Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67146

⸱

7 Mart 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, respirometrik ve enzimatik testler yoluyla mitokondriyal fonksiyon üzerindeki ksenobiyotik etkileri incelemek için bir metodoloji sunmaktadır. Çeşitli türlerde elektron taşıma zinciri modülasyonunu inceleyerek, böcek vektörü kaynaklı hastalıklara karşı hedeflenen biyopestisit gelişimi için içgörüler sunar.

Özet

Mitokondri, elektron taşıma zinciri (ETC) yoluyla enerji üretimindeki önemli rolleri nedeniyle genellikle hücrenin güç merkezi olarak adlandırılır. Bununla birlikte, önemleri enerji üretiminin çok ötesine uzanır. Mitokondriyal biyoenerjetik bozuklukları, sağlığı ve hücresel işlevi etkileyen hücre içi kaskadları tetikleyebilir. Fizyolojik önemleri göz önüne alındığında, yeni tedaviler ve biyoürünler geliştirmek için mitokondriyal fonksiyonun farmakolojik potansiyelini keşfetmeye artan bir ilgi vardır. Mitokondriyal biyoenerjetik modüle etmek, nörodejeneratif bozukluklar, metabolik hastalıklar ve kanser gibi zorlukların ele alınmasının yanı sıra zararlıları ve vektör kaynaklı hastalıkları kontrol etmek için biyoürünler geliştirmek için yenilikçi yaklaşımlar sağlayabilir.

Bu çalışma, kompleks I için glutamat ve NADH, kompleks II için süksinat ve kompleks III ve IV için sitokrom c (hem oksitlenmiş hem de indirgenmiş) dahil olmak üzere çeşitli substratlar kullanarak ksenobiyotiklerin elektron taşıma zinciri (ETC) üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu metodoloji, mitokondriyal kompleksler yoluyla elektron taşınmasının aktivasyonunun veya inhibisyonunun bir respirometre ve spektrofotometre kullanılarak değerlendirilmesine izin verir. Mitokondri, izole edilmiş mitokondriden, parçalanmış hücrelerden veya çeşitli türlerden homojenize edilmiş dokudan elde edilebilir.

Laboratuvarda, Aedes aegypti ve Wistar sıçanlarında mitokondriyal fonksiyon analiz edilmiştir, ancak bu yöntem Rhipicephalus microplus ve Rhodnius prolixus gibi diğer türlere de uygulanabilir. Bu yaklaşım, benzersiz enerjik taleplerinden etkilenen birleştirici proteinlerin varlığı ve türe özgü oksitlenebilir substrat tercihleri hakkında teorileştirme için temel sağlar. Son bulgular, vektör kaynaklı hastalıkları ve haşere istilasını etkili bir şekilde kontrol etmek için önemli bir potansiyele sahip olan mitokondriyal fonksiyonu hedefleyen yenilikçi biyoinsektisit tasarım stratejileri hakkında değerli bilgiler sunmaktadır.

Giriş

Mitokondri, oksidatif fosforilasyonişlemi 1,2 sırasında kimyasal enerji üretmeleri nedeniyle her zaman hücrelerin enerji santrali olarak adlandırılmıştır. Mitokondri, ana çekirdek metabolik işlevlerinin ötesinde, hücre içi Ca2 + düzenleme seviyeleri, enflamatuar süreçler ve reaktif oksijen türleri üretiminden hücre ölümü indüksiyon süreçlerinekadar değişen diğer birçok hücresel süreçte de rol oynar 3. Mitokondriyal biyoenerjetik ve bunların düzensizliği, hücresel işlevi ve genel sağlığı etkileyen hücre içi süreçlerle ilişkilendirilmiştir. Bu, yenilikçi tedaviler ve güvenli biyoürünlergeliştirmek için mitokondriyal fonksiyonu hedeflemenin farmasötik potansiyelini araştırmaya artan bir ilgi uyandırmıştır 4,5,6. Ek olarak, mitokondriyal süreçlerin karmaşık etkileşimini ve bunların hücresel işlev üzerindeki etkilerini anlamak, hedefe yönelik tedaviler geliştirmek ve vektör kaynaklı hastalıkları ve haşere istilasını kontrol etmek için biyoürünler tasarlama fırsatları sunmak için çok önemlidir 7,8.

Elektron taşıma zincirinin belirli bileşenlerini ksenobiyotiklerle hedeflemek, biyopestisit üretimi için mitokondriyal fonksiyonu modüle etmek için bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Nanopartikül bazlı mitokondri hedefli pestisitler gibi pestisit formülasyonlarına dahil edilen doğal ve sentetik bileşiklerin, S. frugiperda9'da mitokondriyal potansiyeli ve ATP sentezini azaltarak mitokondriyal fonksiyonu etkilediği gösterilmiştir.

Ek olarak, karbamatların ve piretroid bazlı ürünlerin çoğu sivrisineklerde kompleks I inhibitörleri olarak bildirilmiştir; bununla birlikte, uzun süreli maruziyetleri, Anopheles gambiae'de, genellikle bu substratları metabolize edebilen yüksek P450 seviyeleri ile ilişkili bazı piretroid dirençli popülasyonlar yaratmıştır10,11. Benzer şekilde, bitkiler ve bunların uçucu yağları, özleri ve ikincil metabolitleri, farklı böcek evrelerinde geniş bir mortalite aralığına sahip potansiyel böcek öldürücüler olarak belgelenmiştir12,13. Bu doğal bileşiklerin insektisit aktivitesi, reaktif oksijen türleri üretimini, mitokondriyal potansiyel ΔΨm'yi ve hücre ölümü süreçlerinitetikleyebilen ATP sentezini modüle ederek mitokondriyal solunum zincirindeki belirli bir noktada elektron taşıma inhibisyonu ile ilişkili olabilir 6,8.

Pestisit formülasyonu için kaynak olarak doğal bileşikler ve bunların mitokondri üzerindeki etkileri, yeni ve güvenli biyopestisitlerin tasarımında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, bu el yazması, ksenobiyotiklerin mitokondriyal kompleksler yoluyla elektron taşınmasını aktive etme veya inhibe etme kapasitesini belirlemek için bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu kapsamlı yaklaşım, hem respirometri hem de spektrofotometri yöntemlerini kullanarak çeşitli substratlar kullanarak ksenobiyotiklerin mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkilerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu metodoloji, Aedes aegypti de dahil olmak üzere anahtar vektör türlerinin mitokondriyal işlevini analiz etmek için uygulanmıştır ve bu da birleştirici proteinlerin varlığının ve her türe özgü farklı oksitlenebilir substrat tercihlerinin teorileştirilmesine yol açmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler "Comité de ética en investigación científica CEINCI" Etik Komitesi: Santander Endüstri Üniversitesi Bilimsel Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, bu tahliller Arrive yönergelerine uygun hale geldi ve Kolombiya'daki hayvan araştırmalarını düzenleyen 1989 Kolombiya Yasası 84 (Bölüm IV, Madde 23-26) ve 8430 sayılı Kararı (1993, Başlık IV, Madde 83-93) takip etti.

NOT: Bu protokole başlamadan önce herhangi bir biyokimya kitabının oksidatif fosforilasyon bölümünü okumanız şiddetle tavsiye edilir.

1. Reaktifler ve çözeltiler

  1. Sıçan karaciğeri mitokondrisini izole etmek için 250 mL mitokondri izolasyon tamponu hazırlayın: 250 mM D-mannitol, 10 mM HEPES pH 7.2 ve 1 mM EGTA. 50 mL izolasyon tamponunu çıkarın (buna BSA'sız izolasyon tamponu denilecektir) ve ardından diğer 200 mL'ye 0,2 g BSA ekleyin (buna BSA'lı izolasyon tamponu denilecektir).
  2. Aedes aegypti larvalarını homojenize etmek için 100 mL tampon hazırlayın: 250 mM sükroz, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA pH 7.2.
  3. Reaksiyon tamponu hazırlayın: 80 mM Sodyum Fosfat Tampon çözeltisi, pH 7.4, 50 μM EDTA.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi pH 7.2'de enzimatik aktiviteler için kullanılan bir reaktif stoğu hazırlayın: 25 mM NADH (her test için taze hazırlanmış), 2 M sodyum süksinat, 4 mM sitokrom c (her test için taze hazırlanmış), 200 μM rotenon, 0.5 mM KCN, 6 mM 2,6-diklorofenolindofenol (DCPIP), 100 mM fenazin metosülfat (PMS) ve 60 mM potasyum ferrisiyanür.
    NOT: Tüm deneyler ve reaktiflerin hazırlanması için 25 ° C'de 18.2 MΩ · cm özgeçimli ultra saf su kullanılmıştır. Bu su, organik, inorganik ve mikrobiyal kirleticilerin tespit edilebilir sınırların altındaki seviyelere çıkarılmasını sağlayan bir Milli-Q arıtma sistemi kullanılarak üretildi ve bu da onu yüksek hassasiyetli biyokimyasal ve moleküler biyoloji uygulamaları için uygun hale getirdi.

2. Sıçan karaciğerinden karaciğer diseksiyonu, homojenizasyon ve mitokondri izolasyonu

  1. Başlamadan önce, mitokondriyal hasarı önlemek için tüm malzemeleri ve tamponları buzun üzerine yerleştirin ve tüm test boyunca tüm malzemelerin buz gibi soğuk olduğundan emin olun.
  2. Buz gibi soğuk bir konik tüpe 10 mL mitokondri izolasyon tamponu yerleştirin.
  3. Solunum tahlillerine müdahale edebilecek CO2 kullanımından kaçınarak erkek Wistar sıçanı servikal dekapitasyon ile ötenazi yapın. Bunun için Santander Endüstri Üniversitesi (CEINCI) Bilimsel Araştırmalarda Etik Komitesi, 2022 tarihli 13 sayılı kararla yöntemleri onayladı.
    NOT: Sıçanlar 170 g'dan daha ağır olmamalıdır; Yağ ayrıca solunum analizlerini de etkileyebilir.
  4. Abdominal sıçan bölümünden steril bir neşter ile bir kesi (yaklaşık 4-5 cm) yapın.
  5. Karın bölgesi göründüğünde karaciğeri tamamen inceleyin. Sıçan karaciğeri, koyu kırmızı, yaklaşık 10 cm x 5 cm boyutlarında, çok loblu bir organdır.
  6. Karaciğeri dikkatlice buz gibi soğuk izolasyon tamponuna koyun ve bu ortamla iki kez durulayın.
  7. Karaciğeri (1 cm'den küçük boyut) 10 mL izolasyon ortamı içeren bir Petri kabında keskin bir makasla ince bir şekilde kıyın.
  8. Solüsyonu Potter Elvehjem doku homojenizatör tüpüne koyun ve en az on kez, düşük hızda (~ 390 rpm) dikkatlice homojenize edin.
  9. Çözeltiyi konik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
  10. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice yeni bir konik tüpe dökün. Peletleri dokunun bir kısmı, kan ve sağlam hücresel bileşenlerle birlikte atın.
  11. Tüpü daha fazla izolasyon tamponu (~ 35 mL) ile doldurun ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleyin.
  12. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti (mitokondri) BSA içermeyen yeni bir izolasyon tamponunda dikkatlice yeniden süspanse edin.
    NOT: Mitokondriyal resüsitasyon için yumuşak bir fırça kullanılması önerilir.
  13. Daha sonra, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve izole edilen mitokondriyi BSA olmadan 2 mL izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
  14. Bradford yöntemini veya benzerini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin14.

3. Aedes aegypti kolonisi ve larva homojenizasyonu.

NOT: Bu işlem için Ae. aegypti kolonisi üreme kafeslerinde (40 cm × 40 cm ±× %5), fotoperiyot (12:12) ve sıcaklık (27 ± 5 °C) gibi böcek koşullarında tutulmuştur. Yumurtalar filtre kağıdına toplandı.

  1. Deneyden bir hafta önce yumurtaların filtrelenmiş ve klorsuz su dolu tepsilerde çatladığından emin olun. Larva döngüsündeki tüy dökme işlemi ile instarı tanımlayın. L1, L2 ve L3 durumunu doğrulamak için her bir kalıplama işlemini gözlemleyin. Larva L3'e girdiğinde, materyali toplamak için en fazla 12 saat bekleyin.
  2. Klorsuz suda (~ 30 mL su) instar L3-L4'te en az 100 Ae toplayın. aegypti larvaları. Larvaları bir Pasteur pipeti ile alın.
  3. Larvaları filtre kağıdı kullanarak süzün, toplanan larvaları durulayın ve Aedes aegypti homojenizasyon tamponunda (~ 2 mL) tekrar süspanse edin.
  4. Larvalarla olan çözeltiyi Potter Elvehjem doku homojenizatör tüpüne aktarın ve ~ 390 rpm'de en az on kez dikkatlice homojenize edin.
  5. Homojenize dokuyu aktarın ve büyük dış iskelet kalıntılarını gidermek için bir cam yünü şırıngadan süzün.
  6. Bradford yöntemini veya benzerini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin15.
    NOT: Mitokondriyi sivrisinek larvalarından izole etmek gerekli değildir; Bu adımda elde edilen protein ekstraktını kullanarak ksenobiyotiklerin etkisini değerlendirmek mümkündür.

4. Ksenobiyotiklerin mitokondriyal elektron taşıma zinciri üzerindeki etkilerinin belirlenmesi

NOT: Bu protokol, ksenobiyotiklerin mitokondriyal biyoenerjetik üzerindeki etkisini, sıçan karaciğerinden izole edilen mitokondri ve homojenize edilmiş böcek dokusu üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır.

Tahliller ikiye ayrılır: polarografik (NADH ve Süksinat oksidaz) ve spektrofotometrik (NADH dehidrojenaz - kompleks I, süksinat dehidrojenaz - kompleks II, sitokrom c redüktaz - kompleks III ve sitokrom c oksidaz - kompleks IV).

  1. Polarografik tahliller: Bunun için, O2 tüketimi ile NADH ve süksinatın tam oksidasyonunu ölçmek için yüksek çözünürlüklü respirometri kullanın ve sonuçları NADH ve süksinat oksidaz olarak raporlayın.
    1. Tahlillere başlamadan önce cihazı her gün kalibre edin. Bu adım, kullanılan oksigrafa bağlı olarak değişebilir. Üreticinin talimatlarına uyun.
      1. Oroboros kalibrasyonu için, hazneyi ve enjeksiyon kılcalını ortamla doldurmak için deney odası hacminin (2 mL) en az 0,2 mL üzerinde olan odalara reaksiyon ortamı ekleyin.
    2. Orta ilaveden sonra karıştırıcıları açın.
    3. Oksijen konsantrasyonu sinyali stabilize olana kadar bekleyin ve kaydedin.
    4. Sıfır oksijen kalibrasyonu için, oksijen tükenmesine izin veren mitokondri, hücre süspansiyonları, ekmek mayası veya ditiyonit (Ekmek mayası önerilir) ekleyin ve kaydedin. Sinyalin arka plan seviyelerine ulaşmasını bekleyin (O2k sistemi için tipik olarak ± 2 pmol/mL/s'dir).
    5. Odaya reaksiyon tamponu, 0.1 mg protein (mitokondriyal veya larva homojenize) ve substrat (0.17 mM NADH veya 10 mM sodyum süksinat) eklerken oksijen tüketimini izleyerek NADH ve süksinat oksidaz aktivitelerini gerçekleştirin.
    6. Gözlenen oksijen tüketiminin mitokondriyal solunum zincirinden kaynaklandığını doğrulamak için elektron taşıma protein inhibitörleri kullanın. Yaygın olanları rotenon 1 μM ve KCN 1mM16'dır. Oksigraf hücresinde, reaktifleri Tablo 1'e göre ekleyin (sıra önemlidir).
  2. Spektrofotometrik deneyler
    NOT: Mitokondriyal kompleksler boyunca elektron taşınmasını değerlendirmek için, enzimatik tahliller bir spektrofotometre ve PMS, DCPIP ve sitokrom c gibi yapay elektron alıcıları kullanılarak yapıldı ve ölçüldü. Günde bir enzimin ölçülmesi tavsiye edilir. Tahlillerden en az bir gün önce tamponları ve reaktifleri hazırlayın. Bazı bileşikler ışığa duyarlıdır; görmek Tablo 2 daha fazla öneri için.
    1. NADH dehidrojenaz aktivitesi için, reaksiyon sistemleri 50 mM fosfat tampon çözeltisi pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.1 mg/mL mitokondriyal protein, 1 μM rotenon ve 1 mM KCN içerir. Spektrofotometre hücresinde, reaktifleri Tablo 2'ye göre ekleyin (sıra önemlidir)17. Önerilen adımlar aşağıdaki gibidir:
      1. EDTA ile karıştırılmış 100 mL tampon fosfat hazırlayın ve pH'ın değişmediğini iki kez kontrol edin. Tamponu buzdolabında saklayın, ancak tahliller sırasında oda sıcaklığında (RT; yaklaşık 25 ° C) tutulması zorunludur.
      2. Rotenone, KCN, NADH ve potasyum ferrisiyanürden oluşan taze stok çözeltileri hazırlayın (4 saate kadar stabil). Önerilen hacim 1 mL konsantre çözeltidir (tablonun ilk sütununa bakın).
      3. Test edilen bileşiğin suda çözünürlüğü düşükse, sadece bileşiğin çözücüsünü kullanarak deney tasarımına enzim aktivitesi için ek bir kontrol ekleyin.
      4. İlk olarak, 420 nm'de potasyum ferrisiyanürün azaltılmasıyla NADH dehidrojenaz aktivitesini izleyin. Konsantrasyonunu 1.04 mM-1·cm-1 molar sönme katsayısı ile hesaplayın. Spektrofotometre, bir reaksiyondaki maksimum aktiviteyi hesaplama seçeneğine sahiptir; Kullanım kılavuzunu kontrol edin. Daha sonra, rapor edilen aktiviteyi, enzimin spesifik aktivitesini elde etmek için kullanılan protein konsantrasyonuna bölün.
    2. Yapay elektron alıcıları olarak 20 μM 1-diklorofenolindofenol (DCPIP) ile 60 mM sodyum süksinat ve 2,6 mM fenazin metosülfat (PMS) ekleyerek süksinat dehidrojenaz aktivitesini değerlendirin. Spektrofotometre hücresinde, reaktifleri Tablo 3'e göre ekleyin (sıra önemlidir)17. Öneriler aşağıdaki gibidir:
      1. NADH dehidrojenaz için kullanılanla aynı tamponu hazırlayın. Aynı koşullarda bakımını yapın.
      2. Süksinat, PMS ve DCPIP'nin taze stok çözeltilerini hazırlayın. Önerilen hacim 1 mL konsantre çözeltidir. PMS ve DCPIP çözeltilerini testin aynı gününde hazırlayın.
      3. Test edilen bileşiğin suda çözünürlüğü düşükse, deney tasarımına enzim aktivitesi için ek bir kontrol ekleyin.
      4. DCPIP'nin 600 nm'de indirgenmesiyle süksinat oksidasyonunu izleyin. Beer yasasını uygulayarak konsantrasyonunu 21.0 mM−1·cm−1 molar sönme katsayısı ile hesaplayın. Daha sonra, rapor edilen aktiviteyi, enzimin spesifik aktivitesini elde etmek için kullanılan protein konsantrasyonuna bölün.
    3. Oksitlenebilir substratlar olarak NADH veya süksinat kullanarak Sitokrom c redüktaz (kompleks III) aktivitesini ölçün. Bu enzimle, kompleks I'den (NADH kullanılarak) veya kompleks II'den (süksinat kullanılarak) elektron taşınması ubikinona ve daha sonra elektronları sitokrom c'ye geçiren kompleks III'e geçer. Bu reaksiyonu sitokrom c'nin indirgenmesi takip eder. 50 mM fosfat tampon çözeltisi pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.1 mg mitokondriyal protein, 50 μM NADH ve 0.1 mM KCN içeren reaksiyon sistemini hazırlayın. Spektrofotometre hücresinde, reaktifleri Tablo 4'e göre ekleyin (sıra önemlidir)18. Öneriler aşağıdaki gibidir:
      1. NADH dehidrojenaz için kullanılanla aynı tamponu hazırlayın. Aynı koşullarda bakımını yapın.
      2. NADH dehidrojenazdan aynı NADH ve KCN'yi kullanın.
      3. Test edilen bileşiğin suda çözünürlüğü düşükse, deney tasarımına enzim aktivitesi için ek bir kontrol ekleyin.
      4. 550 nm'de sitokrom c indirgemesini izleyin ve Beer yasasını uygulayarak 19.8 mM−1·cm−1 molar sönme katsayısı ile konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra, rapor edilen aktiviteyi, enzimin spesifik aktivitesini elde etmek için kullanılan protein konsantrasyonuna bölün.
    4. Sitokrom c oksidaz aktivitesi olarak ifade edilen sitokrom c oksidazı (kompleks IV) ölçün. Bunun için 50 mM fosfat tampon çözeltisi, pH 7.4, 2 mM EDTA ve 0.1 mg mitokondriyal protein içeren bir sistem reaksiyonu hazırlayın (Tablo 5). Bu enzimatik tahliller için, sitokrom c'nin tamamen azalmasını sağlamak için eşmolar miktarlarda sitokrom c ve sodyum ditiyoniti karıştırarak sitokrom c'yi azaltın.
    5. Daha sonra, elde edilen karışımı, mobil faz ile aynı fosfat tamponlu çözeltiyi kullanarak çapraz bağlı bir dekstran jel kolonundan geçirin. Daha sonra, toplanan fraksiyonları 550 nm19'da bir spektrofotometre kullanarak ölçün. Öneriler aşağıdaki gibidir:
      1. NADH dehidrojenaz için kullanılan tamponun aynısını kullanın. Aynı koşullarda bakımını yapın.
      2. Test edilen bileşiğin suda çözünürlüğü düşükse, deney tasarımına enzim aktivitesi için ek bir kontrol dahil edilmelidir.
      3. Sitokrom c oksidasyonunu 550 nm'de izleyin ve Beer yasasını uygulayarak 19.8 mM−1·cm-1 molar sönme katsayısı ile konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra, rapor edilen aktiviteyi, enzimin spesifik aktivitesini elde etmek için kullanılan protein konsantrasyonuna bölün.
        NOT: Oksijen tüketimi ve spektrofotometri ile ölçülen enzimlerin spesifik aktivitesini hesaplama sürecini gösteren bir elektronik tablo dosyası, Ek Dosya 1 olarak dahil edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol ile elde edilen sonuçları analiz etmeden önce, mitokondrideki elektron taşıma zincirinin biyokimyası hakkında biraz bilgi sahibi olmak önemlidir. İlk olarak, NADH, kompleks I'de bulunan oksidoredüksiyon merkezlerine bir çift elektron sağlar. Orada, kompleks I'den ubikinona geçen elektronların taşınmasına, daha sonra onları sitokrom c'ye bağışlayan kompleks III'e ve son olarak oksijenin son elektron alıcısı olduğu kompleks IV'e taşınmasına başlar ve onu suya indirger. Öte yandan, süksinat elektronları kompleks...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ksenobiyotiklerin mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak için yüksek çözünürlüklü O2 ile spektrofotometrik ve polarografik bir yöntem kullanıldı. Çalışma, Cymbopogon flexuosus esansiyel yağı ve karvakrolün NADH ve süksinat oksidasyonu üzerindeki etkisini ve ayrıca mitokondriyal elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşınmasını iki farklı biyolojik model kullanarak özel olarak değerlendirdi: sıçan karaciğerinden izole edilmiş mitokondri ve homojeni...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar, Universidad Industrial de Santander'in "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" ye, "Sığırlarda kene istilasını önlemek için bir laboratuvarda tasarlanmış ve sahada doğrulanmış bir ixodicide ve ixorepellent formülasyonu" projesine karşılık gelen 3739 numaralı hibeyi finanse ettiği için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,6-diklorofenolindofenolMerck119814Aynı kullanım günü hazırlayın.
Bradford reaktifiMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Sitokrom cMerckC2506Işığa duyarlı dönüştürücü alüminyum folyo ile kaplayın. Çözelti halinde dondurucuda saklanmalıdır.
D-mannitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidratMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178Çözeltide 2 hafta boyunca çalışır.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC MikroplakaFotometre Thermo Scientific 
51119100 Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Fenazin metosülfat MerckP9625Aynı kullanım günü hazırlayın.
Potasyum ferrisiyanür Merck244023Aynı kullanım günü hazırlayın.
Potter Elvehjem doku homojenleştirici tüp
RotenoneMerck557368Etanolde çözünür. Işığa duyarlı dönüştürücü, alüminyum folyo ile kaplayın. Çözelti halinde dondurucuda saklanmalıdır.
Sodyum süksinatMerckS9637Çözelti içinde dondurucuda saklanmalıdır.
SükrozMerck S0389
ve beta; - Nikotinamid adenin dinükleotid, indirgenmiş Disodyum tuzu hidratMerckN8129Işığa duyarlı dönüştürücü alüminyum folyo ile kaplayın. Çözelti halinde dondurucuda saklanmalıdır.

Kaynaklar

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Elektron Taşıma ZinciriMitokondriyal BiyoenerjetikRespirometrik AnalizEnzimatik AnalizMitokondri İzolasyonuOksijen TüketimiNADH Dehidrogenaz AktivitesiSitokrom C Oksidaz
İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.