Method Article

Yüksek Boyutlu Akış Sitometrisi ile Verimli Tonsiller T Foliküler Yardımcı Hücre İşleme ve Fonksiyonel Analiz

DOI:

10.3791/67188

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bademcik örneklerinin toplanması ve işlenmesi, yüksek boyutlu spektral akış sitometrisi kullanılarak fenotipleme ve denetimsiz analiz yapılması için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T foliküler yardımcı hücreler (Tfh), B hücresi izotip değişimine, germinal merkez (GC) oluşumuna, somatik hipermutasyona ve afinite olgunlaşmasına yardımcı olan ve böylece enfeksiyon, otoimmünite ve aşılama sırasında ikincil lenfoid dokularda adaptif humoral immün yanıtları düzenlemeye yardımcı olan CD4+ T yardımcı hücrelerinin bir alt kümesidir. Tfh hücrelerinin gelişimini ve işlevini anlamak, etkili aşılar tasarlamak ve bu popülasyonu içeren hastalıklar için hedefe yönelik tedavi stratejileri geliştirmek için çok önemlidir. İnsan bademcik hücreleri ulaşılabilir mukozal lenfoid organlardır. Tfh ve GC hücreleri gibi farklı bağışıklık popülasyonlarının profilini çıkarmak, hücreden hücreye etkileşimleri sorgulamak, dinamik hücresel fonksiyonları değerlendirmek ve organ düzeyinde düzenleyici mekanizmalarını ortaya çıkarmak için eşsiz bir fırsat sunarlar. Ek olarak, bademcik hücrelerinin in vitro kültürlerinin işlenmesi kolaydır ve çeşitli koşullar altında Tfh hücre biyolojisinin değerlendirilmesini sağlar. Burada, insan bademcik hücrelerinin toplanması, izolasyonu, korunması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, Tfh hücrelerinin derinlemesine karakterizasyonu için tasarlanmış iki optimize edilmiş spektral akış sitometri panelini de açıklıyoruz. Son olarak, örnek olarak bir fosfataz proteini 2A (PP2A) inhibitörü tedavisi kullanarak, yüksek boyutlu akış sitometrisi verilerinin denetimsiz analizlerinin verimliliğini ve gücünü göstererek, tedaviye bağlı farklılıkları yüksek boyutlu bir ölçekte etkili bir şekilde ortaya çıkarıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T foliküler yardımcı hücreler (Tfh), germinal merkezlerin (GC'ler) oluşumu ve işlevi ve B hücresi antikor üretimi için gerekli olan CD4 + yardımcı T hücrelerinin farklı bir alt kümesidir. Tfh hücreleri, antijen sunan hücrelerle etkileşimler ve T hücresi reseptör sinyali, B hücreleri ile kostimülatör etkileşimler, sitokinler ve kemokinler dahil olmak üzere içsel ve dışsal faktörlerin entegrasyonu yoluyla naif CD4+ T hücrelerinden kaynaklanır1. Tfh hücreleri, GC içindeki veya yakınındaki konumlarını yönlendiren CXCR5 ve PD-1'i eksprese eder. BCL-6, Tfh geliştirme, bakım ve işlev 1,2 için kritik olan ana transkripsiyon faktörüdür. Tfh hücreleri, özellikle aşı yanıtlarında ve bakteriyel ve viral patojenlere karşı savunmada humoral bağışıklık tepkilerinin oluşturulması için çok önemlidir. Anormal Tfh hücre yanıtları, otoimmün hastalıklar, immün yetmezlik ve potansiyel olarak bazı kanser türleri dahil olmak üzere çeşitli bozukluklarda rol oynar 3,4,5,6. Bu nedenle, işlevlerini ve düzenlemelerini anlamak, etkili aşı ve terapötik stratejiler geliştirmek için önemlidir7.

İn vitro farklılaşma sistemlerinin iyi kurulduğu Th1, Treg ve Th17 gibi diğer CD4+ T yardımcı hücrelerininaksine 8, Tfh hücrelerinin incelenmesi daha karmaşıktır çünkü gelişimleri dinamik hücreden hücreye etkileşimleri ve özel anatomik yapıları içerir7. Bu nedenle, Tfh hücreleri ile ilgili çalışmalar büyük ölçüde insan periferik dolaşımdaki Tfh hücrelerinin (cTfh) ex vivo fenotiplemesine ve in vivo fare modellerine dayanmıştır. Bu nedenle, Tfh hücreleri üzerindeki spesifik moleküllerin düzenlenmesini araştırmak, özellikle insan Tfh hücreleri için zordur9. Bu nedenle, lenfoid dokulardan türetilen Tfh hücrelerinin derinlemesine bir ex vivo çalışması, insan Tfh hücreleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için gereklidir.

İkincil lenfoid organlar olarak bademcikler, her ikisi de GC'lerin oluşturulmasında etkili olan pre-Tfh (CXCR5intPD-1int CD4+) ve GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+) hücreleri gibi periferik kanda bulunmayan benzersiz hücre popülasyonlarını barındırır. Ayrıca, palatin bademcikler, pediatrik ameliyatlarda en sık çıkarılan dokulardan bazılarıdır ve kolayca erişilebilir, bu da onları Tfh hücrelerini içeren karmaşık bağışıklık mekanizmalarını keşfetmek için paha biçilmez bir insan dokusu kaynağı haline getirir. Bademcikler, solunum yolu viral enfeksiyonları için birincil bölge olan üst solunum yolunda yer aldığından, bu tür viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerini araştırmak için avantajlı bir doku sunar. Örneğin, laboratuvarımız daha önce COVID-19'dan iyileşmiş çocukların bademciklerinde ve geniz etlerinde Tfh hücrelerini karakterize etti ve bu dokuları enfekte olmamış kontrollerden10 olanlarla karşılaştırdı. Burada, bademcik hücrelerini işlemek ve saklamak için protokolümüzü özetliyoruz. Örnek olarak PP2A inhibitörü ile tedavi edilen bademcikleri kullanarak, bu hücrelerin yüksek boyutlu spektral akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini detaylandırıyoruz ve denetimsiz analiz kullanarak verileri analiz ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada tüm insan araştırmalarında Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları (Helsinki Bildirgesi) izlenmiştir. İnsan bademcik örnekleri, uykuda solunum bozukluğuna veya obstrüktif uyku apnesine neden olan adenotonsiller hipertrofisi olan hastalardan, Ulusal Çocuk Hastanesi, Çocuk Ulusal Hastanesi, Washington, DC'den elde edildi. Bu çalışma, Ulusal Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan (IRB) onay aldı (IRB protokol numarası 00009806). Bilgilendirilmiş onam, kayıtlı tüm katılımcıların ebeveynleri veya velileri tarafından imzalandı ve 7 yaş ve üstü reşit olmayan katılımcılardan onay alındı.

1. İnsan bademcik toplama ve tek hücre izolasyonu ve depolanması

  1. Bademcik tek hücrelerinin izolasyonu
    1. Cerrahi örnek toplama
      1. Tonsillektomi geçiren hastalardan bademcikler elde edin ve ameliyathanedeki taze doku parçalarını 25-35 mL buz gibi steril bademcik ortamı ile doldurulmuş 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın: %5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 0.05 mg/mL gentamisin, 10 mM glutamin ve antibiyotik-antimikotik karışımı (100 ünite/mL streptomisin, 100 ünite/mL penisilin, ve 0.25 μg / mL amfoterisin B).
        NOT: Yukarıdaki ortamdaki bademcikler gece boyunca 4 °C'de saklanabilir ve ertesi gün işlenebilir. Aynı gün işlemeye karşı gece depolamada minimum hücre canlılığı kaybı kaydedildi (Şekil 1A). Bademcikler ayrıca gece boyunca buz üzerinde sevk edilebilir.
    2. Bademcik işleme
      NOT: Tüm ortamlar, tamponlar ve cerrahi aletler steril olmalı ve bademcik hücresi izolasyonu biyogüvenlik başlığı içinde buz üzerinde yapılmalıdır.
      1. Bademcikleri, 5 mL soğutulmuş bademcik ortamı içeren 60 mm'lik plastik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Buz üzerinde çalışın. Steril cımbız ve makas veya neşter kullanarak, görünür kan pıhtılarını, yağı ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın (Şekil 1B,C).
      2. Bademcikleri, 5 mL buz gibi soğuk bademcik ortamı içeren 60 mm'lik yeni bir hücre kültürü kabına taşıyın. Bademcik parçalarını 3-5 mm'lik parçalar halinde dilimleyin.
      3. 10 mL soğuk bademcik ortamı içeren 60 mm'lik yeni bir hücre kültürü kabı hazırlayın ve tabağa 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
      4. Bademcik parçalarını süzgecin içine alın ve süzgeçten geçen steril 3 mL'lik bir şırınganın piston ucunu kullanarak bademcik parçalarını parçalayın.
      5. Süzgecin dışındaki ortamı içeren hücreleri tabakta toplayın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
      6. Süzgeç ile yemeğe 10 mL daha bademcik ortamı ekleyin, bademcik parçalarını piston ile parçalayın ve ortamı konik tüpte toplayın. Büyük bademcikler için, süzgeçte sadece bağ dokusu parçaları kalana kadar bu adımı 2-3 kat daha tekrarlayın. Kalan dokuyu ve kullanılmış plakaları biyolojik tehlike torbasına ve tıbbi atığa koyun.
      7. 50 mL'lik konik tüpü bademcik ortamı ile doldurun.
      8. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
        NOT: Santrifüjlemenin 20 dakikaya uzatılması verimi artırabilir.
      9. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için peleti dikkatlice emerek veya pipetleyerek veya pipetleyerek çıkarın ve peleti oda sıcaklığında (RT) 5 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. RT'de 5 dakika inkübe edin, ardından daha fazla lizizi önlemek için 35 mL soğutulmuş PBS ekleyin. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      10. 50 mL soğutulmuş PBS ve santrifüj ile bir kez yıkayın. 10 mL PBS ile tekrar süspanse edin ve hücreleri 70 μm'lik bir plastik süzgeçten süzün. Hücreleri sayın.
  2. Bademcik hücrelerinin dondurularak saklanması
    1. Dondurma ortamı hazırlayın (%90 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO)).
      NOT: Bu, 4 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir.
    2. Hücre süspansiyonunu (adım 1.1.2.10) 4 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini dondurma ortamı ile yeniden süspanse edin.
      NOT: Hücrelerin 10 ×6 ila 50 × 106 hücre/mL dondurma ortamı11 yoğunluğunda dondurulmasını öneririz.
    3. Hücre süspansiyonunun 0.5-1 mL'sini steril kriyoviyallere ayırın. Şişeleri -80 ° C'lik bir dondurucuda hız kontrollü dondurma kaplarında dondurun. Uzun süreli koruma için şişeleri bir hafta içinde sıvı nitrojen içeren bir depolama tankına aktarın.
  3. Donmuş hücrelerin çözülmesi
    NOT: Tek hücreli RNA dizilimi için bir numune hazırlama protokolünden referans alınan sıralı seyreltme çözdürme yaklaşımı aşağıda12'de özetlenmiştir. Diğer çözdürme yöntemleri de işe yarayabilir, ancak bu yaklaşımla, hücreleri hemen ılık çözülme tamponuna koymaya kıyasla daha fazla hücre canlılığı bulduk (Şekil 1D). Yıkama tamponu önceden hazırlanabilir. Çözülme tamponu, yıkama tamponu artı 0.1 mg / mL DNaz I'den oluşur (DNaz I, çözülmeye başlamadan hemen önce eklenmelidir). Hücre verimini artırmak için santrifüjleme süresinin 1 dk / mL'ye (15 mL tüpler için) çıkarılması isteğe bağlıdır.
    1. Bir su banyosunu 37 °C'ye ısıtın. Çözdürme ve yıkama tamponunu 37 °C su banyosunda önceden ısıtın.
      NOT: Tüm hücre yıkamaları RT'de gerçekleştirilir.
    2. Kriyoviyalleri depodan çıkardıktan hemen sonra 37 °C su banyosunda 2-3 dakika çözdürün. Şişeyi su banyosuna tamamen batırmaktan kaçının. Küçük bir buz kristali görünmeye devam ederken şişeyi su banyosundan çıkarın.
    3. Çözülmüş hücreleri, biyogüvenlik başlığında geniş delikli bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpe nazikçe aktarın. Kriyoviali 0,5 mL önceden ısıtılmış çözdürme tamponu ile durulayın ve durulamayı damla damla (her 5 saniyede bir 1 damla) 15 mL konik tüpe ekleyin, karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.
    4. Hücreleri 15 mL konik tüpte sırayla 2 mL ve ardından 4 mL ortam ekleyerek eklemeler arasında ~ 1 dakika bekleme süresi ile seyreltin. Tüpe her 3-5 saniyede bir 1 mL oranında ortam ekleyin, karıştırmak için hafifçe döndürün.
    5. RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı çıkarın; hücre peletini 300 μL çözdürme tamponunda yeniden süspanse etmek; ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
    7. 10 mL yıkama tamponu ekleyin (DNaz I yok). RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da tekrar santrifüjleyin.
    8. Bir kez daha yıkayın: süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 10 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
    9. Hücreleri 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. RT'de 400 × g'da 5 dakika tekrar santrifüjleyin ve hücreleri sayın. Kültür ortamında yeniden süspanse edin.

2. Ex vivo tedavi sonrası hücre içi sitokinlerin ve transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunun ölçülmesi

NOT: Burada, iki yüksek boyutlu akış sitometrisi paneli kullanarak tonsiller Tfh hücrelerinin fenotipik karakterizasyonu için yöntemimizi detaylandırıyoruz. PP2A aktivitesinin optimal BCL-6 protein ekspresyonu ve Tfh farklılaşması4 için gerekli olduğu göz önüne alındığında, PP2A inhibitörü cantharidin (CAN) ile tedavi edilen bademcik hücrelerinin incelenmesi yoluyla Tfh hücre bakımı ve işlevselliği hakkındaki değerlendirmemizi gösteriyoruz.

  1. Akış sitometrik boyama
    1. Hücre içi sitokin boyama
      NOT: Kuluçka işlemleri karanlıkta yapılır. Her iki panelde kullanılan reaktifler, antikorlar ve bunların kuyu başına ilgili miktarları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. T hücresi degranülasyonunu değerlendirmek için, içselleştirilmesinden kaynaklanan yanlış negatif sonuçları en aza indirmek için tedavi adımı sırasında anti-CD107a antikoru eklenir13.
      1. Plaka 2 × 10200 μL kültür ortamı (1 × 107 hücre / mL) ile 6 bademcik hücresi, 96 oyuklu bir U alt plaka kuyusunda 16 saat boyunca aşağıdaki miktarlarda PP2A inhibitörü CAN ile: araç kontrolü, 3 μM ve 6 μM.
        NOT: CAN, %1 DMSO ile 0.1 M'de sulandırıldı.
      2. Monensin (0.7 μL / mL), brefeldin (1: 1.000), forbol miristat asetat (50 ng / mL, PMA), iyonomisin (1.000 ng / mL) ve 2 μL anti-CD107a ekleyin. 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde 2.5 saat boyunca toplam kültür hacmi kuyu başına 200 μL'dir.
      3. Antikor agregatlarını çıkarmak için boyama antikorlarını ~ 16.000 × g'da 4 ° C'de 3-5 dakika santrifüjleyin. Kemokin reseptörleri, Brilliant Stain Buffer Plus ve FACS tamponu ( Malzeme Tablosunda belirtilen her birinin hacmi, reaksiyon başına toplam 112 μL karışım) hariç tüm yüzey antikorlarını içeren adım 2.1.1.8 için yüzey antikor karışımını hazırlayın.
      4. Kültürde 2,5 saat tamamlandıktan sonra, hücreleri 2 μL buz gibi soğuk PBS ile 2 μ × 4 ° C'de 2 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyerek yıkayın. Yıkamalar arasında, plakayı hızlı bir şekilde ters çevirerek süpernatanı atın. Aynı plakada boyama yapın.
      5. Hücreleri 100 μL / oyukta 1:800 seyreltilmiş CANLI / ÖLÜ Mavi boyada PBS'de RT'de 15 dakika inkübe edin. 2x'i 200 μL FACS tamponu ile yıkayın.
      6. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri True Stain Monosit Bloker (5 μL monosit bloker + kuyu başına 45 μL FACS tamponu) ile yeniden süspanse edin.
      7. Sırayla kemokin reseptör antikorlarını doğrudan boyama reaksiyonuna ekleyin (ilk olarak, her biri 10 dakika boyunca anti-CXCR3 ve anti-CCR7, ardından anti-CXCR5 ve anti-CCR6 karışımı ile birlikte 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus RT'de 5 dakika boyunca). Her eklemeden sonra birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Antikor hacimleri için Malzeme Tablosuna bakınız.
      8. Adım 2.1.1.3'te hazırlanan yüzey antikor karışımını doğrudan boyama reaksiyonuna ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyon başına toplam boyama hacmi 180 μL'dir: tamponda 50 μL monosit bloker (bkz. adım 2.1.1.6) + 18 μL anti-kemokin reseptör antikoru (bkz. adım 2.1.1.7) + 112 μL yüzey antikoru karışımı (bkz. adım 2.1.1.3).
      9. 2 adet 200 μL soğuk FACS tamponu ile yıkayın.
      10. Hücreleri yeniden süspanse edin ve RT'de 20 dakika boyunca 80 μL / kuyu paraformaldehit bazlı fiksasyon tamponu ile inkübe edin.
      11. Zaten fiksasyon tamponu içeren her oyuğa 160 μL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Plakayı RT'de 2 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve 1x'i 200 μL geçirgenlik tamponu ile yıkayın.
      12. Anti-sitokin antikorları, Brilliant Stain Buffer Plus ve geçirgenleştirme tamponu (toplam hacim 50 μL/kuyu, Malzeme Tablosu) içeren hücre içi sitokin (ICS) antikor karışımını hazırlayın. Hücreleri bu hücre içi sitokin antikor karışımı ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
      13. 2 adet 200 μL/kuyu geçirgenlik tamponu ile yıkayınız. 200 μL/kuyu FACS tamponu ile tekrar süspansiyon haline getirin.
      14. Lekeli hücreleri karanlıkta 4 ° C'de saklayın ve boyama yoğunluğu kaybını en aza indirmek için 24 saat içinde bir spektral akış sitometresindeveri alın 14.
    2. Nükleer transkripsiyon faktörü boyama
      1. Hücreleri adım 2.1.1.1'deki gibi (hücreleri uyarmadan) CAN ile kültürleyin.
      2. Kültür ortamına anti-insan CD40 antikoru (0.5 μg / mL) ekleyin ve boyamaya başlamadan önce 15 dakika boyunca hücrelerle kültürleyin. Hücreler uyarılırsa, aktivasyon 15,16 üzerine CD40L'nin içselleşmesini önlemek için stimülasyona başlamadan15 dakika önce bu antikoru ekleyin.
      3. Boyama antikorlarını santrifüjleyin ve adım 2.1.1.3'e benzer yüzey antikor karışımını hazırlayın: Malzeme Tablosundaki yüzey antikorları, 10 μL/oyuklu Brilliant Stain Buffer Plus ve 54.1 μL/oyuklu FACS tamponu.
        NOT: Kuyucuk başına toplam boyama hacmi 180 μL'dir: tamponda 50 μL monosit bloker + 13 μL kemokin reseptör antikoru + 117 μL yüzey antikoru karışımı.
      4. Hücreleri yıkayın ve 2.1.1.5-2.1.1.8 adımlarında olduğu gibi CANLI/ÖLÜ Mavi boyama ve yüzey boyama ve yıkama işlemleri gerçekleştirin.
        NOT: Anti-CXCR3 antikoru bu panele dahil değildir.
      5. Hücreleri FoxP3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Setinden 80 μL nükleer transkripsiyon faktörü fiksasyon tamponu ile sabitleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
      6. Hücreleri adım 2.1.1.11'deki gibi geçirgenlik tamponu ile yıkayın.
      7. Malzeme Tablosunda listelenen anti-transkripsiyon faktörü antikorlarını, 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus ve 16 μL geçirgenlik tamponunu (toplam hacim 40 μL/kuyu) içeren hücre içi transkripsiyon faktörü (TF) antikor karışımını hazırlayın. Hücreleri bu karışımla 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      8. Adım 2.1.1.13-2.1.1.14'teki gibi spektral bir sitometrede yıkayın ve edinin.

3. Yüksek boyutlu akış sitometrisi verilerinin denetimsiz analizi

NOT: Analiz için kullanılan yazılımlar, paketler ve bunların sürümleri Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. 3.2'den 3.4'e kadar olan adımlardan ekran görüntüleri Ek Dosya 1'dedir. 3.5'ten 3.7'ye kadar olan adımlardaki örnek komut dosyaları Supplemental Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te, 3.8'den 3.9'a kadar olan adımlar Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5'te yer almaktadır. Komut dosyaları için ICS ham dosyaları ve TF ham dosyaları sırasıyla Ek Dosya 6 ve Ek Dosya 7'de sağlanır.

  1. ".fcs" dosyalarının depolandığı akış sitometrisi analiz yazılımı çalışma alanını açın ve Şekil 1E'de gösterildiği gibi geçitlemeyi tamamlayın.
  2. Hedef düğüme sağ tıklayın (bu durumda CD4+ T hücreleri). Eşdeğer düğümleri seç'i seçin.
  3. Hedef düğüme tekrar sağ tıklayın. Popülasyonları Dışarı Aktar/Birleştir'i seçin.
  4. Populations: Export (Dışa Aktar) veya Concatenate (Dışa Aktar) veya Concatenate (Dışa Aktar) penceresinin açılmasını bekleyin, CSV kanalı değerlerini seçin ve dışa aktarılan dosyalar için hedefi seçin. Olayları Dahil Et kutusundaki tüm hücreleri dahil edin ve Parametreler kutusunda Tüm telafi edilen parametreler'i seçin. Gelişmiş Seçenekler'i genişletin, dosyaları yeniden adlandırmak için bir önek yazın ve dosyaları hedef klasöre dışa aktarmak için dışa aktar'ı tıklatın (her örnek için bir .csv dosyası dışa aktarın).
  5. Dışa aktarılan "*.csv" dosyalarını R ile okuyun (her örnek için bir tane). Her hücreye bir örnek kimliği atayın ve tüm örneklerdeki hücreleri tek bir veri çerçevesinde birleştirin.
  6. Veri çerçevesine meta veriler (örnekler hakkında ek bilgiler) ekleyin veya birleştirin.
  7. Aşağıdaki analiz için örnek başına eşit sayıda hücreyi rastgele alt örnekleyin. Bu adım isteğe bağlıdır.
    NOT: Bu örnekte, 8.000 CD4 + T hücresi, her koşulun toplam CD4 + T hücrelerinden alt örneklenmiştir, bu da toplam CD4 + T hücresi sayısının en az 1 / 7'sini temsil eder.
  8. Seurat nesnesi oluştur: Bir Seurat nesnesi oluştururken antikor belirteçleri için Kanal değerlerini gen ekspresyon seviyeleri olarak yorumlayın.
    1. Adım 3.6'dan itibaren oluşturulan veri çerçevesi ile Seurat nesnesini oluşturun. NormalizeData adımını atlayın ve bunları doğrudan "veri" tahlili olarak kaydedin.
    2. Denetimsiz kümelemede VariableFeatures olarak kullanmak için akış panelinden yüzey işaretçilerini seçin.
    3. ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP'i NormalizeData adım17 dışında Seurat'tan tanıtılan standart işlem hattı olarak çalıştırın.
    4. Küme sayısını değiştirmek için FindClusters adımındaki resolution parametresini ayarlayın ve temel alınan biyolojik bağlamı daha doğru bir şekilde yansıttıklarından emin olun.
  9. Seurat paketi ile uyumlu DimPlot ve FeaturePlot gibi görselleştirme araçlarını kullanın. Grup başına birden fazla örnek içeren grupları karşılaştırmak için, her kümenin yüzdesini konu bazında hesaplayın ve istatistiksel karşılaştırmalar yapın. Daha sonra, daha karmaşık istatistiksel analizler için matematiksel modelleri kullanın10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel hücre canlılığını karşılaştırmak için, bademcikleri üç benzer parçaya böldük ve bunları üç koşul altında protokolümüzü kullanarak işledik: (1) aynı gün işleme, (2) 4 ° C'de gece boyunca depolama ve (3) gece boyunca buz üzerinde depolama. Bu üç koşul arasındaki uygulanabilirlik, önemli bir fark olmaksızın oldukça benzerdi (Şekil 1A). Ayrıca çözülme işleminin hücrelerin canlılığı üzerindeki etkisini de değerlendirdik. Kullandığımız damla damla çözdürme yöntemi, aynı donörden alınan donmu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taze bademciklerin ameliyattan sonraki 3 saat içinde işlenmesi gerektiğine dair önceki raporlarınaksine 19, taze bademcik örneklerinin 4 ° C'de saklandığında ve 24 saat içinde işlendiğinde canlılıklarını koruyabildiğini gördük. Sıvı nitrojen deposundan çözüldükten sonra bademcik dokusundan hücre canlılığını optimize etmek için, yüksek hücre canlılığının büyük ölçüde değerli olduğu tek hücreli dizilemede önerilen damla damla çözülme yöntemini benimsedik

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, NIAID, NIH Intramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü > Makineler ve aletler< / güçlü>
3 mL Plastik ŞırıngaBD309657
96 Kuyulu U Alt PlakaThermo Scientific163320
1.2 mL Kriyojenik ŞişelerCorning430487
Hücre süzgeci 70 ve mikro; m NaylonFalcon352350
Hücre Kültürü Kabı (60 mm)VWR10062-890
SantrifüjThermo ScientificSorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Dijital Su BanyosuBenchmarkB2000-2
İnce Makas - SharpF.S.T14060-11
Plastik Alet ÇantalarıF.S.T20830-05
Spektral akış sitometresi, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Standart Model ForsepsFST11000-13
Standart Model ForsepsFST11000-20
Vi-cell Blu hücre canlılık analizörü ve nbsp;Beckman CoulterC19201
Reaktifler
0.5 M EDTA pH 8.0Kalite Biyolojisi351-027-101
2-MerkaptoetanolGibco21985-023
ACK parçalama tamponuGibcoA10492-01
Antibiyotik-antimikotik karışımı (Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Süspansiyonu, 100x)Gibco15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385
CantharidinSigmaC7632-25MG
Cytofix Fiksasyon TamponuBD554655
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
Fetal Sığır Serumu (FBS)VWR97068-085
FoxP3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetieBioscience00-5523-00
Gentamisin (50 mg/mL)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
İyonomisinSigma  I0634-1mg
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
Paraformaldehit% 16 çözelti, EM derecesi (PFA)Elektron Mikroskobu
  Science		15710PBS PBS ile seyreltin
, pH 7.4Gibco10010072
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)Gibco15140-122
Phorbol 12-Miristat 13-Asetat (PMA)SigmaP8139-1mg
Hız kontrollü dondurma kaplarıMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamin)Gibco11875-085
Sodyum Piruvat (100 mM)Gibco11360-070
Gerçek Lekeli Monosit BlokerBioLegend426103
Tamponlar
Kültür ortamı%10 ısıyla inaktive edilmiş FBS (VWR),
2 nM glutamin,
0.055 mM 2-merkaptoetanol,
%1 penisilin/ streptomisin,
1 mM sodyum piruvat, < br / > 10 mM HEPES, < br / > RPMI (+L-Glutamin) FACS tamponunda %1 esansiyel olmayan amino asitler
FACS tamponuPBS'de 2 mM EDTA ve %2 ısıyla inaktive edilmiş FBS
Dondurma ortamı%90 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve %10 DMSO
Çözülme tamponuYıkama tamponu + 0.1 mg/mL DNaseI
Bademcik ortamı%5 ısıyla inaktive edilmiş FBS,
10 mM glutamin,
0.05 mg/mL gentamisin,
%1 antibiyotik-antimikotik karışımı
ile desteklenmiş RPMI; (penisilin, streptomisin ve amfoterisin B).
%10 & nbsp; ısıyla inaktive edilmiş FBS ve 10 mM HEPES ile desteklenmiş yıkama
< güçlü > antikorlar ve sitokin paneli için diğer vekiller 
biyotin anti-insan CD107a (LAMP-1) AntikorBioLegend3286042 & mu; 200 & mu'da L; L kuyucuk başına tam kültür ortamı.
Bu antikor, PMA/iyonomisin stimülasyonu sırasında hücrelerle birlikte eklenmiştir.
< güçlü > Canlı Ölü boyama< / güçlü >100 & mu; L kuyu başına
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0.125 μ 100 &mu'da L; Kuyu başına L PBS. 
Monosit bloğu< / güçlü >50 & mu; Kuyu
Monosit bloker tamponuBioLegend4261035 & mu; L True Stain monosit bloker ve 45 & mu; L Sitokin
için kuyu < güçlü >
başınatamponu; L/iyi 
Anti-insan CCR6-BV711BioLegend3534361
Anti-insan CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-insan CXCR3-PE-Cy5BD551128 5
Anti-insan CXCR5-BV750BD747111 1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
         18 μ Kemokin reseptörleri için kuyu başına L karışımı;
Monosit blok tamponu
Diğer yüzey antikor karışımı< / güçlü>μ L/iyi 
Anti-insan CD103-BUV661BD7499932.5
Anti-insan CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
Anti-insan CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
Anti-insan CD25-BB515 BD56446710
Anti-insan CD27- Süper Parlak 436Thermo62-0279-425
Anti-insan CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-insan CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-insan CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
Anti-insan CD45RA-BUV395BD7403150.6
İnsan karşıtı CD56-BUV737BD6127663.5
İnsan karşıtı CD57-FITCBioLegend3596041.2
İnsan karşıtı CD69-BUV563BD7487641
İnsan karşıtı CD8-BUV805BD6128891.2
İnsan karşıtı FAS-BB700BD5665420.6
İnsan karşıtı HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-insan PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-insan-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS tamponu61
                                 112 μ Diğer yüzey antikorları için kuyu başına L karışımı;
Doğrudan monosit blok tamponuna ekleyin (50 μ L) ve kemokin reseptör karışımı (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ Kuyucuk başına toplam L)
Sitokin paneli için hücre içi sitokin antikorları< / güçlü>μ L/iyi 
Anti-insan Granzyme B-PEBD561142 1
Anti-insan IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
Anti-insan IL17A-BV605BioLegend5123261
Anti-insan IL2-BV650BioLegend5003343
Anti-insan IL21- Alexa Fluor 647BD56049310
Anti-insan IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Anti-insan Perforin-APCBioLegend3533122.5
Anti-insan TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300.1
Anti-IFNγ-Pasifik MavisiBioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1x geçirgenlik tamponu eBioscience00-5523-0019.15
     (50 μ Kuyu başına L karışımı)
< güçlü > transkripsiyon faktörü paneli için antikorlar ve diğer vekiller< / güçlü >
CD40 Antikor, anti-insanMiltenyi Biotec130-094-1330.5 & mu; çalışma konsantrasyonu için g / mL kültür ortamı
< güçlü > Canlı Ölü boyama< / güçlü >100 & mu; L kuyu başına
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0.125 μ 100 &mu'da L; Kuyu başına L PBS. 
Monosit bloker tamponuBioLegend4261035 & mu; L True Stain monosit bloker ve 45 & mu; L Transkripsiyon
faktörü paneli için kuyu yüzey antikorları başına FACS tamponu< güçlü >
güçlü <> Kemokin reseptörleri karışımı< / güçlü>mu; L/iyi 
Anti-insan CCR6-BV711BioLegend3534361
Anti-insan CCR7-BV421BioLegend3532081
Anti-insan CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385 10
         13 μ Kuyu
Diğer yüzey antikor karışımı< / güçlü>μ L/iyi 
İnsan karşıtı 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
İnsan karşıtı CD14-Kıvılcım Mavisi 550BioLegend3671482.5
İnsan karşıtı CD19-Kıvılcım NIR 685BioLegend3022702.5
İnsan karşıtı CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
İnsan karşıtı CD25-PE-CY5BioLegend3026085
İnsan karşıtı CD3-BV510BioLegend3448282.5
İnsan karşıtı CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
İnsan karşıtı CD4-Pasifik MavisiBioLegend3174231
İnsan karşıtı CD40L-PEBD15
İnsan karşıtı CD45RA-BUV395BD7403150.6
İnsan karşıtı CD56-BUV737BD6127663.5
İnsan karşıtı CD69-BUV650BioLegend3109342.5
İnsan karşıtı CD8-BUV805BD6128891.2
İnsan karşıtı HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
İnsan karşıtı ICOS-BUV563BD7414211.2
İnsan karşıtı OX40-APCBioLegend3500085
Anti-insan PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-insan-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS tamponu54.1
               117  μ Diğer yüzey antikorları için kuyu başına L karışımı;
Doğrudan monosit bloğuna ekleyin  tampon (50 μ L) ve kemokin reseptör karışımı (13 & mu; L, 50+13+117 = 180 μ Kuyucuk başına toplam L)
Transkripsiyon faktörü paneli için transkripsiyon faktörü antikorlarıμ L/iyi 
Anti-insan T-bet-BV605BioLegend6448174
Anti-insan Bcl6-PE-CF594BD5624014
Anti-insan FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871.6
Anti-insan GATA3-BB700BD5666422
Anti-insan Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770.4
Anti-insan Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
Parlak Leke Tamponu Plus (RUO)BD56638510
1 x Geçirgenleştirme tamponu eBioscience00-5523-0016
                         40 μ
Denetimsiz analiz için kuyuYazılım ve Paketler başına L karışımı<>
strong>Software/packageVersion<strong>Source
1data.table1.16.2Kapsamlı R Arşiv Ağı
2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3pheatmap1.0.12Kapsamlı R Arşiv Ağı
4R4.3.2Kapsamlı R Arşiv Ağı
5readxl1.4.3Kapsamlı R Arşiv Ağı
6Rstudio2023.12.1+402Konum PBC
7Seurat5.1.0Kapsamlı R Arşiv Ağı
8SeuratData0.2.2.9001Kapsamlı R Arşiv Ağı
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0Kapsamlı R Arşiv Ağı
11viridis0.6.5Kapsamlı R Arşiv Ağı
tamponu RPMI (+L-Glutamin)karışımbaşına L karışımı paneli< / güçlü > Kemokin reseptörleri karışımı ve mu Yüzey antikorları FACS ile hücrelere yönlendirilmiş ekleyinkarışım başına L karışımı 557299

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Follicular HelperTonsil Cell IsolationFlow CytometrySpectral CytometryGerminal Center CellsAdaptive ImmunityIn Vitro CulturePP2A InhibitorCell Interaction AnalysisB Cell Isotype
Video Coming Soon

Related Articles