Yöntem makalesi

Küçük Hücre Dışı Veziküllerden MikroRNA'ların Yeni Nesil Dizilimi için Ultra Hassas cDNA Kütüphanesi Hazırlığı

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), alıcı hücreleri düzenleyen hücreye özgü mikroRNA'lar içerir ve bunların tanımlanması, biyobelirteçler olarak işlevlerine ve rollerine ışık tutabilir. Optimize edilmiş cDNA kitaplığı hazırlama protokolümüz, Illumina sıralayıcılarla uyumluluk için eşleştirilmiş uçlu çift indeksli barkodları kullanırken düşük girişli EV'lerin örnek çoğullamasını ve gelişmiş işlenmesini sağlayan benzersiz barkodlar sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, tüm biyoakışkanlarda bulunan küçük hücre dışı veziküllerin (sEV'ler) proteinleri, DNA'yı ve RNA'ları kanalize ederek hücreler arası iletişimde kritik roller oynadığını göstermektedir. sEV'lerde paketlenen mikroRNA'lar (miRNA'lar), alıcı hücrelerde kritik teslim edilebilir düzenleyiciler olarak ortaya çıkmıştır. Normal ve hastalıklı hücreler tarafından salgılanan sEV'ler farklı miRNA kargoları taşıdığından, son sEV-miRNA profilleme çalışmaları, dolaşımdaki yeni biyobelirteçleri tanımlamaya yardımcı olabileceklerini düşündürmektedir. Bununla birlikte, çeşitli biyosıvılarda dolaşan hücreye/hastalığa özgü sEV'ler, bir kez izole edildikten sonra, geleneksel spektrometrik metodolojiler kullanılarak ölçülmesi genellikle zor olan düşük miRNA miktarları sağlar. Klonlanmış miRNA dizilerinin amplifikasyonuna izin veren küçük kodlamayan RNA Yeni Nesil Dizileme (NGS), sEV'lerin miRNA kargolarını değerlendirmek için değerli bir fırsat sunar. Ne yazık ki, ticari cDNA kütüphanesi hazırlama prosedürleri genellikle izole edilmiş sEV'lerden elde edilen ölçülemeyen miktarların çok üzerinde RNA girdileri gerektirir.

Bu nedenle, mevcut cDNA kütüphanesi hazırlama prosedürümüzün sağlamlığı ve çoğullama yetenekleri göz önüne alındığında (yani, başlangıçta düşük girdili, yüksek derecede bozulmuş, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) RNA'nın analizi için optimize edilmiş), sEV miRNA'larının analizi için uygulanabilirliğini değerlendirmeye çalıştık. Daha da önemlisi, dizileme çiplerinin son teknik kümeleme iyileştirmelerini dikkate alarak, dizileme ve çoğullama yeteneklerimizi geliştirmek için transkript barkodlama yaklaşımımızı eşleştirilmiş uçlu, çift indeks uyumlu bir cDNA kitaplığı hazırlama iş akışı içinde uyarlamaya çalıştık. 16 replikasyonda 8.4 × 109 sEV'den ekstrakte edilen RNA'yı ve 1010 sEV'den 2.5 × 107 sEV'ye kadar azalan sEV miktarlarını kullanarak, bu metodolojinin tekrarlanabilirliğini ve duyarlılığını değerlendirdik. Veriler, 16 adet 3' adenillenmiş DNA barkodunun, 3.15 pg kadar düşük toplam küçük kodlamayan RNA'lar veya 1.35 pg miRNA'lar kullanarak tekrarlar arasında sEV-miRNA profillerinin yüksek oranda tekrarlanabilir ve hassas bir şekilde tespit edilmesine izin verdiğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), menşe hücrelerinden miras kalan ve moleküler yüklerini sağlam bir şekilde koruyan bir fosfolipid çift katmanlı zarla sarılmış nano boyutlu (~ 30-200 nm çapında) hücre türevli parçacıklardır 1,2. Hemen hemen tüm hücrelerin sEV'leri ürettiği ve hücreler arası bölmeye saldığı iyi kabul edilmektedir, bu da çoğu biyosıvıda (yani kan, idrar, tükürük, vb.) tespit edilebilir2,3,4. Son çalışmalar, kararlı bir şekilde kapsüllenmiş moleküler kargoların (yani DNA, RNA, proteinler, lipitler, vb.)5,6,7 sEV'lerin, bir kez temas halinde veya alıcı hücrelere iletildiğinde, hücreler arası iletişime aracılık ettiğini göstermiştir 8. Mevcut araştırma çabaları, bu moleküler kargoları hassas bir şekilde tanımlamak ve izlemek için çeşitli biyosıvılardan hücreye özgü sEV'lerin izolasyonunu geliştirmeye odaklanmıştır 9,10. sEV'lerin küçük kodlamayan RNA'lar ve özellikle hücresel iletim üzerine düzenleyici işlevlerini koruyan mikroRNA'lar (miRNA'lar) içerdiği göz önüne alındığında, birçok çalışma, miRNA'ların köken hücrelerinin durumunu ortaya çıkarabilen biyobelirteçler olarak faydasını değerlendirmeye odaklanmıştır 11,12,13.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), boyutları 19 ila 25 nükleotid (nt) arasında değişen, mRNA hedeflerinin 3' çevrilmemiş bölgelerindeki kusurlu tamamlayıcı bölgelere bağlanan ve bozunmalarını ve/veya transkripsiyon sonrası baskılanmalarını yönlendiren küçük kodlamayan RNA'ların büyük bir sınıfını (insanlarda bilinen ~ 2.000) temsil eder14,15. İşlevsel olarak, miRNA'ların birçok biyolojik süreci kontrol ettiği tanımlanmıştır ve ekspresyonlarının kuralsızlaştırılması, kanser de dahil olmak üzere hastalıkların başlamasına ve gelişmesine katkıda bulunan moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik süreçlerdeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir 16,17,18. Daha da önemlisi, çalışmalar, hastalıklı hücrelerin ve özellikle kanser hücrelerinin, normal hücrelere18 kıyasla miRNA'ları yalnızca farklı şekilde eksprese etmekle kalmayıp, aynı zamanda sEV'lere paketlenmelerinin de farklı olduğunugöstermiştir 19,20.

Birçok çalışma, normal ve hastalıklı hücrelerde sEV'lerin paketlenmesini yönlendiren moleküler süreçleri ve yolakları oluşturmaya odaklanırken, 19,21,22, biyobelirteç çalışmaları şu anda sEV'ler aracılığıyla belirli hastalıklı/kanser hücreleri tarafından paketlenen ve salgılanan ayırt edilebilir küçük kodlamayan RNA ve/veya miRNA imzalarını tanımlamaya odaklanmaktadır. Hastalıklı hücreye özgü sEV'lerin çeşitli insan biyosıvılarından hedefli izolasyonu ve bunların multi-omik moleküler yüklerinin değerlendirilmesi, böylece çeşitli insan hastalıklarının ve kanserlerinin invaziv olmayan tespiti için tanısal ve prognostik testlerin geliştirilmesini sağlayabilir 23,24,25,26. sEV-miRNA'lar en çok çalışılan kodlamayan transkriptler olmasına rağmen, diğer küçük kodlamayan RNA türleri (yani, miRNA izoformları (izomiR'ler), piwiRNA'lar, transfer RNA fragmanı (tRF'ler), rRNA'lar, yetim kodlamayan RNA'lar (oncRNA'lar)...) ayrıca, farklı kanserlerin saptanmasına özel vurgu yapılarak, dolaşımdaki sEV-biyobelirteçleri olarak potansiyel yararlılıkları açısından değerlendirilmektedir 27,28,29,30,31,32.

Avantajlı bir şekilde, kodlamayan küçük RNA transkriptlerinin (miRNA'lar dahil) yeni nesil dizileme (NGS) analizi, barkodlamalarını ve cDNA kütüphanesinin hazırlanmasını takiben, dolaşımdaki sEV'lerde bulunan ve hastalıklarla ilişkili olabilecek bilinen ve/veya bilinmeyen küçük kodlamayan RNA türlerinin araştırılması için idealdir27. Gerçekten de, sEV küçük RNA NGS, hedefe özgü teknolojilerle (yani, multipleks PCR, mikrodiziler, özelleştirilmiş paneller, vb.) küresel olarak değerlendirilirse, aksi takdirde bilinmeyen, hücreye özgü küçük kodlamayan RNA transkriptlerinin keşfi için yüksek verimli bir yaklaşım sağlar. 32,33,34. Yüksek derecede bozulmuş ve düşük konsantrasyonlu formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) RNA'ların35,36 analizi için geliştirdiğimiz ultra hassas, yüksek oranda tekrarlanabilir bir cDNA kütüphanesi hazırlama protokolünü daha önce optimize ettiğimizi göz önünde bulundurarak, bunu sEV'ler 37,38,39,40 içinde kapsüllenmiş küçük kodlamayan RNA'ların ve miRNA'ların analizi için uyarlamaya çalıştık.

Bize sEV kargolarının37,40 yıllarca yüksek kaliteli tek uçlu çift indeksli miRNA analizini sağlayan Illumina HiSeq2500 cihazının durdurulmasıyla, şu anda eşleştirilmiş uçlu çift indeksli kimya kullanılarak güncellenmiş dizileme cihazlarına uyarlandığında protokolümüzün tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini keşfetmeye çalıştık. Orijinal protokolün çoğullama yeteneklerini korumak amacıyla, küçük RNA cDNA transkriptlerinin hazırlanması için mevcut 16 barkodu, bunları eşleştirilmiş uçlu çift indeks kimyasına entegre etmeden önce koruduk. Yalnızca bir çift i5 ve i7 barkod kullanarak, 16 adede kadar ayrı numunenin aynı anda işlenmesinin ve analizinin, düşük girdili sEV RNA'nın analitik tekrarlanabilirliğini iyileştirdiği sağlam bir laboratuvar tabanlı cDNA kitaplığının hazırlanmasını sağlıyoruz. Bu nedenle, insan plazma sEV'lerinden izole edilen ultra düşük miktarlarda miRNA kullanarak yüksek oranda tekrarlanabilir cDNA kütüphaneleri oluşturmak için gerekli biyokimyasal süreçleri, güncellenmiş barkodları, PCR ve boyut işaretleyici primerleri ve izolasyon adımlarını sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tüm reaktifler ve oligonükleotidler aşağıdaki gibi hazırlanır:

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm nükleotidler, bu protokolü uygulamak için kullanılan konsantrasyonlarda Şekil 1 ve Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Primer dizileri için Ek Dosya 2'ye bakın.

  1. Her bir ligasyonda farklı enzimatik reaksiyonlar için bir kontrol olarak kullanılacak bir kalibratör kokteyli stok çözeltisi hazırlayın:
    1. Taşıyıcı oligonükleotidi (0.5 μM) (Ek Dosya 1) RNaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin.
    2. 10 μM'lik bir stoğa ulaşmak için 10 kalibratörü (her biri 10 μL, Ek Dosya 1) tek bir 1,5 mL'lik tüpte birleştirin, 0,0052 nM çözeltisine ulaşmak için taşıyıcı oligonükleotid kullanarak seyreltin ve -20 °C'de saklayın.
  2. 17 benzersiz (16 deneysel ve 1 test barkodlu adaptör) adenillenmiş 3' adaptörün (Şekil 1A) her birini 50 μM konsantrasyonda nükleaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin.
    NOT: Her adaptör, daha büyük stoğun donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de 2 yıla kadar saklanmak üzere 2,5 μL içeren ayrı tüplere ayrılır.
  3. RNA ekstraksiyon taşıyıcısı (Ek Dosya 1), RNA 3'-ligasyon taşıyıcısı (Ek Dosya 1), RNA ligasyon testi (Ek Dosya 1) ve 3' ligasyonu (Ek Dosya 1; 19 nt-3' adaptör ve 24 nt-3'adaptör) ve 5' ligasyonu (Ek Dosya 1; 5'adaptör-19 nt-3'adaptör ve 5'adaptör-24 nt-3'adaptör) DNA boyut belirteçleri dahil olmak üzere farklı deneysel RNA oligonükleotidlerini 250 ng/μL'ye yeniden süspanse edin.
  4. HPLC ile saflaştırılmış 5' adaptörü nükleaz içermeyen su ile 100 μM'ye seyreltin (Şekil 1A).
  5. RT ve ilk PCR 5' ve 3' RT/PCR primerlerini nükleaz içermeyen su ile 100 μM'ye yeniden süspanse edin (Şekil 1B).
  6. İkinci PCR 5' ve 3' PCR i7 ve i5 oligonükleotidlerini nükleaz içermeyen su ile 100 μM'ye yeniden süspanse edin (Şekil 1B).
    NOT: Her bir DNA primerini 10 deneye kadar ayırın ve -80 ° C'de saklayın.
  7. PoliAkrilamid denAturing (PAA) jel yükleme boyası hazırlayın, karıştırın ve 1 mL'yi tüplere alın ve -80 °C'de saklayın.
    1. 50 mL nükleaz içermeyen suya 18,6 g Na 2 H2 EDTA ekleyerek 0,5 M Na2H2 EDTA'lık bir çözelti hazırlayın. 8.0 pH'a ulaşmak için hazırlanan Na2H2 EDTA çözeltisine NaOH peletlerini yavaşça ekleyin. 0,5 M Na 2H 2EDTA (pH 8.0) stok çözeltisi elde etmek için ddH2O kullanarak hacmi 100 mL'ye kadar tamamlayın
    2. 15 mg Bromofenol Mavisini 15 mL'lik bir tüpe tartın, tozu 600 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin, 14.25 mL deiyonize formamid ekleyin. Son olarak, 150 μL 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 çözeltisi ekleyin. Son PAA çözeltisini 1 mL'lik tüplere alın ve -80 °C'de saklayın.
    3. 5x agaroz jel yükleme boyasını hazırlayın.
      1. 1.86 gNa2H2-EDTA'yı 50 mL RNaz içermeyen suda tartın ve çözün ve NaOH peletleri ekleyerek pH'ı 8.0'a ayarlayın. 50 mM Na2H2 EDTA çözeltisi elde etmek için 100 mL'ye RNaz içermeyen su ekleyin.
      2. 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA'ya 20 mg Bromofenol Mavisi, 20 mg Ksilen Siyanol FF ve 2 g Ficoll tip-400 ekleyin. Karıştırmak için üç boyayı içeren tüpü girdaplayın ve 5 mL daha 50 mM Na2H2 EDTA ekleyin. Bireysel 1 mL tüpler 5x agaroz jel yükleme boyası ve -80 ° C'de saklayın.

2. EV RNA örneklerinin hazırlanması

  1. sEV'lerin izolasyonunu takiben, transmisyon elektron mikroskobu (TEM; Şekil 2), Nanopartikül İzleme Analizi (NTA; Şekil 3) ve süper çözünürlüklü nanogörüntüleme (Şekil 4) veya eşdeğer sEV miktar tayin teknolojisi kullanılarak yüzey proteini dağılımı.
  2. Farklı tüplerde eşdeğer sayıda sEV ekleyin, RNase-A (12.5 μg/mL) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  3. Küçük RNA ekstraksiyon kitini kullanarak miRNA'lar da dahil olmak üzere kodlamayan küçük RNA'ların sEV'lerden ekstraksiyonunu başlatın ve RNA faz izolasyonunu başlatın.
  4. RNA lizis tamponunun alt sulu fazını ayırın, yeni bir tüpe ekleyin ve ardından üreticinin talimatlarını izleyerek kolon izolasyonu gerçekleştirmeden önce her RNA örneğine 4 ng RNA taşıyıcı oligonükleotid (Ek Dosya 1) ekleyin.
  5. cDNA kütüphanesi hazırlama protokolünü başlatmak için her bir RNA örneğini 9,5 μL'ye hızlı vakumlayın.

3. 16 RNA numunesi ve 1 test numunesi ile 3' barkodlu adaptörün ligasyonlarını ayarlayın

  1. 16 ayrı sEV-RNA örneğini tanımlayın, bunları 9.5 μL nükleaz içermeyen su içinde 1.5 mL silikonize mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve deneylere başlamadan en az 10 dakika önce buzun üzerine yerleştirin.
  2. Deneyden önce 10x RNA Ligaz Tamponunu (ATP olmadan) taze olarak hazırlayın.
    1. 1.5 mL silikonlu bir tüpte, 343 μL nükleaz içermeyen çift damıtılmış su (ddH2O), 500 μL 1 M Tris pH 7.5, 100 μL 1 M MgCl2, 50 μL 20 mg / mL Sığır Serum Albümini ve 7 μL 14 M 2-merkaptoetanol.
    2. Tüpü hafifçe vurarak çözeltiyi karıştırın, bir masa üstü santrifüjde oda sıcaklığında (RT) 2.000 × g'da 2 saniye santrifüjleyin ve ardından buz üzerine koyun.
      NOT: "2 sn için santrifüj" tanımlayan tüm adımların tümü, RT'de 2.000 × g'dan yüksek olmayan bir hızda bir mikrosantrifüj ile yapılır.
  3. Tüpü 0.0052 dakika boyunca buzun üzerine koyarak 10 nM kalibratör kokteylinin buzunu çözün.
  4. 40 μL 10x RNA Ligaz Tamponu, 10 μL 0.0052 nM kalibratör kokteyli ve 40 μL nükleaz içermeyen ddH2O'yubirleştirerek 1.5 mL silikonlu bir tüpte 18 reaksiyon için Ligation Master Mix'i hazırlayın.
  5. 1,5 mL'lik tüpü hafifçe vurun ve döndürün ve buzun üzerine koyun.
  6. Ayrı ayrı alıntılanmış 16 sEV RNA örneğinin her birine 4,5 μL Ligation Master Mix ekleyin ve daha önce alikote edilmiş ve 9,5 μL hacimde 100 ng RNA ligasyon testi oligonükleotidi (Ek Dosya 1) içeren test ligasyon reaksiyonu. Tüpleri tekrar buza yerleştirmeden önce karıştırmak ve döndürmek için hafifçe vurun.
  7. 16 numuneyi ve test reaksiyonunu 90 °C'de 1 dakika boyunca bir ısı bloğuna aktarın ve tekrar buza aktarın.
  8. Her tüpe 4 μL %50 PEG'yi ayrı ayrı aktarın, karıştırmak için hafifçe vurun ve tüpleri tekrar buza yerleştirmeden önce döndürün.
  9. 17 adet 3' barkodlu adaptörün (16 deneysel (# 1 ila # 16) ve test adaptörü (# 17)) her birinden 2,5 μL'lik alikotları çözün ve buzunu çözmek için buzun üzerine yerleştirin.
  10. 17 adaptörün her birinden 1 μL'sini, Ligation Master Mix (yani 16 μL) ve %4.5 PEG (yani 4.5 μL) ile sEV-RNA ve bir test örneği içeren karşılık gelen 50 numuneye aktarın.
    NOT: Tüm çözeltiler ve reaksiyonlar, malzeme kaybını önlemek için çözeltileri yukarı ve aşağı pipetlemek yerine, tüpleri hafifçe vurarak ve döndürerek karıştırılır.
  11. Seyreltilmiş T4 RNA Ligaz 2 Kesilmiş K227Q ligasyon enzimini, 10 μL enzimi 10 μL nükleaz içermeyen ddH2O ile yeni bir 1.5 mL silikonlu tüpe ekleyerek hazırlayın.
  12. 1 μL seyreltilmiş T4 RNA Ligaz 2 Kesilmiş K227Q ligasyon enzimini 17 tüpün her birine (16 deneysel ve 1 test RNA örneği) aktarın. Yukarı ve aşağı pipetlemeyin, her tüp arasında uçları değiştirmeyin, tüpleri buz üzerinde tutmayın, karıştırın, santrifüjleyin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
  13. Ligasyonları, soğuk odadaki bir buz kovasındaki bir tüp tutucusunda bir tüp tutucuda, gece boyunca 18 saate kadar taze buz üzerine ayarlayın.

4. 3' adaptör bağlı Küçük RNA'ların PAGE izolasyonu

  1. T4 RNA Ligase 2'yi devre dışı bırakmak için 17 tüpü 90 °C'de 1 dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin ve soğuması için 2 dakika buz üzerine koyun.
  2. 1 μL GlycoBlue ve 26 μL 5 M nükleaz içermeyen NaCl'yi yeni bir tüpte birleştirin ve bu Çökeltme çözeltisinin 1.2 μL'sini 17 tüpün her birine aktarın.
  3. 17 tüpün her birine 63 μL %100 etanol ekleyin, kapatın, hafifçe vurun ve tekrar buza yerleştirmeden önce 2 saniye aşağı döndürün.
  4. 16 sEV RNA tüpünün içeriğini tek bir 1.5 mL silikonlu tüpte birleştirirken, test RNA ligasyon tüpünü ayrı tutun.
  5. Karıştırmak için birleştirilmiş numuneleri 3 kez içeren tüpü ters çevirin, 2 saniye kısaca santrifüjleyin ve çökelmesi için 60 dakika buz üzerinde bekletin.
  6. Aşağıdaki gibi büyük (16 x 20 cm,2) %15 poliakrilamid (PAGE) jel hazırlayın:
    1. Silisyonlayın (yani silikon bazlı çözelti kullanarak) ve kısa ve uzun cam plakaları 0,1 cm ara parçalarla birlikte dökün.
    2. 9 mL sistem seyrelticisi, 18 mL sistem konsantresi, 3 mL sistem tamponu, 240 μL APS (%9) ve 12 μL TEMED'i 50 mL konik bir tüpte birleştirerek %15 PAGE jel karışımını hazırlayın.
    3. Çözeltiyi 30 mL'lik bir pipet kullanarak cam plakalar arasında hızlı bir şekilde aktarın. Jel polimerize olmadan önce, 14 oyuklu bir tarak (0,1 cm kalınlığında) ekleyin ve jeli RT'de 30 dakika dik olarak ayarlayın.
  7. Tüpü buzdan birleştirilmiş RNA örnekleriyle geri kazanın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin.
  8. Bu arada, tarağı nazikçe çıkararak, kuyuları bir lavabonun üzerinde bir fışkırtma şişesi ile nükleaz içermeyen H2O ile temizleyerek, kurutmadan ve %15 PAGE'yi jel aparatına kurmadan önce, hem üst hem de alt rezervuarların 0.5x Tris-Borat EDTA (TBE) çözeltisi ile doldurulduğu yer, 450 V'ta 30 dakikalık bir ön çalıştırmadan önce.
  9. Tüpü santrifüjden çıkarın (Adım 4.6) ve RNA peletini, peleti bozmadan, ucunda bir vakum sistemine bağlı 10 μL'lik filtresiz uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak dikkatlice kurulayın.
  10. 20 μL nükleaz içermeyen ddH2O'da çökeltilmiş 16 RNA ligasyonunu içeren RNA peletini yeniden süspanse edin ve 20 μL PAA jel yükleme solüsyonu ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun, 2 saniye santrifüjleyin ve buzun üzerine koyun.
  11. 0.5x TBE jel aparatını taze 0.5x TBE ile değiştirin.
  12. 20 bp RNA boyutu merdiveni olan bir tüp, iki 3'ligasyonlu kısa DNA boyutu işaretleyicisinin her birine sahip iki tüp (Ek Dosya 1) ve RNA ligasyon testi oligonükleotidini içeren bir tüp (yani, Barkodlu adaptör #17 ile bağlanmış) ayarlayın.
  13. Tüplerin her birine (yani, merdiven, 3' ligasyon kısa DNA oligoları ve RNA ligasyon testi), 20 μL PAA jel yükleme çözeltisi ekleyin.
  14. 16 ligasyonlu RNA numune tüpünü ve 1 RNA ligasyon test tüpünü 90 °C'de 1 dakika bekletin ve tekrar buzun üzerine koyun.
  15. Hem alt hem de üst rezervuarlardan 0.5x TBE tamponunu değiştirin (yani, yükleme sırasında kuyular arasında çapraz kontaminasyon olmaması için kuyu seviyesinin altına tampon ekleyin) ve merdiveni jelin uçlarına yükleyin, RNA test ligasyonu, 16 kombine 3' barkodlu RNA ligasyonunu içeren kuyunun her iki tarafındaki iki kısa DNA boyutu belirteci (bkz. Şekil 5).
  16. %15 PAGE jeli tüm numunelerle birlikte 90 dakika boyunca soğutulmuş koşullar altında 450 V'ta (~35 mA) çalıştırın (yani, cam plakalara hava üfleyen fanlarla).
  17. %15 PAGE'i camdan çıkarın ve SYBR Gold solüsyonu (25 mL 0,5x TBE içinde 10 μL SYBR Gold) ile hafifçe püskürtün ve karanlıkta 5 dakika eğik olarak bekletin.
  18. Jeli bir mavi ışık transilluminatörüne yerleştirin (Şekil 5) ve hem 19 nt-3' adaptörünü hem de her iki 24 nt-3' adaptör boyutu işaretleyicisini kısa DNA oligonükleotidlerini bir cetvelle hizalayın ve bağlı miRNA yapılarını içeren jelin alanını kesin (Şekil 6 , 3' ligasyonu ve sonuçta elde edilen yapıyı gösterir). Ayrı olarak, ertesi gün bir test 5' ligasyonu için de kullanılacak olan RNA test ligasyonunun üst bandını çıkarın.
  19. İki ayrı eksize edilmiş jel parçasını (yani, 16 RNA numunesi ve test ligasyonu için) 1,5 mL silikonize tüplere yerleştirilmiş farklı 0,5 mL jel kırıcı tüplere yerleştirin, RT'de 3 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin ve ardından iki set parçalanmış jel parçasını 300 μL 400 mM NaCl çözeltisi ile yeniden süspanse edin, tüpleri kapatın, ve onları parafilm ile kapatın.
  20. Tüpleri, gece boyunca (16-17 saat) 4 ° C'de 1.100 rpm'de çalkalama ile bir çalkalayıcıya yerleştirin.

5. 5' adaptörün bağlanması

  1. İki ayrı parçalanmış jeli ve çözeltilerini (16 x 3' barkodlu numune (barkodlar # 1 ila # 16) ve 3' barkodlu test RNA'sı (barkod # 17)) iki ayrı 5 μm filtre tüpüne aktarın, her biri 1.5 mL silikonlu tüplere ayarlayın, parafilm ile kapatın ve RT'de 2.300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Filtrelenen her çözeltiye 950 μL% 100 etanol ekleyin, tüpleri kapatın, karıştırmak için ters çevirin, 2 saniye aşağı döndürün, tüpleri parafilm ile kapatın ve 1 saat boyunca buza koyun.
  3. 1 mL nükleaz içermeyen suyu 1 mL DMSO ile birleştirerek %50 sulu bir DMSO stoğu hazırlayın, tüpü alüminyum folyoya sarın ve karanlıkta RT'de saklayın.
  4. %15'lik bir PAGE jeli hazırlayın ve bölüm 4.6'da açıklanan adımları izleyerek önceden çalıştırın.
  5. Bağlanmış RNA'ları çökeltmek için 3' bağlı 16 RNA örneğini ve test RNA ligasyonunu içeren tüpleri 16.000 × g'da 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin.
  6. RNA peletlerine dokunmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve vakumla kurutun.
  7. 16 RNA örneğinden oluşan 3' bağlı peleti yeniden süspanse edin ve RNA'yı her biri 8 μL nükleaz içermeyen ddH2O'da yukarı ve aşağı pipetlemeden test edin. Karıştırmak için tüpleri hafifçe vurun, RT'de 2 s (2.000 × g) santrifüjleyin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
  8. 500 μL 1 M Tris (pH 7.5), 100 μL 1 M MgCl2, 50 μL 20 mg/mL asetillenmiş BSA, 200 μL 10 mM ATP, 7 μL 2-merkaptoetanol 14 M ve 143 μL RNaz içermeyen suyu 1.5 mL'lik bir tüpe karıştırarak 10x RNA Ligaz Tamponunu (ATP ile) hazırlayın.
  9. Her tüpe 2 μL 10x RNA ligaz tamponu (yani ATP ile), 1 μL 100 μM 5' adaptör ve 4 μL %50 sulu DMSO ekleyin. Karıştırmak için hafifçe vurun, RT'de 2 saniye döndürün, ardından RNA'yı denatüre etmek için tüpü 90 °C'de 1 dakika bekletin ve tekrar buzun üzerine yerleştirin.
  10. 3 μL %50 DMSO ekleyin, karıştırmak için hafifçe vurun, pelete döndürün, her tüpe 3 μL T4 RNA Ligaz ekleyin, tüpleri hafifçe vurun, RT'de 2 saniye santrifüjleyin ve tüpleri çalkalayıcı üzerinde 75 dakika boyunca 37 ° C'ye ayarlayın.
    NOT: Yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
  11. 20 nt DNA merdivenini ve 5'-ligasyon boyutu işaretleyicisi uzun DNA oligonükleotidlerini içeren iki ayrı tüpü hazırlayın (Ek Dosya 1; 5'adaptör-19 nt-3' adaptör ve 5'adaptör-24 nt-3'adaptör) ve tüplerin her birine 20 μL PAA ekleyin.
  12. 5' adaptör ligasyonu tamamlandıktan sonra, iki ligasyonun her birine (yani 16 RNA numunesi ve test RNA'sı) 20 μL PAA ekleyin, hafifçe vurarak karıştırın, döndürün ve 1 dakika boyunca 90 ° C'ye ayarlayın, ardından tüpleri tekrar buzun üzerine yerleştirin.
  13. Jel aparatının üst ve alt rezervuarlarını boşaltın ve üst rezervuarın kuyucuklarının seviyesinin altına taze 0.5x TBE çözeltisi ekleyin.
  14. Merdiveni jelin ucuna, 5' bağlı test RNA örneğine, iki boyut işaretli uzun DNA oligonükleotidini (yani, 5' adaptör-19 nt-3' adaptör ve 5' adaptör-24 nt-3' adaptör) 5' bağlı 16 RNA örneğinin yükleneceği kuyuyu çevreleyen kuyulara yükleyin (Şekil 6 , 5' ligasyonunu ve sonuçta ortaya çıkan yapıyı gösterir). Jeli 450 voltta 90 dakika çalıştırın.
  15. Çalışma tamamlandıktan sonra, jeli aparattan ve camdan çıkarın ve bir SYBR Gold solüsyonu (yani, 25 mL 0.5x TBE'de 10 μL SYBR Gold) ile püskürtün ve 5 dakika karanlıkta bekletin.
  16. 5' adaptör-19 nt-3' adaptör ve her iki 5' adaptör-24 nt-3' adaptör boyut işaretleyicileri uzun DNA oligonükleotidlerini boyut kılavuzları olarak kullanarak, jelin 5' bağlı 16 RNA örneğini içeren bölümünü doğrudan eksize edin (Şekil 7).
    NOT: Test RNA ligasyonu, 5' adaptörün ligasyonunun boyut belirteçlerine eşdeğer boyutta bir kaymaya izin verdiğini göstermek için jel üzerinde değerlendirilir. Test RNA ligasyonu jelden eksize edilmez; sadece bağlanmış 16 kombine RNA örneği.
  17. 16 bağlı RNA örneğini içeren eksize edilmiş jel parçasını 1.5 mL'lik bir tüpe ayarlanmış 0.5 mL'lik bir jel kırıcı tüpe aktarın, RT'de 3 dakika boyunca 16.000 × g'da döndürün ve ardından 300 μL 300 mM NaCl ve 1 μL 100 μM 3' RT / PCR primeri ekleyin (Şekil 1B) tüpteki ezilmiş jel parçalarına.
  18. Tüpü parafilm ile kapatın ve soğuk bir odada gece boyunca (17-18 saat) 4 ° C'de 1.100 rpm'de çalkalanan bir çalkalayıcı üzerine ayarlayın.

6. Barkodlu 5' ve 3' bağlı küçük kodlamayan RNA'ların ve miRNA'ların ters transkripsiyonu

  1. Ezilmiş jeli içeren tüpten gelen çözeltiyi, 1.5 mL silikonize RNaz içermeyen bir tüpe yerleştirilmiş 5 μm'lik bir filtre tüpüne pipetleyin ve çözeltinin filtreden geçmesine izin vermek için kısa bir süre döndürün.
  2. Bu filtrelenmiş çözeltiye 950 μL %100 etanol ekleyin, karıştırmak için tüpü ters çevirin, 2 saniye döndürün ve 60 dakika buz üzerinde bekletin.
  3. Tüpün 1 saat boyunca 4 ° C'de 16.000 × g'da santrifüjlenmesiyle RNA peletini çökeltin.
  4. Tüpü geri kazanın, pelete dokunmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 5.6 μL nükleaz içermeyen H2O içinde yeniden süspanse etmeden önce vakumla kurutun.
  5. Tüpe 3 μL 5x ilk iplikçik tamponu, 4.2 μL 10x dNTP (her biri 2 mM'de) ve 1.5 μL Ditiyotreitol (DTT) ekleyerek RT reaksiyonunu ayarlayın. Karıştırmak için hafifçe vurun ve 2 saniye döndürün.
  6. Reaksiyonu tam olarak 30 saniye boyunca 90 ° C'de ayarlayın ve ardından tüpü 2 dakika boyunca 50 ° C'de bir bloğa aktarın.
  7. Çözeltiye 0.75 μL ters transkriptaz enzimi ekleyerek RT reaksiyonunu başlatın, karıştırmak için hafifçe vurun ve 35 dakika boyunca 50 ° C'ye ayarlayın.
  8. Enzimi ve cDNA / RNA ipliklerini denatüre etmek için tüpü 95 ° C'de 1 dakika boyunca aktarın, ardından 95 μL RNaz içermeyen H2O ekleyin, karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve 2 dakika boyunca buza koyun. Bu tüp, her biri ayrı ayrı 3' olarak barkodlanmış 16 RNA örneğinden üretilen cDNA'yı içerir.

7. Test PCR'yi ve büyük ölçekli amplifikasyonu gerçekleştirin

  1. 304 μL Nükleaz içermeyen H2O, 125 μL 2 M KCl, 50 μL 1 M Tris pH8.0, 10 μL 1 M MgCl 2, 5 μL %1 Triton X-100 ve 6 μL 1 M 2-merkaptoetanolü buz üzerinde saklanabilen bir tüpe birleştirerek taze 10x PCR tamponu hazırlayın.
  2. 67 μL Nükleaz içermeyen H2O ile 10 μL 10x PCR Tamponu, 10 μL 10x dNTP, 0.5 μL 100 μM 5' PCR primeri, 0.5 μL 100 μM 3' PCR primeri, 10 μL cDNA Stok Kitaplığı, ve 2 μL 50x Taq polimerazı taze bir PCR tüpüne.
    NOT: PCR amplifikasyonlarını gerçekleştirmeden önce, aşağıdaki gibi iki farklı dosya oluşturarak cihazı kurun: Dosya # 1 için: 45 s için 94 °C, 85 s için 50 °C ve 12 döngü için 60 s için 72 °C ve 4 °C; ve Dosya # 2 için: 45 s için 94 °C, 85 s için 50 °C ve 2 döngü için 60 s için 72 °C ve 4 °C.
  3. Pilot/test PCR reaksiyonu için, 100 μL PCR reaksiyonunu içeren PCR tüpünü Thermocycler'a yerleştirin ve Dosya #1'i çalıştırın.
  4. Dosya # 1 tamamlandıktan sonra, PCR tüpünü açın ve reaksiyonun 12 μL'sini 3 μL 5x jel yükleme boyası içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüje aktarın. Tüpü kapatın ve kapağa "12 döngü" yazın.
  5. PCR tüpünü alın, termocycler'a yerleştirin ve Dosya # 2'yi başlatın.
  6. Dosya # 2 tamamlandıktan sonra, 12 μL PCR reaksiyonunu 3 μL 5x jel Yükleme boyası içeren 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve kapağına "14 döngü" yazın.
  7. PCR amplifikasyonlarını art arda dört kez daha tekrarlayın (ör., her biri iki PCR döngüsü), her amplifikasyonun sonunda 12 μL PCR ürünü aktarırken ve sırayla 16, 18, 20 ve 22 döngü etiketli dört farklı tüp elde edin.
  8. 20 nt boyutundaki merdiveni ve PCR ile güçlendirilmiş ürünlerin her birini %2,5'lik bir agaroz üzerine yükleyin ve jeli 120 V'ta 30 dakika boyunca 0,5x TBE'de çalıştırın.
  9. Primer dimerlerinin (alt bant) ve amplifiye edilmiş cDNA'nın (üst bant) oranına ve varlığına bağlı olarak optimal PCR amplifikasyon döngüsünü (Şekil 8A) tanımlayın.
    NOT 16 numune ile toplam RNA girdisinin 1 ng'den düşük olabileceği göz önüne alındığında, primer dimerlerin saflaştırılmış cDNA'dan daha hızlı ve daha büyük miktarlarda bir ürün üretmesi beklenmektedir. Bu nedenle, yeterli PCR döngüsü genellikle 18 ila 22 döngü arasında seçilir. Şekil 8A'da, bu kitaplık için yeterli PCR döngüsü 20'dir. Şekil 8B'de, PCR yapısının boyutu detaylandırılmıştır.
  10. Yeterli PCR amplifikasyon döngüsü tanımlandıktan sonra, bir negatif PCR (cDNA yok) ve dört adet 100 μL pozitif PCR reaksiyonu (ör., her biri 12 μL cDNA içerir).
    1. PCR reaksiyonlarının hazırlanmasını basitleştirmek için, 292.5 μL nükleaz içermeyen H2O, 45 μL 10x PCR tamponu, 45 μL 10x dNTP, 3.25 μL 3' RT / PCR primeri (Şekil 1B) ve 2.25 μL 5' PCR primeri (Şekil 1B) birleştirerek 1.5 mL'lik bir tüpte bir PCR Master Karışımı (yani 4.5 reaksiyon için) ayarlayın. Karıştırmak için bu tüpü ters çevirin ve tüpün dibinde toplamak için döndürün.
    2. 86 μL PCR Master Mix'i dört adet 0.5 mL PCR tüpünün her birine aktarın.
    3. 4 PCR tüpünün her birine 12 μL cDNA Kütüphanesi (buz üzerinde saklanmış), ardından 2 μL 50x titanyum Taq polimeraz ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    4. 77 μL nükleaz içermeyen H2O, 10 μL 10x PCR tamponu, 10 μL 10x dNTP, 0.5 μL 5' PCR primeri, 0.5 μL 3' PCR primeri ve 2 μL 50x Taq polimeraz ekleyerek şablonsuz PCR reaksiyon tüpünü hazırlayın ayrı bir PCR tüpüne ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleme.
    5. Adım 7.9'da tanımlanan PCR döngüsünü kullanarak PCR tüplerini termosiklerde ayarlayın ve gerektiği gibi yükseltmek için termosiklerde yeni bir program ayarlayın.
  11. 0.5x TBE ve etidyum bromür içeren% 2.5'lik bir agaroz jeli hazırlayın ve her bir PCR tüpünden 12 μL'yi 3 μL 5x jel yükleme boyası içeren ayrı tüplere aktarın.
  12. 3 μL merdiveni 9 μL nükleaz içermeyen H2O ve 3 μL jel yükleme boyası ile birleştirerek 20 nt merdiveni hazırlayın.
  13. Jeli yükleyin, 120 V'ta 30 dakika çalıştırın ve PCR amplifikasyonunun dört farklı reaksiyon arasında benzer olduğunu ve şablonsuz kontrolün boş olduğunu doğrulayın (Şekil 8C).
  14. İki 1.5 mL silikonize mikrosantrifüj tüpü (yani, her biri 90 μL ürün içeren iki tüp) arasındaki dört PCR reaksiyonunu birleştirin ve iki tüpün her birine 18 μL 5 M NaCl ve 800 μL %100 etanol ekleyin.
    1. Tüpleri karıştırmak için ters çevirin ve gece boyunca çökelmesi için -20 °C'de saklayın.

8. PCR ile güçlendirilmiş Kütüphanenin Saflaştırılması

  1. Karışık pozitif PCR reaksiyonlarını içeren iki tüpü 16.000 × g'da 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin.
  2. 60 dakika sonra, süpernatanı çıkarın, DNA peletlerini vakumla kurutun ve 19.5 μL 1x tampon içinde yeniden süspanse edin ve ardından 0.5 μL PmeI enzimi ekleyin.
  3. Bitişik oyuklarda (yani, 19 nt-3' adaptör, 24 nt-3' adaptör) veya RNA taşıyıcılarında (yani, RNA ekstraksiyon taşıyıcısı, RNA post-3' ligasyon taşıyıcısı) çalışan DNA boyutu belirteçlerinden herhangi birini çıkarmak için PmeI sindirimlerini 2 saat boyunca 37 °C'de ayarlayın potansiyel kirleticiler (yani, Ek Dosya 1'deki RNA ve DNA primerlerinde bulunan PmeI bölgelerine bakın)
  4. Tek bir kuyucukta fazla miktarda primer dimer birikmesini ve bir leke oluşturmasını önlemek için iki digest'i 0,5x TBE kullanarak %2,5'lik bir agaroz jelin üç farklı kuyucuğunda çalıştırın.
    1. Sindirimin her birine 3 μL 5x jel yükleme boyası ekleyin, iki sindirimi birleştirin ve ardından 16.5 μL'yi üç ayrı bitişik oyuğa yükleyin.
    2. 20 nt DNA boyutundaki merdiveni jelin uç kuyucuklarına yükleyin ve jeli 150 V'ta 90 dakika boyunca çalıştırın (Şekil 8D).
  5. DNA kütüphanelerini saflaştırmak için, üst PCR bantlarını jelin üç bitişik şeridinden çıkarın ve bunları 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak PCR amplifiye kitaplığını saflaştırın ve üreticinin talimatlarını izleyerek saflaştırılmış DNA ürününü bir florometre kullanarak nicelleştirin.

9. Sıralayıcı ile uyumlu barkodlar eklemek için son PCR amplifikasyonu

  1. Adım 7.1'de açıklandığı gibi yeni bir 10x PCR tampon karışımı hazırlayın.
  2. Üç tüpün her birinde ilk PCR amplifikasyonundan saflaştırılmış 0.75 ng PCR ürünü kullanarak bir negatif kontrol (amplikon yok) ve üç PCR reaksiyonu dahil ederek PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın:
    1. 75 μL ddH2O, 10 μL 10x PCR tamponu, 10 μL 10x dNTP, 1 μL 5' 2nd PCR primer (yani, primer i503 (Şekil 1B)), 1 μL 3' PCR 2. primer (yani, primer i702 (Şekil 1B)), 1 μL PCR ürünü (örn., Jel ile saflaştırılmış 1. PCR ürününden 0.75 ng) ve 2 μL Titanyum Taq Polimeraz.
    2. 76 μL ddH2O, 10 μL 10x PCR tamponu, 10 μL 10x dNTP, 1 μL 5' 2nd PCR primer (yani, primer i503 (Şekil 1B)), 1 μL 3' PCR 2. primer (yani, primer i702 (Şekil 1B)), ve 2 μL Taq Polimeraz.
    3. Dört PCR reaksiyonunu (yani, bir negatif kontrol, üç pozitif) aşağıdaki gibi programlanmış bir termodöngüleyicide ayarlayın: 3 dakika boyunca 72 °C, 30 saniye boyunca 95 °C ve 10 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye için 55 °C, 9 döngü için 30 saniye için 72 °C ve ardından 5 dakika boyunca 72 °C ve 10 °C'de son bir tutma.
  3. PCR döngüleri tamamlandıktan sonra, reaksiyon karışımından 10 μL alın ve 3 μL yükleme boyası ekleyin ve ürünleri, 20 nt merdiveni ile birlikte Şekil 9A'da gösterildiği gibi% 2.5'lik bir agaroz jeli üzerinde değerlendirin.
  4. PCR ürününün boyutunun (yani, boyut ve nihai yapıyla ilgili ayrıntılar için Şekil 9B ve Şekil 6'da gösterildiği gibi 164 bp'de çalışan üst PCR bandı) ve bant dağılımının doğrulanması üzerine, PCR ürünlerini her 135 μL PCR ürününe (yani 90 μL + 45 μL), 13.5 μL 5 M NaCl ekleyerek iki tüpte birleştirin, ve 650 μL% 100 etanol ve gece boyunca -20 ° C'de çökeltin.
  5. Ertesi gün, iki PCR tüpünü 16.000 × g'da 4 °C'de 60 dakika boyunca döndürün.
  6. Her bir peleti kurutun, 19.5 μL 1x PmeI tamponu ile yeniden süspanse edin ve bitişik kuyucuklarda (yani, 19 nt-3' adaptör, 24 nt-3'adaptör) veya RNA taşıyıcılarında (yani, RNA ekstraksiyon taşıyıcısı, RNA post-3' ligasyon taşıyıcısı) kirleticilerde çalışan boyut belirteçlerinden herhangi birini daha da ortadan kaldırmak için bir çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 2 saat boyunca 0.5 μL PmeI ekleyin.
  7. Sindirilmiş ürünleri% 2.5'lik bir agaroz jelin üç oyuğuna yerleştirin ve 150 V'ta 90 dakika boyunca ayırın.
  8. 164 bp'de çalışan üst bandı çıkarın (Şekil 9C) ve DNA ürününü bir DNA izolasyon kiti kullanarak saflaştırın ve bir florometre ile nicelleştirin.
  9. Bir sıralayıcı kullanarak seyreltme ve analizden önce kitaplığın boyutunu, konsantrasyonunu ve saflığını doğrulamak için nihai PCR ürününü bir DNA çipi üzerinde çalıştırın.
  10. Daha önce açıklandığı gibi, miRNA analizlerinden önce adaptör kırpma, çoğullama çözme, insan genomuna hizalama için FASTQ veri dosyasını RNAworld boru hattına aktarın41. Alternatif olarak, Ek Dosya 3'te sunulan Komut Dosyasını kullanarak, FASTQ dosyasındaki okumaları çoğullamayı çözün ve tercih edilen küçük RNA analitik işlem hattını kullanarak daha fazla işlem yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokolde detaylandırıldığı gibi, 3' barkodlamadan geçtikten sonra tek bir kütüphane içinde birlikte analiz edilen 16 ayrı küçük hücre dışı vezikül (sEV) RNA örneğinin (yani, kodlamayan küçük RNA'ların ve miRNA'ların analizi için) aynı anda işlenmesini açıklıyoruz. Analizlerimiz için seçilen sEV'ler, Jersey Shore Üniversitesi Tıp Merkezi'nde (IRB # Pro2018-0425) üçlü negatif meme kanseri teşhisi konan kadınlardan toplanan 45 mL plazmadan daha önce tarif edildiği gibi 37,40

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücre dışı veziküllerden (sEV'ler) verimli bir şekilde izole edilen mikroRNA'lar (miRNA'lar) dahil olmak üzere kodlamayan RNA'ların tekrarlanabilir ve hassas yeni nesil dizilimi (NGS) için bir cDNA kütüphanesi hazırlama protokolü geliştirdik. Sınırlı miktarda küçük kodlamayan RNA'ların ve miRNA'ların küresel olarak veya seçici olarak izole edilmiş sEV'lerden geri kazanılabileceğini göz önünde bulundurarak, sEV'lerin miRNA yüklerinin tekrarlanabilir ve hassas analizini sağlayan cDNA...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OL, şirkette küçük bir öz sermaye yüzdesine sahip EValuate Diagnostics, Inc.'in işsiz bir kurucusudur. Diğer yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Thomas Tuschl'un laboratuvarına destekleri ve laboratuvarlarında geliştirilen orijinal teknolojiye erişim sağladıkları ve bize RNAworld boru hattına erişim sağladıkları için teşekkür etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 1 Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTP'ler AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MerkaptoetanolSigmaO3445I-100 
20 nt merdiven Jena BioscienceM-232S
20 mg / mL Sığır Serumu AlbüminSigmaB8894-5ML (nbsp);
50x Titanyum Tak Clontech Laboratuvarları 
Amonyum PersülfatFisher Scientific 7727-54-0
Mavi ışık aydınlatıcı- Güvenli Görüntüleyici 2.0 ThermofisherG6600
BRL Cam plakalı ve taraklı Dikey Jel Elektroforez SistemiGIBCOV16
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf mikrosantrifüj 5424RABD bilimsel4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerABD bilimsel4053-8223Q
Filtre tüpü ile 5mm filtreIST Mühendislik A.Ş.5388-50
Fisherbrand Silikonize Düşük Retansiyonlu Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mLFisher Scientific02-681-320
Jel Kırıcı Tüp 0.5 mLIST Mühendislik A.Ş.3388-100
Jel elektroforez cihazı 7 cm x 10 cm- Jel tepsileri ve tarakları ile Mini-sub Cell GTBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequencer Illumina20047256
Jersey-Cote (Silikon bazlı çözüm)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge çift rotorlu kişisel santrifüjABD bilimsel2641-0016
Model V16 poliakrilamid jel elektroforez cihazı, camlar, taraklar ve ara parçalarCiore Yaşam Bilimleri21070010
OligonükleotidlerIDTSipariş sırasında
Owl EasyCast B2 mini elektroforez sistemi - jel tepsileri ve tarakları ileThermofisher ScientificB2
Qiaquick Jel Ekstraksiyon kiti Qiagen28704
Qubit FlorometreThermofisher ScientificQ33238
Kısıtlama enzimi PmeI ve 10x Cut Akıllı TamponNEBR0560S
Ters transkriptaz- Superscript IIIThermoFisher12574026
RNaz içermeyen su AmbionAM9932
Çalkalayıcı- Eppendorf TermomikserEppendorf5385000024
SeaKem LE agaroz Lonza50002
Superscript III ters transkripsiyon kiti Invitrogen18080-044
SYBR AltınYaşam Teknolojileri S11494
Titanyum Taq PolimerazTakara639208
T4 RNA Ligaz 1 NEBM0204S
T4 RNA Ligaz 2 Kesik K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Isıtmalı Kapaklı ThemocyclerUygulanan Biyosistem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel sistemi konsantre, seyreltici ve tamponUlusal TeşhisEC-833
639208tanımlandı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MikroRNA DizilemesEV miRNA ProfillemeRNA Barkodlamaift ndeksli DizilemeD k Girdi RNADola an Biyobelirte lerH creleraras leti im
Video yakında

İlgili makaleler