Method Article

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/67134

⸱

July 25th, 2025

 , 
1Baylor College of Medicine, 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit ve hassas bir oransal Förster rezonans enerji transferi (FRET) testini tanımlar. Oransal FRET ölçümleri, verici ve alıcı emisyon sinyallerinin oranını kullanır. Tahlil, gerçek zamanlı bir DNA bölünme sensörü olarak kullanılan, zımba şeklinde, çift etiketli 38 mer FRET oligoprobu kullanarak tek sarmallı DNA kırılmalarını tespit eder. Açıklanan yaklaşımın ana uygulaması, pH, sıcaklık ve tampon bileşimi gibi reaksiyon koşullarının DNaz aktivitesi üzerindeki etkilerinin kantitatif değerlendirmesidir. Küçük ve yavaş DNA bölünmesini bile tespit etme kabiliyeti nedeniyle, tahlil, uzun süreli gözlem gerektiren zayıf nükleolitik aktiviteyi araştırmak ve pH'ın DNaz aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için özellikle uygundur. Bu oransal FRET protokolünün bu spesifik avantajları, lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesinin tespiti ve analizine uygulanmasıyla gösterilmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oransal floresan yaklaşımı, yalnızca tek bir sinyalin 1,2 yoğunluğuna güvenmek yerine floresan sinyallerinin oranlarını kullanan analitik bir yöntemdir. Oranları kullanmanın avantajı, dahili kalibrasyon sağlamaları ve numune ve prob konsantrasyonlarındaki değişiklikler, cihaz parametreleri vb. gibi birçok rastgele faktörü telafi etmeleridir. Bu, floresan probların doğruluğunu ve hassasiyetini artırır.

Förster rezonans enerji transferi (FRET) problarının özel bağlamında, "ratiometric" terimi, ölçümün FRET donör ve alıcı florofor çiftinden gelen iki emisyon sinyalinin oranına dayandığ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Yöntem, çözünür bir proteinin nükleolitik özelliklerinin tespiti ve analizi için uygundur. İncelenen DNazın pH bağımlılığını incelemek için, prosedür aynı anda bir dizi pH değerinde DNaz aktivitesini değerlendirir. Teknik, zayıf ve yavaş nükleaz aktivitelerini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Florometrik değerlendirme sistemi için inkübasyon karışımı bileşenlerinin haz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu temsili çalışma, uzun gözlem süreleri gerektiren yavaş enzimatik reaksiyonları araştırmak için ratiometrik FRET yaklaşımının belirli avantajlarını vurgulamaktadır. Özellikle, uygulama bir oransal FRET sistemi kullanarak LEI'nin içsel DNaz faaliyetinin tespitini ve analizini göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir.

Bu yaklaşımı kullanarak, LEI'nin hafif asidik koşullar al.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, zayıf bir nükleaz - lökosit elastaz inhibitörü (LEI) kullanılarak DNaz aktivitesinin tespiti ve değerlendirilmesi için ratiometrik FRET uygulamasını göstermektedir. Yaklaşım, proteinlerin ve biyomoleküllerin DNaz özelliklerini değerlendirmek için uygun ve kantitatif bir yöntem sağlar. Protokolü basittir ve veri analizi prosedürü doğrudan ve basittir. Tahlil, çeşitli asidik pH'larda uzun inkübasyonları tolere eden 38 mer'lik bir FRET probu kullanır. Bu özellik, gösterdiğimiz g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, NIH'den R01 GM148812 hibe ile desteklenmiştir; Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH'den R21 CA255979 hibeleriyle; ve her ikisi de Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, NIH'den (tümü VVD) R21 AG073887 ve R21 AG071978 verir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 kuyucuklu plakaDoğan353219
DNA FRET ProbuIDT DNA'sı5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM – Floresan-dT;   TAM – Tetrametilrodamin-dT. 
DNase IISigma AldrichD8764
EVOLT dijital SLR fotoğraf makinesiOlympusE500 Serisi
Güç Kaynağı ile Jel Elektroforez AparatıBiyo-Rad
LEINovoproteinCJ01
LiCOR Jel Görüntüleme SistemiLiCOR
Nükleaz içermeyen suDavetli10977015
Pre-Cast PAGE JelDavetliEC68852
Sodyum Asetat Tampon Çözeltisi pH 5.2Sigma AldrichS2899-100ML
SpektroflorometreÇaySaffire 2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081 (2018).
  2. Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Front Plant Sci. 4, 413(2013).
  3. L....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNase ActivityRatiometric FRETFluorescence Resonance Energy TransferDNA Cleavage AssayFRET ProbeNuclease Activity DetectionPolyacrylamide GelSpectrofluorometer AnalysispH Effect DNaseLeukocyte Elastase Inhibitor

Related Articles