Yöntem makalesi

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 Aralık 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serebellar Purkinje hücreleri (PC'ler), DNA hasar yanıtındaki eksikliklere karşı özellikle hassastır. SEREBELLAR organotipik kültürler içinde proteine bağlı poli (ADP-riboz) zincirlerinin boyanmasını içeren, DNA hasarına PC yanıtının dinamiklerinin görsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serebellar Purkinje hücreleri (PC'ler), yüksek metabolik hızlar, spesifik kromatin mimarisi ve kapsamlı transkripsiyonel aktivitenin benzersiz bir etkileşimini sergiler ve bu da onları DNA hasarına karşı özellikle savunmasız hale getirir. Bu, genellikle PC disfonksiyonu veya kaybı ile başlatılan serebellar dejenerasyonu önlemek için etkili bir DNA hasar yanıtı (DDR) gerektirir. Dikkate değer bir örnek, ilerleyici PC tükenmesi ve serebellar bozulma ile işaretlenmiş genom instabilite sendromu, ataksi-telenjiektazi (A-T)'dir. PC'lerde DDR mekanizmalarının araştırılması, bu tür bozukluklarda dejenerasyonlarına yol açan yolakların aydınlatılması için hayati önem taşır. Bununla birlikte, PC'leri in vitro olarak izole etmenin ve yetiştirmenin karmaşıklığı, araştırma çabalarını uzun süredir engellemektedir. Murin serebellar organotipik (dilim) kültürleri, in vivo doku ortamını yakından taklit eden uygun bir alternatif sunar. Ancak bu model, mikroskobik görüntülemeye uygun DDR göstergeleri ile sınırlıdır. Hızlı ve erken bir DDR göstergesi olan proteine bağlı poli (ADP-riboz) (PAR) zincirlerinin floresan görüntülemesinin, genotoksik strese yanıt olarak bu kültürlerdeki PC'lerde DDR dinamiklerini etkili bir şekilde ortaya çıkardığını gösteren organotipik kültür protokolünü geliştirdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel DNA'nın bütünlüğü, günlük hücre başına on binlerce DNA lezyonuna neden olan, ağırlıklı olarak reaktif oksijen türleri gibi metabolik yan ürünler olmak üzere, DNA'ya zarar veren ajanlar tarafından sürekli tehdit altındadır1. Genom stabilitesinin kalıcı olarak sürdürülmesi, hücresel homeostaz 2,3 için gereklidir. Bu bakımın temel taşı, diğer birçok hücresel süreci dikkatlice ayarlarken belirli DNA onarım yollarını başlatan karmaşık, katmanlı bir sinyal ağı olan DNA hasar tepkisidir (DDR) 4,5. DDR'deki eksiklikler genellikle kromozomal instabilite, ilerleyici doku bozulması, bozulmuş büyüme veya gelişme, kansere yatkınlık ve belirli DNA'ya zarar veren ajanlara karşı artan duyarlılık ile işaretlenmiş 'genom instabilite sendromları' olarak kendini gösterir 6,7,8,9. Özellikle, sıklıkla serebellar atrofiyi içeren nörodejenerasyon, birçok genom instabilite sendromunun belirgin bir özelliğidir 7,10,11,12.

Otozomal resesif bozukluk, ataksi-telenjiektazi (AT), genom instabilitesi bozukluğunun iyi belgelenmiş bir örneğidir 13,14,15. Bu durum, DNA çift iplikli kopmalara (DSB'ler) yanıt olarak esas olarak bir DDR mobilizörü olarak bilinen önemli protein kinaz, ATM'yi kodlamaktan sorumlu olan ATM (AT, mutasyona uğramış) genindeki boş mutasyonlardan kaynaklanır16,17. A-T, ağırlıklı olarak ilerleyici serebellar dejenerasyon ile karakterize, akut motor bozukluklara, immün yetmezliğe, gonadal atrofiye, kansere yatkınlığa ve iyonlaştırıcı radyasyona aşırı duyarlılığa yol açan multisistem bir bozukluk olarak kendini gösterir. A-T'li bireylerden alınan kültürlenmiş hücreler, kromozomal instabilite ve genotoksik ajanlara, özellikle DSB'lere neden olanlara karşı artan duyarlılık gösterir 15,18,19. Daha da önemlisi, ATM diğer DNA lezyonlarının onarımında da rol oynar ve genom stabilitesinin korunmasındaki geniş önemini vurgular20,21,22.

ATM'nin sayısız rolü üzerine yapılan kapsamlı araştırmalara rağmen, A-T'de serebellar dejenerasyona yol açan spesifik mekanizma, bu süreci aydınlatmak için önerilen çeşitli modellerle aktif bir tartışma konusu olmaya devam etmektedir 23,24,25,26,27,28,29,30. Modelimiz28, A-T hastalarında serebellar dejenerasyonun Purkinje hücrelerinin (PC'ler) disfonksiyonu ve nihayetinde kaybı ile başladığını göstermektedir. ATM'nin devam eden DNA hasarı karşısında genom stabilitesini korumadaki kritik rolü göz önüne alındığında, PC'ler ATM'nin yokluğuna karşı özellikle savunmasızdır. Bu güvenlik açığını, yüksek metabolik aktiviteleri, ayırt edici kromatin yapıları ve kapsamlı transkripsiyonel aktivitelerinin kombinasyonuna bağlıyoruz. Sonuç olarak, PC fonksiyonunun kaybının ve dolayısıyla dejenerasyonunun, kusurlu transkriptlerin üretilmesinin bir sonucu olarak genlerin stokastik, fonksiyonel inaktivasyonundan kaynaklandığı öne sürülmektedir28.

Laboratuvarda PC biyolojisinin incelenmesi, izole edilmiş PC'lerin yetiştirilmesindeki zorluklar tarafından engellenmektedir, çünkü bu hücreler hayatta kalmak ve işlev görmek için büyük ölçüde doğal ortamlarına ve komşu hücrelere güvenir ve bu da onları ayrışmış kültür büyümesi ile uyumsuz hale getirir. Bununla birlikte, PC'ler doku dilimi kültürlerinde uzun süre canlı kalabilir. Tipik olarak kemirgen serebellasından türetilen doku dilimleri olan serebellar organotipik kültürler, dokunun yapısal organizasyonunu korur ve kültürlenmiş hücrelerle mümkün olanlara benzer çeşitli deneysel manipülasyonları destekler. Bu nedenle, bu kültürler kontrollü bir ortamda serebellar çalışmalara izin verir 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Spesifik olarak, A-T bağlamında, murin serebellar organotipik kültürlerin Atm eksikliği olan PC'lerde DDR'yi araştırmada etkili olduğu kanıtlanmıştır 40,41,42,43. Atm eksikliği olan fareler, muhtemelen insan ve fare serebellar fizyolojisi arasındaki farklılıklar nedeniyle, yalnızca ince bir serebellar fenotip 44,45,46,47 sergilerken, ATM'nin rollerinin bu türler arasında büyük ölçüde korunduğu varsayımı vardır. Bu fikir, Atm-/- murin PC'lerinde DNA DSB'lerine verilen yetersiz yanıtın, diğer murin ve insan ATM/Atm eksikliği olan hücre tiplerinde gözlemlenenle uyumlu olduğuna dair gözlemlerimizle desteklenmektedir 40,41,42,43.

Organotipik kültürlerdeki çeşitli uyaranlara veya streslere verilen PC yanıtlarının analizinde bir sınırlama, okumalar için mikroskobik görüntülemeye güvenme gerekliliğidir. DDR genellikle toplu biyokimyasal okumalar kullanılarak incelenir, ancak DSB'lerin48,49 göstergeleri olarak kabul edilen fosforile histon H2AX (γH2AX) ve 53BP1 proteininin nükleer odaklarının oluşum ve çözünürlük dinamiklerini takip etmek gibi yaygın immünofloresan belirteçler de kullanılır. Daha geniş bir ölçüm, proteinler üzerinde poli(ADP-riboz) (PAR) zincir oluşumunun floresan görüntülemesi, özellikle iplik kırılmalarınahızlı ve sağlam bir erken DNA hasarı tepkisidir 7,50. Serebellar organotipik kültürlerde PAR boyaması için Komulainen ve ark.51 tarafından protokolü modifiye ettik. PC'lerin büyük çekirdeklerinde belirgin bir PAR yanıtı gözlemledik. Burada, murin serebellar organotipik kültürler oluşturmak ve genotoksik stres altında PAR yanıtını görselleştirmek için rafine edilmiş protokolümüz sunulmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malzeme, ekipman ve antikorların ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Hayvan prosedürleri, onaylandıktan sonra Tel Aviv Üniversitesi Etik Komitesi'nin etik yönergeleri altında uygulandı. İşlem, cinsiyetlerine bakılmaksızın 10 günlük fare yavruları üzerinde gerçekleştirilir. İhtiyaç duyulması halinde bir önceki gün kuyruk biyopsisi ve standart yöntemler kullanılarak genotipleme yapılır. Çözeltiler sterildir ve aksi belirtilmedikçe 4 ° C'de saklanır; Tablo 1'e bakınız.

1. Kültürlerin hazırlanması

NOT: Prosedürü steril bir ortamda gerçekleştirin ve çalışma yüzeyini önceden %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.

  1. 6 oyuklu plakaların her birine 1 mL BME ekleyin. Steril forseps kullanarak, her bir oyuğa tek bir hücre kültürü eki yerleştirin ve plakaları diseksiyon prosedüründen en az 2 saat önce 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
  2. Biyolojik bir başlık içinde doku kıyıcı, 30 mm kültür plakaları, bir binoküler mikroskop ve bir ışık kaynağı içeren bir diseksiyon alanı oluşturun.
  3. İşlem boyunca cerrahi aletleri %70 etanole batırın. Daldırma için %70 etanol ile doldurulmuş bir idrar kabı ve kullanmadan önce etanolü yıkamak için 1x PBS'li ayrı bir idrar kabı kullanın.
  4. Her diseksiyon için (yani her beyincik için), soğuk diseksiyon ortamı ile doldurulmuş iki adet 30 mm kültür plakası hazırlayın ve bunları buz üzerinde bırakın.
  5. Hayvana% 70 etanol püskürtün.
  6. Keskin bir makas kullanarak hayvanın kafasını hızla kesin. Beyni ortaya çıkarmak için, beyincikten uzakta makasla küçük bir kesi yapın. Yuvarlak uçlu cımbız kullanarak kafatasını nazikçe soyun. Serebellar dokuya zarar vermemek için kafatasını küçük parçalar halinde çıkarın.
  7. Beyni hemen soğuk diseksiyon ortamına aktarın veya beyinciği doğrudan kafatasının içinden çıkarın. Bunu yapmak için, beyinciği açığa çıkarın ve ince kavisli bir iris spatula kullanarak üç çift pedinkülün bağlantısını keserek serebellar korteksi beyin sapından ayırın. Pedinkülleri tanımlamak için, rostraldan kaudal doğruya bakın: eşleştirilmiş üst serebellar pedinküller, orta beyni serebellumun her iki tarafına bağlar; eşleştirilmiş orta serebellar pedinküller, ponsu serebellumun her iki tarafına bağlar; ve eşleştirilmiş inferior serebellar pedinküller, serebellumun her iki tarafına medullaya bağlanır. Beyincik göründüğünde, aynı spatulayı kullanarak onu beyinden ayırın: spatulayı beyincik, superior colliculus ve beyin sapı arasında kaydırın.
    NOT: Beyincik dilimlendikten sonra kolayca ayrıldıkları için meninksleri çıkarmak için özel bir çaba sarf etmeyin.
  8. Doku doğrayıcıyı 350 μm'lik bir dilim kalınlığına ayarlayın.
  9. Beyinciğı doğrayıcının tabanına yerleştirmeden önce, dokudaki fazla diseksiyon tamponunu çıkarın. Bu, dokunun doğrayıcının tabanına yapışmasını artıracaktır.
  10. Beyincik'i kesme platformuna dikey yönde yerleştirin ve 350 μm'lik bir dilim kalınlığında parasagital dilimleme gerçekleştirin. İnce bir iris spatula kullanarak dilimleri nazikçe ayırın ve soğuk diseksiyon ortamına koyun.
  11. Dilimlenmiş dokuyu taze bir soğuk diseksiyon tamponuna geri aktarın. Doku dilimlerini soğuk diseksiyon tamponu içeren tabağa hassas bir şekilde yönlendirmek için 1.000 μL'lik bir uç kullanın.
  12. Dürbün altında, doku dilimlerini birbirinden dikkatlice ayırmak için iki kavisli iris spatula kullanın. Kültürler için, organın medial kortiko-nükleer bölgesinde yer alan serebellar vermisten türetilen dilimleri kullanın.
  13. Her doku dilimini geniş bir spatula kullanarak bir kültür ekine aktarın ve bir doku dilimi taşıyan her bir ek, önceden ısıtılmış ortamı içeren 6 oyuklu plakalardaki bir kuyuya hareket ettirin. Plakaları inkübatörde bırakın.
  14. Ortamı iki günde bir değiştirin: kullanılmış ortamı steril bir cam pipet kullanarak aspire edin ve 5 mL'lik bir serolojik pipetle, pipetin ucu kuyu duvarına yaslanacak şekilde 1 mL taze MBE ekleyin. Ortam akışını dokuya yönlendirmediğinizden emin olun.
    NOT: Doku dilimi kültürde ilk 5-7 gün iltihap benzeri bir görünüm sergileyecek ve bu fenomen ortadan kalktığı anda ve kültür kurulduktan 2 hafta sonrasına kadar deneylere hazır olacaktır.

2. DNA'ya zarar veren ajanlarla tedavi, fiksasyon, boyama ve mikroskobik görüntüleme

  1. DNA'ya zarar veren kimyasalları, önceden belirlenmiş süreler boyunca uygun nihai konsantrasyonlarda doğrudan kültür ortamına ekleyin. Maruz kalma süresinden sonra, ortamı taze kültür ortamı ile değiştirerek kimyasalları çıkarın.
  2. DDR okuması PAR boyamasını içeriyorsa, fiksasyondan 30 dakika önce 10 μM'lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına bir poli (ADP-riboz) glikohidrolaz (PARG) inhibitörü ekleyin.
    NOT: PAR modifikasyonu kısa ömürlü olduğundan ve PARG tarafından sürekli olarak bozulduğundan bu tedavi kritiktir.
  3. Fiksasyondan hemen önce, ortamı aspire edin ve oda sıcaklığında 1 mL 0.1 M fosfat tamponu ile değiştirin.
    NOT: Soğuk tampon, doku dilimlerinin ek parçadan ayrılmasına neden olabilir.
  4. Tamponu önceden soğutulmuş (-20 °C) aseton: metanol karışımı (1: 1) ile değiştirerek dilimleri hemen sabitleyin, böylece doku dilimi bu karışıma daldırılır ve -20 °C'de 20 dakika bekletin.
    NOT: Bu aşamada durmak ve daha sonra immün boyamaya devam etmek mümkündür. Bunu yapmak için, dokuları 3 kez 4 °C'ye önceden soğutulmuş 0,1 M fosfat tamponu ile yıkayın ve dokunun tampona daldırıldığından emin olun. Dokular artık 0.1M fosfat tamponunda 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
  5. Doku dilimini 48 oyuklu bir plakada bir kuyuya aktarın.
  6. Ek parçanın kenar boşluklarını çıkarmak için bir neşter ve bir kesme tahtası kullanın ve doku diliminin etrafını kesin. Her dilimi 48 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin. 100 μL 0.1 M fosfat tamponu ekleyin.
  7. Geçirgenlik için tamponu aspire edin,% 1 Triton X-100 içeren 100 μL 0.1 M fosfat tamponu kuyucuğuna ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  8. Çözeltiyi aspire edin ve kuyucuk başına 100 μL bloke edici çözelti ekleyin (bkz. Tablo 1). Oda sıcaklığında 2 saat hafifçe çalkalayın.
  9. Blokaj adımı sırasında, birincil antikoru veya anti-PAR reaktifini (1:800) bloke etme solüsyonunda seyreltin.
  10. Bloke edici çözeltiyi çıkarın (yıkamaya gerek yok) ve her oyuğa 100 μL primer antikor karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak uygulayın.
  11. İkincil antikorları, ışığa maruz kalmalarını en aza indirirken% 0.2 Triton X-100 (1:500) içeren 0.1 M fosfat tamponunda seyreltin.
  12. Birincil antikor solüsyonunu aspire edin ve dilimleri 3 x 5 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 içeren 0.1 M fosfat tamponu ile oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak yıkayın.
  13. Yıkama solüsyonunu 100 μL ikincil antikor solüsyonu (1:500 seyreltme) ile değiştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe sallamaya devam edin (plakaları alüminyum folyo ile örtün).
  14. Bir DAPI çözeltisi hazırlamak için, stok çözeltisini (2 mg / mL) 1x PBS'de 1 μg / mL'ye seyreltin.
  15. İkincil antikor ile 2 saatlik inkübasyonun bitiminden yirmi dakika önce, her bir oyuğa 20 μL son DAPI çözeltisi ekleyin ve 20 dakika çalkalamaya devam edin. Sıvıyı aspire edin ve yıkama solüsyonu ile 3 x 5 dakika hafifçe çalkalayarak yıkayın.
  16. Montaj için, dokuyu doku yukarı bakacak şekilde bir mikroskop cam lam üzerine yerleştirin, montaj ortamı ekleyin ve bir kapak camı ile örtün. Slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve gece boyunca karanlıkta, oda sıcaklığında kurumaya bırakın (bulanıklığı önlemek için DAPI içeren montaj ortamı kullanmaktan kaçının).
  17. Slaytları 4 °C'de ışık geçirmez bir kutuda saklayın.
  18. Konfokal mikroskop ve uygun filtreler kullanarak mikroskobik görüntüler yakalayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, serebellar organotipik kültürlerin genel görünümünü göstermektedir. Şekil 1A'daki üst sıra, kültürde tutulan serebellar foliasyonu gösterirken, alt sıra, Calbindin D-28k (yeşil) için boyanmış PC'leri ve NeuN (kırmızı) için boyanmış nöronal çekirdekleri göstermektedir. Şekil 1B'de, PC'lerdeki astrositler (kırmızı), bir ara filament tip III proteini olan GFAP (yeşil) için boyanmıştır. Şekil 2 ve Şekil 3 , bu kültürlerin her ikisi de güçlü oksidanlar olan iki DNA'ya zarar veren ajanla muamele edilmesinden sonra gözlemlenen PAR boyamasını göstermektedir: potasyum bromat (12 saat boyunca 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon) ve parakuat. PAR yanıtı, serebellar foliumdaki tedavi edilen PC'lerde kontrole kıyasla işaretlendi.

figure-results-1
Şekil 1: Murin serebellar organotipik kültürlerine genel bakış. (A) Üst sıra, kültürde sürdürülen serebellar yapraklanmayı göstermektedir. Alt sıra PC katmanına odaklanır. PC'ler Calbindin D-28k (yeşil) ile vurgulanır. NeuN boyaması (kırmızı), katmanlar boyunca nöronal çekirdekleri tanımlar. (B) PC'lere daha yakından bir bakış (kırmızı). GFAP (yeşil), astrositleri vurgulayan bir ara filament tip III proteindir. Ölçek çubukları = 968,8 μm (A, üst sıra), 42,1 μm (A, ikinci sıra), 72,7 μm (B, üst sıra), 18,2 μm (B, ikinci sıra). Kısaltmalar: PC = Purkinje hücreleri; GFAP = glial fibriler asidik protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Potasyum bromat ile muamele edilmiş bir serebellar dilimde PAR boyama. Serebellar dilim, 12 saat boyunca 10 mM'lik bir nihai konsantrasyonda güçlü bir oksitleyici ajan olan potasyum bromat (KBrO3) ile muamele edildi. Ölçek çubukları = 775 μm. Kısaltmalar: PAR = poli(ADP-riboz); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Güçlü bir süperoksit anyonu üreticisi olan paraquat'a maruz kalan serebellar dilimlerde PAR yanıtı. (A) Bir serebellar foliumun genel bir görünümü. Özellikle PC'lerde kontrolle karşılaştırıldığında sağlam PAR tepkisine dikkat edin. (B) Daha yakından bir inceleme, PC'lerde ve diğer hücre tiplerinde PAR yanıtını gösterir. Ölçek çubukları = 193.8 μm (A), 18.2 μm (B). Kısaltmalar: PAR = poli(ADP-riboz); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çözeltiler ve tamponlar
Çözüm  Malzemeler
Diseksiyon ortamıHank'in %0.5 D-glikoz içeren dengeli tuz çözeltisi (HBSS). Mg2 + ve Ca2 + olmadan 50 mL HBSS'ye 0.5 mL P D-glikoz çözeltisi ekleyin.
BME kültür ortamıFenol kırmızısı içeren ancak L-glutamin veya HEPES içermeyen 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), fenol kırmızısı ile 50 mL HBSS, 50 mL ısıyla inaktive edilmiş at serumu, 2 mL P D-glikoz ve 1 mL 200 mM L-glutamin ile karıştırın. Steril bir ortamda 0,22 μm'lik bir filtreden karıştırın ve süzün. 4 °C'de saklayın
İmmün boyama için engelleme çözümü0,1 M Fosfat tamponunda:% 0,5 Triton X-100,% 10 Keçi serumu ekleyin
İkincil antikor seyreltme tamponu0.1 M fosfat tamponu, %0.2 Triton X-100
Yıkama tamponu0.1 M fosfat tamponu, %0.2 Triton X-100
Sabitleyici çözümActenoe:metanol (1:1 v:v)
Geçirgenlik çözümü0.1 M fosfat tamponu, %1 Triton X-100
DAPI çözümü1x PBS'de 1 μg/mL'ye seyreltilmiş stok çözeltisi (2 mg / mL)
Fosfat TamponuA ve B olmak üzere iki ruh hazırlayın (aşağıya bakın). 0.2 M fosfat tamponu yapmak için çözeltileri aşağıda belirtilen oranlara göre karıştırın. Daha sonra 0.1 M fosfat tamponu (çalışma çözeltisi) yapmak için 0.2M çözeltisini DDW (1: 1) ile seyreltin.
çözelti A (0,2 M için)12 g Sodyum Fosfat Monobazik Susuz (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL DDW
Çözüm B (0,2 m için)14.2 g Sodyum fosfat diyabazik susuz (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL DDW
0,2 M yapmak için karışık çözeltiler1 L hazırlayın: 230 mL çözelti A ve 770 mL çözelti B
0,1 M fosfat tamponuKarışık çözeltiyi DDW (1: 1) ile seyreltin

Tablo 1: Çözeltiler ve bileşimleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel yorumlar
Organotipik kültür sisteminin en büyük avantajı, serebellar korteks dokusunu kullanarak yapılan çalışmaları kolaylaştırması ve kültür kabı kurulumunda birkaç hafta boyunca yapısal organizasyonunu korumasıdır. Bu sistem, dendritik dikenlerin ve ultrastrüktürel özelliklerin ayrıntılı incelemeleri de dahil olmak üzere Purkinje hücrelerinin (PC'ler) derinlemesine morfolojik analizlerini yapmak için kullanışlıdır 52,53,54,55,56,57,58,59. Gözlemlerimiz, DNA hasar yanıtının (DDR) bu kültürlerdeki PC'lerde özellikle aktif olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu sistemin başlıca sınırlamaları, kullanımının sınırlı süresini ve hücresel süreçleri izlemek için mikroskobik görüntülemeye dayanmasını içerir ve uygun görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi veya uyarlanması için devam eden ihtiyacı vurgulamaktadır.

Bir başka uyarı, doku dilimlerini hazırlamak için diseke edilen serebellar kısım ile ilgilidir. Farklı serebellar lobların, belirgin şekilde farklı iç organizasyona ve genel kaliteye sahip kültürler verebileceğini gözlemledik. Bu nedenle serebellar vermisin midsagital kesitlerinden elde edilen dilimlerden kültür oluşturmayı tercih ediyoruz. Bu dilimlerde, serebellar korteksin foliaları rahatlıkla görülebilir.

Serebellar korteksin karakteristik yapraklanmasını sergileyen serebellar vermisten elde edilen doku dilimlerinin kullanılması tavsiye edilir. Bu dilimler, kültürdeki organizasyon yapılarını birkaç hafta boyunca korurlar. Ayrıca, kültürle deneysel prosedürlere kurulduktan yaklaşık 7-12 gün sonra başlanması tavsiye edilir. Bu kültürlerdeki DNA hasar tepkisini değerlendirmek için tasarlanmış tipik bir deney, ışınlama yoluyla veya kültür ortamına DNA'ya zarar veren kimyasalların eklenmesiyle hasarın başlatılmasını içerir. Daha sonra, çeşitli zaman aralıklarında doku fiksasyonu ve boyama yapılır. Kimyasal kaynaklı hasardan geri kazanımı değerlendirmek için, taze ortamda bir inkübasyon periyodu dahil edilir. Uzun süreli deneylerin ilk fırsatta, ideal olarak kültür kurulmasını yaklaşık 7 gün takip ederek başlatılması tavsiye edilir.

Serebellar organotipik kültürler antibiyotik içermeyen bir ortamda tutulur; Bu nedenle, kuruluşları sırasında steril bir ortamın sürdürülmesi zorunludur. Beyinciğin alındığı yavruların yaşı kritiktir ve önerilen 9-12 gün aralığındadır. Serebellar korteks kesit için yeterince gelişmiş olduğundan bu yaş aralığı en uygunudur. Özellikle, yaşlı hayvanlarda, dokular bıçağa yapışma eğilimindedir. Beyinciğin diseke edilene kadar soğuk bir diseksiyon solüsyonuna daldırılması çok önemlidir.

Kültürdeki ilk 5-7 gün boyunca, doku dilimleri, şişme ve sütlü renk değişikliği ile karakterize iltihaplanmayı andıran belirtiler gösterebilir. Bu özellikler, fizyolojik parametrelerin ölçümünü ve immün boyama tekniklerinin etkinliğini potansiyel olarak etkileyebilir.

Dilimleme sırasında kalınlıkta tutarsızlık oluşmasını önlemek için beyinciğin 350 μm'den daha ince dilimlenmemesi şiddetle tavsiye edilir. 350 μm'lik bir dilimlik dokunun kültürde 7 gün sonra çok daha inceldiğini ve yaklaşık 90 μm'ye çıktığını unutmayın (Z yığını ölçümüne göre).

Burada, PC'lerde DDR'yi araştırmak için kullanılan araç setine PAR boyama 7,50'yi tanıtıyoruz. Bu okuma hızlı, hassastır ve DDR'nin dinamik doğasını yakalar ve özellikle vahşi tip ve Atm eksikliği olan PC'lerde DDR analizimizde yararlı olduğunu kanıtlar. Burada özetlenen protokoller, beyinciği etkileyen genomik instabilite sendromlarını inceleyen araştırmacılar için özellikle faydalı olmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarımızdaki çalışmalar Dr. Miriam ve Sheldon G. Adelson Tıbbi Araştırma Vakfı ve İsrail A-T Hastalığıyla Mücadele Derneği tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Antikorlar

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif ve Ekipman< / güçlü>
150 x 30 cm Petri kabıCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri kabıCorning Inc.3294
AsetonInvitrogen25030081
AsetonSigma-Aldrich270725-1L
Yapıştırıcı mikroskop slaytlarıMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Doğrayıcı için bıçaklarTED PELLAModel TC752-1  Son Stil Tıraş Bıçakları
BMEGIBCO41010-026 500ml. L-Glut yok
Hücre kültürü,MilliporePICM0RG50
D-GlikozBiyolojik Hint'i ekler.02-015-1A
HBSS, fenol kırmızısı olmayanSigma-AldrichH-1138-500LHayır Ca+,
fenol kırmızısıSartoriusHBSS yok 02-015-1A
At serumu GIBCO26050088ısıyla etkisiz hale getirilmiş
İris forsepsCellPathGZX-0100-00A130mm künt tırtıklı
İris spatulaFST10092-12
L-Glutamin (200 mM)Gibco41010026
MetanolSigma-Aldrich322412-1L
Metanol ve nbsp;Sigma-AldrichG5767
MikroskopOlympus
GRIGENE içermeyen Montaj Ortamı. Ltd, İsrailK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat diklorür (Metil violojen)
PARG-Poli(ADP-Riboz) Glikohidrolaz inhibitörüTocris Bioscience, Birleşik KrallıkPDD 00017273ışığa duyarlı 
Fosfat tamponuBiyolojik Hint.02-018-1A
Makas, cilt dokusu
Altı kuyulu plakalarCorning dahilCLS3516
Yedek Doğrama Diskleri TED PELLAModel 10180-01
Doku doğrayıcıMcIlwainModel TC75210180-220
Cımbız, sivri
uçlu İdrar kapları
Alexa fluor 488 eşek anti Tavşan IgG 
Invitrogen		A212061:500; ikincil AB; İkincil seyreltme tamponu;   Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon
Anti glial fibriler asidik protienMilliphoreMAB34021:1500; birincil ab; engelleme; Ana bilgisayar: fare
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; birincil ab; engelleme; ev sahibi: tavşan 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; birincil ab; engelleme 
Anti-pan-ADP-riboz reaktifiMilliforMABE10161:800; birincil ab; engelleme; oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon
DAPI (4 ',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorür)Hücre sinyali40841:1000; ikincil seyreltme tamponu; oda sıcaklığında 20 dakika inkübasyon
ile Mg +

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ataxia TelangiectasiaATM DeficiencyFluorescent ImagingPoly ADP RiboseGenome InstabilityProtein CorrelationCalbindin Staining

İlgili makaleler