelerde pH'ı eşitler.
NOT: pH eşitleme adımı, farklı pH koşulları altında başlatılan reaksiyonları karşılaştırırken önemlidir. Prosedür, FRET tabanlı sinyalini en üst düzeye çıkararak prob parçalarının tamamen ayrılmasını sağlar. Ek olarak, probun FAM florofor emisyonu asidik pH'da azalır ve pH 8.0'da optimaldir. Bu çalışmada kullanılanlardan daha yüksek iyonik kuvvete sahip numuneler için, etkili pH ayarlaması elde etmek için daha konsantre (>250 mM) ve daha yüksek bir pH (>8.0) dengeleme çözeltisi gerekebilir.
NOT: Alkali pH, mevcut çalışmada gösterildiği gibi LEI gibi asit nükleazların aktivitesini etkili bir şekilde durdurmaktadır. Nötr veya alkalin nükleazlar için, sinyal değerlendirmesinden önce uygun spesifik inaktivasyon yöntemleri tanımlanmalı ve uygulanmalıdır.
5. Florometrik sinyal tespiti ve FRET oranlarının hesaplanması
- pH dengeleme adımından hemen sonra, hem verici hem de alıcı floroforların emisyon spektrumlarını kaydetmek için bir spektroflorometre kullanın. Donör floroforu 488 nm'de uyararak ve aynı anda 525 nm (donör) ve 580 nm'de (FRET'ten türetilmiş alıcı sinyali) emisyonları tespit ederek doğrudan 96 oyuklu plakada ölçümler yapın.
- Her numunedeki DNaz aktivitesini değerlendirmek için kaydedilen floresan yoğunluklarını kullanın. Verileri analiz etmek ve anlamlılığı değerlendirmek için uygun istatistiksel yöntemleri uygulayın.
NOT: Aşağıdaki formülü kullanarak FRET oranını hesaplayın: RFRET = 525 nm'de donör emisyonu/580 nm'de alıcı emisyonu. Bu tahlilde, DNA bölünmesi, floroforları ayırarak FRET'i bozar, bu da donör emisyonunun artmasına ve alıcı emisyonunun azalmasına neden olur. Bu kayma, DNaz aktivitesinin bir göstergesi olarak hizmet eden FRET oranını (RFRET) yükseltir.
6. Bölünmenin SAYFA tabanlı doğrulanması
- Denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)14 gerçekleştirerek FRET probunun bölünmesini doğrulayın. FRET probu ve bölünme ürünleri floresan olarak etiketlenir ve ek boyama olmadan görünür.
NOT: Temsili çalışmada, 38-mer FRET sondasının LEI aracılı bölünmesi, PAGE'in denatüre edilmesiyle doğrulanmıştır (bkz. Şekil 2). Analiz, LEI'nin 6-8 mer FAM etiketli fragmanlar ve 15-16 mer TAM etiketli fragmanlar ürettiğini ve bunun her iki firkete tepesine yakın bölünme ile tutarlı olduğunu ortaya koymuştur. Bu model, DNase II tarafından oluşturulan parça profilinden farklıydı.- Her numuneden 15 μL yükleyin.amp% 20 denatüre edici bir PAGE jeli üzerine.
- Jeli 100 V'ta 1 saat çalıştırın.
- Yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış bir dokümantasyon sistemi kullanarak jel görüntüler elde edin.
NOT: Temsili çalışmadaki görüntüler bir dijital SLR fotoğraf makinesi kullanılarak çekilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu temsili çalışma, uzun gözlem süreleri gerektiren yavaş enzimatik reaksiyonları araştırmak için ratiometrik FRET yaklaşımının belirli avantajlarını vurgulamaktadır. Özellikle, uygulama bir oransal FRET sistemi kullanarak LEI'nin içsel DNaz faaliyetinin tespitini ve analizini göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir.
Bu yaklaşımı kullanarak, LEI'nin hafif asidik koşullar al...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, zayıf bir nükleaz - lökosit elastaz inhibitörü (LEI) kullanılarak DNaz aktivitesinin tespiti ve değerlendirilmesi için ratiometrik FRET uygulamasını göstermektedir. Yaklaşım, proteinlerin ve biyomoleküllerin DNaz özelliklerini değerlendirmek için uygun ve kantitatif bir yöntem sağlar. Protokolü basittir ve veri analizi prosedürü doğrudan ve basittir. Tahlil, çeşitli asidik pH'larda uzun inkübasyonları tolere eden 38 mer'lik bir FRET probu kullanır. Bu özellik, gösterdiğimiz g...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, NIH'den R01 GM148812 hibe ile desteklenmiştir; Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH'den R21 CA255979 hibeleriyle; ve her ikisi de Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, NIH'den (tümü VVD) R21 AG073887 ve R21 AG071978 verir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 kuyucuklu plaka | Doğan | 353219 | |
| DNA FRET Probu | IDT DNA'sı | 5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM – Floresan-dT; TAM – Tetrametilrodamin-dT. | |
| DNase II | Sigma Aldrich | D8764 | |
| EVOLT dijital SLR fotoğraf makinesi | Olympus | E500 Serisi | |
| Güç Kaynağı ile Jel Elektroforez Aparatı | Biyo-Rad | ||
| LEI | Novoprotein | CJ01 | |
| LiCOR Jel Görüntüleme Sistemi | LiCOR | ||
| Nükleaz içermeyen su | Davetli | 10977015 | |
| Pre-Cast PAGE Jel | Davetli | EC68852 | |
| Sodyum Asetat Tampon Çözeltisi pH 5.2 | Sigma Aldrich | S2899-100ML | |
| Spektroflorometre | Çay | Saffire 2 |
Kaynaklar
- A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081 (2018).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Front Plant Sci. 4, 413(2013).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
- Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes. Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).
- Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction. Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis. PLoS One. 9 (9), e108734(2014).
- Didenko, V. V. Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance. Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).
- Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods. Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).
- Lee, M. H., Kim, J. S., Sessler, J. L. Small molecule-based ratiometric fluorescence probes for cations, anions, and biomolecules. Chem Soc Rev. 44 (13), 4185-4191 (2015).
- Torriglia, A., Leprêtre, C., Padrón-Barthe, L., Chahory, S., Martin, E. Molecular mechanism of L-DNase II activation and function as a molecular switch in apoptosis. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1490-1502 (2008).
- Padron-Barthe, L., Leprêtre, C., Martin, E., Counis, M. F., Torriglia, A. Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis. Mol Cell Biol. 27 (11), 4028-4036 (2007).
- Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor. Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).
- Torriglia, A., et al. L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor. Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).
- Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
- Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine. Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D. Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).
- Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases (2025).
- Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway. Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).
- Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).
- Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons. Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
