Method Article

Kafası Sabit Farelerin Beyin Sapından Akut Tek Üniteli Çoklu Elektrot Kayıtları

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kafasına sabitlenmiş farelerin beyin sapından in vivo, yüksek yoğunluklu tek nöron kayıtları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu yaklaşım, genel anestezi öncesinde ve sırasında Hızlı Göz Hareketi (REM) uykusu sırasında aktif olmayan bir beyin sapı bölgesi olan ventrolateral periakuaduktal grideki nöronların aksiyon potansiyel ateşlemesini ölçmek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silikon multielektrot tabanlı kayıtlar, birçok beyin bölgesindeki aksiyon potansiyellerinin zamansal çözünürlüğünde nöronal aktiviteyi incelemek için giderek daha popüler hale gelmektedir. Bununla birlikte, çok kanallı problar kullanılarak beyin sapı gibi derin kaudal yapılardan nöronal aktivitenin kaydedilmesi zor olmaya devam etmektedir. Önemli bir endişe, superior sagital venöz sinüs ve transvers venöz sinüs gibi büyük kan damarlarından kaçınan prob yerleştirme için bir yörünge bulmaktır. Bu büyük damarların yaralanması, geniş kanamaya, altta yatan beyin dokusunda hasara ve potansiyel olarak ölüme neden olabilir. Bu yaklaşım, ön koordinatları açılı bir yaklaşımla birleştirerek beyin sapı yapılarını hedeflemeyi açıklar ve kayıt probunun yüksek riskli vasküler yapıların altındaki beyne nüfuz etmesine izin verir. Kesinlikle dikey bir yaklaşımla karşılaştırıldığında, açılı yaklaşım, hedeflenebilecek beyin bölgelerinin sayısını en üst düzeye çıkarır. Bu stratejiyi kullanarak, REM uykusu ile ilişkili bir beyin sapı bölgesi olan ventrolateral periakuaduktal gri (vlPAG), sevofluran anestezisi öncesinde ve sırasında başa sabitlenmiş farelerde tek üniteli, çok elektrotlu kayıtlar elde etmek için tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde erişilebilir. vlPAG ve çevresindeki çekirdeklerdeki nöronal aktiviteyi yüksek zamansal çözünürlükle kaydetme yeteneği, REM uykusu ve anestezi arasındaki ilişkinin anlaşılmasında ileriye doğru atılmış bir adımdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Silikon çoklu elektrot tabanlı kayıtlar, tek eylem potansiyeli çözünürlüğü 1,2,3,4 ile birçok beyin bölgesindeki nöronal aktiviteyi ölçmek için giderek daha popüler hale geliyor. Son on yılda, yüksek yoğunluklu kayıt teknolojisi önemli ölçüde büyüdü. Mevcut silikon bazlı kayıt elektrotları, yüksek kanal sayılarını, optik fiberleri ve elektrokortikografi (ECoG) kayıt cihazlarını barındırabilir 5,6. Ayrıca, bu elektrotların kronik implantasyonu, uzun süreli kayıtlara izin verir 7,8.

Son teknolojik gelişmelere rağmen, çok kanallı problarla beyin sapı gibi derin kaudal yapıları hedeflemek hala zor olmaya devam etmektedir. Ventrolateral periakakuduktal gri (vlPAG) gibi beyin sapı yapılarını hedeflerken, önemli bir engel, superior sagital venöz sinüs ve transvers venöz sinüs gibi ana kan damarlarından kaçınan bir prob yörüngesini tanımlamaktır. Bu büyük damarların yaralanması, geniş kanamaya, altta yatan beyin dokusunun zarar görmesine ve hatta ölüme neden olabilir 9,10. Beyin sapı yapılarını anterior koordinatlardan belirli bir açıyla hedeflemeyi ve kayıt probunun bu tür yüksek riskli vasküler yapıların altındaki beyne nüfuz etmesine izin vermeyi öneriyoruz (bkz. Şekil 1). Bu açılı yaklaşım, dikey yaklaşımla karşılaştırıldığında, kayıt için erişilebilir olan beyin bölgelerinin sayısını en üst düzeye çıkarır. Ek olarak, ECoG kayıtlarının istendiği deneysel durumlarda, prob yerleştirme için kraniyotomi penceresi daha öne konumlandırıldığından, açılı anterior yaklaşım, ECoG kulaklık implantasyonu için daha fazla kafatası yüzeyi sağlar10,11.

Anesteziye bağlı REM uyku değişikliklerinden sorumlu spesifik hücre gruplarını ve devreleri tanımlamak, anestezi araştırmalarının ana hedefi olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, buradaki amaç, sevofluran anestezisi öncesinde ve sırasında başa sabitlenmiş farelerde tek üniteli, çok elektrotlu kayıtlar elde etmek için REM uykusu ile ilişkili bir beyin sapı bölgesi olan vlPAG'a tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde erişmekti12,13. Önceki çalışmalar, anestezi ile ilişkili nöral durum değişikliklerini tanımlamak için uyanık farelerde vlPAG'ın elektrofizyolojik yerel alan potansiyeli (LFP) ölçümlerini kullanmıştır14,15. Bununla birlikte, LFP ölçümleri, kaydedilen alan16 içindeki aksiyon potansiyellerine değil, öncelikle sinaptik aktiviteye duyarlıdır. Sonuç olarak, anesteziklerin vlPAG nöronları tarafından üretilen nöral aktivite modellerini nasıl doğrudan etkilediğine dair sınırlı bir anlayış vardır. Burada, kafası sabit farelerin beyin sapından yüksek yoğunluklu tek nöron kayıtları elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda diğer çeşitli derin ve arka beyin sapı yapılarından tek nöron aktivitesini kaydetmek için de uyarlanabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm çalışmalar, Virginia Üniversitesi'ndeki (Charlottesville, Virginia) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. 3-7 aylık, 25-30 g ağırlığında beş erkek C57BL / 6J faresi kullanıldı. Burada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Başlık plakası ve kulaklık implantasyonu

  1. Perfloroalkoksi (PFA) kaplı paslanmaz çelik kabloyu 3 pimli konektör başlığına lehimleyerek bir ECoG kulaklık yapın (Şekil 2A).
  2. Fare stereotaksik atlasına dayalı olarak yerleştirme koordinatlarını tanımlayın17. Prob yerleştirme açısını ve derinliğini hesaplamak için Pisagor teoremini kullanmak - özellikle literatürde çok az bilgi olduğunda - makul bir başlangıç noktasıdır (Şekil 1)18.
    NOT: Sonuç olarak, koordinatlar deneme yanılma yoluyla ayarlanacaktır. vlPAG'ı hedeflemek için yetişkin farelerde aşağıdaki koordinatlar kullanıldı: anteroposterior (AP) -3.6 mm, mediolateral (ML) +0.5 mm, dorsoventral (DV) -4 mm. Prob 20°'lik bir açıyla (AP) yerleştirildi.
  3. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirerek genel anesteziyi indükleyin (oksijende% 1.5 -% 3 İzofluran). Anestezi uygulandıktan sonra, fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin, hayvanın burnunu burun konisine yerleştirin ve kafayı kafa çubuklarıyla sabitleyin.
  4. Kornea hasarını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Vücut ısısını 37 °C'de tutmak için bir sıcaklık kontrol sistemi kullanın.
  5. Saç derisine tüy dökücü krem uygulayın veya kürkü tıraş edin, ardından povidon iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Steril bir cerrahi alanı korumak için 'yalnızca ipuçları' aseptik tekniğini kullanın.
  6. Anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.
  7. Analjezi uygulayın: carprofen 2.5 mg / kg, sırtta deri altından verilir.
  8. Parietal ve oksipital kemiklerin üzerinde dairesel bir deri yamasını çıkarmak için 5 mm'lik bir kafa derisi kesisi yapın. Meninksleri neşter bıçağıyla kazıyarak nazikçe çıkarın.
  9. Kas eklerini kesmek ve parietal ve oksipital kemikleri ortaya çıkarmak için neşter bıçağını kullanın19. Kanamayı kontrol etmek ve kafatası yüzeyini kurutmak için gerektiği kadar hidrojen peroksit uygulayın. Güçlü bir bağ elde etmek için kuru kafatasına diş çimentosu ve reçine uygulamak çok önemlidir.
  10. İlk olarak, kafatası20 üzerindeki bregma ve lambda yer işaretlerini tanımlayın. Ardından, kafatasının ön-arka konumunu düzleştirmek için burun konisi konumunu ayarlayın ve iki yer işareti arasında 100 μm'den fazla yükseklik farkı olmadığından emin olun.
  11. Kafatasının medial-lateral pozisyonunu düzleştirmek için, bregma ve lambda arasında, her biri sagital sütürden 1 mm uzakta olan iki zıt nokta seçin ve seviyelerini kontrol edin. Aralarında 100 μm'den fazla yükseklik farkı varsa, kafa çubuklarını manipüle ederek kafatasının medial-lateral pozisyonunu ayarlayın.
  12. Bregma ve lambda arasındaki mesafeyi ölçün ve bunu Franklin-Paxinos stereotaksik atlasında (genellikle 4,2 mm) bildirilen mesafeyle karşılaştırın17. AP koordinatınızı orantılı olarak ölçeklendirmek için ölçülen ve bildirilen mesafeler arasındaki farkı kullanın. Sterilize edilmiş bir kalemle kafatası üzerindeki kraniyotomi koordinatlarını işaretleyin.
    NOT: Ölçülen bregma-lambda mesafesi 4,2 mm'den farklıysa, koordinatların orantılı olarak ölçeklendirilmesi gerekir. Stereotaksik bir atlasta bildirilen tüm AP koordinatları, standartlaştırılmış bir bregma-lambda mesafesine karşılık gelir. Bir fare kafatasının boyutu değişken olduğundan, koordinatlarınızı buna göre ayarlamanız önemlidir.
  13. Stereotaksik bir mikromanipülatör kullanarak, kafa plakasını doğrudan lambda sütürünün üzerine yerleştirin ve kafa plakasına ve çevresine diş çimentosu uygulayarak kafatasına sabitleyin (Şekil 3A,B). Çimentonun kuruması için en az 10 dakika bekleyin.
  14. İki kortikal elektrot (frontal ve parietal korteks) ve referans elektrot (beyincik) görevi görecek bir elektrot için çapak delikleri (0,5 mm çapında) açın. Kaplanmış gümüş tel elektrotların soyulmuş uçlarını (0,5 mm) çapak deliklerine yerleştirin ve ultraviyole ışıkla etkinleştirilen reçine kullanarak sabitleyin.
  15. Kaplanmış paslanmaz çelik telleri, hiçbir telin açığa çıkmaması için diş çimentosu ile tamamen kaplayın. Kulaklığın alt ve yan taraflarını, sıkıca yerine oturacak şekilde diş çimentosu ile örtün. Kulaklık yerine sabitlendikten sonra bregma ve lambda dikişlerinin görünür kaldığından emin olun (Şekil 2B).
  16. Farenin en az 7 gün iyileşmesine izin verin, herhangi bir düzensizlik için hayvanı ve cerrahi bölgeyi günlük olarak inceleyin. Gerektiğinde analjezikler (Carprofen 2.5 mg / kg, SC) uygulayın.

2. Silikon prob yerleştirme ve kayıt

  1. Fareyi kayıt donanımına ve kafa sabitlemeye alıştırın (iki ayrı günde en az 1.5 saat) (Şekil 2D).
  2. Kayıt gününde, fareyi anestezi odasına yerleştirin (Isoflurane% 1.5 -% 3 oksijende).
  3. Fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin, burun konisini ve kafa çubuklarını 1.3'te açıklandığı gibi ayarlayın. Stereotaksik cerrahi boyunca anesteziyi koruyun (Oksijende izofluran% 1.5 -% 3). Anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak parmağı sıkışma testi yapın.
  4. Gözlere oftalmik merhem sürün ve yeterli vücut ısısını koruyun.
  5. İki anatomik yer işareti arasında 100 μm'den fazla yükseklik farkı olmadığından emin olarak bregma ve lambda'yı tanımlayın.
  6. Steril bir kalemle kafatası üzerinde hesaplanan koordinatları bulun ve işaretleyin, ardından koordinatların etrafında 2 mm x 2 mm kraniyotomi penceresinin bir taslağını oluşturun.
  7. Anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak parmağı sıkıştırma testi yapın.
  8. 2 mm x 2 mm kraniyotomi penceresi oluşturmak için yüksek hızlı bir matkap kullanın. Beyin yüzeyinin kurumasını önlemek için 0.5-1 mL normal salin uygulayın. Bir şırınga iğnesi ve ince forseps kullanarak durayı çıkarın.
    NOT: Aşırı kanamayı önlemek için ana damarlara (superior sagital sinüs, transvers sinüs) dikkat edin (Şekil 3).
  9. Silikon probun referans elektrodu için genellikle kafatası penceresinden ~1-2 mm uzakta ayrı bir çapak deliği oluşturmak için yüksek hızlı bir matkap kullanın.
  10. Ekli aplikatörü kullanarak kraniotomiyi tamamen kapatmak için kafatasına 0.2 mL düşük toksisiteli silikon yapıştırıcı uygulayın.
  11. Farenin yaklaşık 1 saat iyileşmesine izin verin.
  12. Kafa plakasını ve vidaları kullanarak farenin kafasını elektrofizyoloji kayıt donanımına sabitleyin (Şekil 2D).
  13. Silikon prob şaftını floresan boya DiI (1:4 DiI:Etanol) ile kaplayın, böylece prob yörüngesi deneyden sonra yeniden yapılandırılabilir.
  14. Probu manipülatöre monte edin ve istenen açıyı ayarlayın. vlPAG'ı hedeflemek için 15-20°'lik bir AP açısı uygulandı.
  15. Kayıt probunu, kraniyal pencerenin ortasındaki beyin yüzeyine indirin. İlk olarak, probu manuel olarak ~300 μm derinliğe yerleştirin. Bu derinliğe yerleştirildikten sonra, doku hasarını en aza indirmek içinprobu otomatik olarak (örn. 200 μm/dak) hedeflenen derinliğe yavaşça indirin 21 (Şekil 2C).
    NOT: Probun manuel olarak yerleştirilmesi başlangıçta önerilir. Manuel prob yerleştirme, ilk yerleştirmede bükülmesi durumunda probun durdurulmasını ve geri çekilmesini sağlar. Prob dokuya tamamen nüfuz ettikten sonra, otomatik modda probundan inmeye devam etmek genellikle güvenlidir.
  16. Kurumasını önlemek için kraniyotomi penceresi içindeki beyin yüzeyine mineral yağ sürün.
  17. Kayıt probunun yerleştirildikten sonra 10 dakika oturmasına izin verin.
  18. Bir Intan Kayıt Kontrolörü kullanarak silikon probdan ve ECoG'den 30 kHz'de veri kaydedin.
  19. Kayıttan 1-2 saat sonra, beyni% 4 paraformaldehit22'de sabitlemek için transkardiyal perfüzyon tekniğini kullanın.
    NOT: Çimento nedeniyle, kafatasının rostral kısmını çıkarmak zor olabilir. Bu nedenle kafatasının sırt kısımlarını çıkararak beynin çıkarılması tercih edilir.
  20. Farenin başını kesin, dorsal taraftaki orta çizgiyi takip ederek boynundan alt çeneye kadar cildi kesin. Kafatasına bağlı kasları ve dokuyu çıkarın, beyne daha kolay erişim için alt çeneyi kesin.
  21. Perfüzyon doğru yapılırsa, beyin biraz küçülmeli ve foramen magnumun dorsal kısmına ince makas sokmak için yeterli alan bırakmalıdır. Oksipital kemikte yaklaşık 1 mm büyüklüğünde bir medial kesi, bir lateral ve bir kontralateral kesim yapın.
  22. Oftalmik forseps kullanarak kafatasının dorsal kısmını dikkatlice çıkarın. Oksipital kemikten başlayın, beynin tüm sırt kısmı açığa çıkana kadar tüm kafatası parçalarını çıkarın.
  23. Beyni dışarı çıkarmak için koku ampullerinden başlayarak beynin altına bir mikro spatula kaydırın.
  24. Perfüze edildikten ve çıkarıldıktan sonra, beyin 4 ° C'de 24-48 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde saklanabilir.

3. Prob yörüngesi rekonstrüksiyonu için histoloji

  1. Bir vibratom kullanarak beyni 70 μm koronal bölümlere ayırın.
  2. Hücre çekirdeklerini lekeleyen bir DAPI montaj ortamı kullanarak bölümleri slaytlara monte edin. Lamel ve slaytları şeffaf oje ile kapatın.
  3. Slaytları bir floresan mikroskobunda görüntüleyin. Kontrastı/parlaklığı, prob izleri net bir şekilde görünecek şekilde ayarlayın. MATLAB kodlarının sorunsuz çalışması için ortaya çıkan tiff görüntü dosyası boyutlarının 10 MB'tan küçük olduğundan emin olun. Bir MATLAB kodu23 kullanarak prob izlerini yeniden oluşturun.

4. Elektrofizyolojik veri analizi

  1. Çevrimdışı algılama ve otomatik sıralama yazılımı (Kilosort) kullanarak silikon probdan kaydedilen nöral sinyalleri analiz edin24.
  2. Phy ile algılanan kümeleri çoklu veya tekli birimler olarak manuel olarak sınıflandırın25. Kümeleri, fizyolojik bir spike dalga formu şekline sahip olduklarında, çapraz korelogramda refrakter bir dönem gösterdiklerinde ve normal bir genlik dağılımı görünümüne sahip olduklarında tek birimler olarak sınıflandırın.
  3. Tek birim verilerini MATLAB'a aktarın ve23'ü analiz edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beş erkek C57BL/6J'ye bir ECoG kulaklık ve kafa plakası implante edildi (Şekil 4A). İyileşmeden sonra, fareler ayrı günlerde iki 1.5 saatlik seans boyunca kafa fiksasyonuna ve elektrofizyoloji kayıt teçhizatına alıştırıldı (Şekil 4B). Daha sonra, 2 mm x 2 mm'lik bir kraniyotomi penceresi oluşturuldu (Şekil 4C) ve fare uyanık ve başı sabit olacak şekilde bir silikon prob yerleştirildi (Şekil 4D). İki tip silikon UCLA probu kullanıldı: (1) 64 M: tek uçlu, 64 elektrotlu bir probu; ve (2) 256 ANS: dört uçlu, 256 elektrotlu bir probu. Sevofluran ve oksijen, elektrofizyoloji teçhizatına sabitlenmiş bir burun konisi kullanılarak uygulandı. Oksijen ve sevofluran seviyeleri, bir hat içi gaz analizörü kullanılarak her 5 dakikada bir izlendi. Transkardiyal perfüzyonu takiben beyin çıkarıldı (Şekil 4E) ve prob yörüngesi için değerlendirildi (Şekil 4F). Kaydedilen aksiyon potansiyelleri daha sonra tek birim verilere dönüştürüldü (Şekil 4G).

Prob yerleşiminin MATLAB23'te geliştirilen mevcut prob rekonstrüksiyon algoritmaları ile doğrulandığı beş kayıt gerçekleştirildi. Bu algoritmalar kullanılarak, silikon probun her bir elektrotu belirli bir beyin yapısına lokalize edildi, böylece beyin içinde prob yerleşiminin üç boyutlu bir perspektifi elde edildi (Şekil 5). Bu rekonstrüksiyon algoritmaları, prob yörüngelerini daha fazla doğrulamak için immünohistokimyasal belirteçlerle birleştirildi (Şekil 6). Veriler daha sonra küratörlüğünde tek birimlerle eşleştirildi (Şekil 7).

Toplam 64 tek nöron yakalandı ve bunların 13'ü vlPAG'da bulunuyordu. Kalan 51 nöron yakın çekirdeklerdeydi: orta beyin, orta beyin retiküler çekirdeği, paratroklear çekirdek, çivi yazısı çekirdek, laterodorsdal tegmental çekirdek, parabrakiyal çekirdek ve üstün serebellar pedinküller. Her faredeki nöronların ateşleme aktivitesi, ısı haritaları olarak sunulur (Şekil 7). Fare 3, düşük kaliteli tek birim kaydı nedeniyle analizden çıkarıldı. Kaydedilen nöronların çoğu, sevofluran anestezisi sırasında ateşlemelerini azalttı.

vlPAG nöronlarının ortalama ateşlenmesi, her fare için 5 dakikalık taban çizgisinde (yani, kaydın 10-15 dakikasında) ve sevofluran sırasında 5 dakikada (yani, kaydın 40-45 dakikasında) karşılaştırıldı. vlPAG ateşlemesi önemli ölçüde azaldı (Şekil 8A) ve ayrıca bu artış tüm vlPAG nöronlarında tutarlıydı (Şekil 8B).

figure-results-1
Şekil 1: Prob yerleştirme için stereotaksik koordinatların hesaplanması. Sol panel: Prob yerleştirme için açılı yaklaşımı hesaplamak için geometriyi kullanma. Bir dik üçgenin aşağıdaki bileşenleri tanımlandı: (a) hedef yapının beyin yüzeyinden DV derinliği (stereotaksik atlas kullanılarak elde edilir), (b) kesinlikle dikey bir iniş varsayılarak AP koordinatı ile hedef yapının AP koordinatı arasındaki mesafe. Sağ panel: (a) ve (b) ile, prob yerleştirmenin AP açısını (β) ve uzunluğunu (c) hesaplamak için Pisagor teoremi kullanılabilir. vlPAG'ı hedeflemek için aşağıdaki koordinatlar kullanıldı: (AP) -3.6 mm, (ML) +0.5 mm, (DV) -4 mm. 20°'lik bir AP açısı (β) kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Başlık plakası implantasyonu ve tek ünite kaydı. (A) İmplantasyon sırasında ECoG kulaklık telinin yerleştirilmesi. (B) ECoG kulaklık ve kafa plakası implantasyonundan sonra fare kafatasının üstten görünümü. (C) Beyne yerleştirilen silikon prob sapları. (D) Silikon prob kaydı sırasında kafasına sabitlenmiş fare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kraniyal pencerenin ana kan damarlarına göre yerleşimi. Superior sagital sinüs ve transvers sinüs işaretli fare beyninin yüzeyindeki vaskülatürün şematik gösterimi. Beyaz kare kraniyal pencerenin konumunu gösterir ve kırmızı nokta prob yerleştirme noktasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Deney tasarımı. Beş erkek C57BL / 6J fareye ECoG kulaklık ve kafa plakası (A) implante edildi. İyileştikten sonra, kafa fiksasyonuna ve kayıt düzeneğine (B) alıştılar. Daha sonra, bir kraniyotomi (C) yapıldı ve fare uyanık ve baş sabit pozisyonda olacak şekilde bir silikon prob yerleştirildi. Uçucu anestezikler ve oksijen bir burun konisi (D) kullanılarak uygulandı. Kayıttan sonra, beyin çıkarıldı (E) ve probun yörüngesini (F) yeniden yapılandırmak için immünohistokimya teknikleri kullanılarak analiz edildi. Kaydedilen aksiyon potansiyelleri daha sonra tek birim veriye (G) dönüştürüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Yeniden yapılandırılmış prob izleri ile beynin 3 boyutlu modeli. Her düz renkli çizgi bir prob yörüngesini temsil eder. Her nokta, koronal beyin dilimlerinde görülebilen DiI boyasının yerini işaretler. Prob yörüngesi, silikon probun her şaftı için yeniden yapılandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: vlPAG içinde prob yerleşiminin post hoc rekonstrüksiyonu. Kaydedilen her fare (1-5) için temsili koronal beyin dilimi, DAPI (mavi) ile boyanmış, beyin bölgelerinin bir taslağı ile prob izlerini ((DiI, kırmızı, yeşil oklarla işaretlenmiş) gösterir. Ölçek çubuğu: 500 μm. Fare 1-3 tek şaftlı silikon problarla (yani 64 kanal) kaydedilirken, fare 4 ve 5 dört şaftlı silikon problarla (yani 256 kanal) kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Sevofluran anestezisi öncesi ve sırasında binned ateşleme aktivitesi. Isı haritaları, bir dakikalık aralıklarla 64 tek nöron tarafından ateşlenen aksiyon potansiyellerinin sayısını temsil eder. Tek nöronlara, prob yörüngesi rekonstrüksiyonuna dayalı olarak bir orijin yapısı atandı. Beyaz kesikli çizgi, sevofluran uygulamasının başladığını gösterir, n = 4 fare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Sevofluran anestezisi sırasında vlPAG nöronlarının ateşlenmesi kaldırıldı. (A) Her fare için anestezi öncesinde ve sırasında ateşlenen ortalama aksiyon potansiyeli sayısı. (B) Her vlPAG nöronu tarafından ateşlenen aksiyon potansiyellerinin sayısı (B). Eşleştirilmiş t-öğrenci testi, **P = 0.0036, P = 0.0053 sırasıyla. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Eşit olmayan kafa plakası yerleşiminin prob yörüngesini nasıl etkileyebileceğine dair örnek. (A) Kafa plakasının fare kafasına eşit olmayan şekilde yerleştirilmesi. (B,C) Kafa plakalarının fare kafasına eşit olmayan şekilde yerleştirilmesinden kaynaklanan kasıtsız bir mediolateral açının olduğu işlenmiş prob yörüngesi ile 3D fare beyni rekonstrüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin sapı çekirdekleri nefes alma, bilinç ve uyku gibi temel işlevlere aracılık eder 26,27,28. Beyin sapının konumu (derin ve arka), standart teknikler kullanılarak in vivo olarak nöronal aktivitesini incelemede bir zorluk teşkil eder. Burada, kafasına sabitlenmiş farelerde tekrarlanabilir tek ünite kaydına izin vermek için açılı bir anterior yaklaşım sunulmaktadır.

Çok elektrotlu silikon probun dikkatli bir şekilde yerleştirilmesi, büyük kan damarlarına zarar vermekten kaçınırken, REM uykusu ile ilgili beyin sapı yapılarının tutarlı bir şekilde hedeflenmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. 13. girişin en iyi koordinatlarını ve yörüngesini çözmek için önemli ölçüde incelik, konsantrasyon ve sabır gerekir.

Açılı prob yörüngesi ve derin yapıları hedeflemek için gereken mesafe nedeniyle, koordinatlardaki ve başlık plakası konumlandırmasındaki küçük tutarsızlıklar bile muhtemelen hedef yapının kaçırılmasına neden olacaktır. Başlık plakası implantasyonu sırasında Bregma ve Lambda'nın aynı seviyede olması ve aralarındaki mesafenin hassas bir şekilde ölçülmesi zorunludur. Özellikle, ameliyatlar stereotaksik bir çerçeve üzerinde yapıldığından ve kayıtlar ayrı bir elektrofizyoloji teçhizatında gerçekleştirildiğinden, kafa plakalarının düz bir kafatasına sabitlenmesi kritik öneme sahiptir. Ek açıların (yani eğik kafa) tanıtılması, özellikle küçük, derin beyin yapıları için yüksek olan hata riskini artırır (Şekil 9).

Silikon problar kırılgan olduğundan, durayı beynin yüzeyinden çıkarmak ve hiçbir kemik parçasının kraniyal pencereyi tıkamadığından emin olmak önemlidir. Dura çıkarıldıktan sonra hafif kanama meydana gelebilir, bu nedenle probun bükülmesine neden olabilecek pıhtılaşmış kanın kraniyotomi yüzeyini temizlemek çok önemlidir. Silikon probunu beyne yerleştirmek zor olursa (örneğin, prob bükülüyorsa), kalan herhangi bir dura olup olmadığını veya beynin yüzeyinin kurumuş olup olmadığını kontrol etmek önemlidir, çünkü çok az sıvı bırakıldığında veya hiç sıvı bırakılmadığında ince bir zar oluşabilir. İnsanlarda27, kan damarlarına yakın alanlar daha kalın bir duraya sahiptir ve benzer bir sorun, damarları yırtmadan duranın çıkarılmasının zor olabileceği farelerde de bulunur. Duranın dikkatli bir şekilde çıkarılması genellikle düzgün prob yerleştirme ile sonuçlansa da, daha büyük yerleştirme açıları ek zorluklar ortaya çıkarabilir.

Kayıtların verimi hayvanlar arasında önemli ölçüde değişebilir ve çok sayıda değişkene bağlıdır. Önemli bir faktör, hedeflenen yapıdaki nöronların yoğunluğudur; Düşük nöron yoğunluğuna sahip alanlar (örneğin, korteks), kaydedilen tek nöronların daha düşük verimine sahip olma eğilimindedir. Ek olarak, beyin yüzeyinin altındaki bir damarın yırtılması gibi doku hasarı, nöronal ölüme veya yaralanmaya yol açarak verimi daha da azaltabilir21,29. Kayıtların kalitesi de çok önemlidir, çünkü daha yüksek kaliteli kayıtlar tek nöronları ayırt etmeyi kolaylaştırır. Hedef dışı bir prob yörüngesi de daha düşük verime neden olabilir. Her ne kadar vlPAG'daki kayıtlar için geliştirilmiş olsa da, bu protokol beyin sapındaki yakındaki yapılardan kayıt yapmak için kullanılabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bu çalışma uyarınca rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 8 ve Şekil 9 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Scott Kilianski'ye MATLAB kodu konusundaki yardımı ve senaryolarını paylaşması için teşekkür ederiz. Anna Grace Carns'a sonda yörüngesinin yeniden yapılandırılmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1024 kanal RHD Kayıt KontrolörüIntan Technologies, Los Angeles, California, ABDC3008Silikon prob kaydı; kayıt donanımı ve yazılımı
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR lamelVWR, Radnor, Pensilvanya, ABD48393-081Histoloji
ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD%4 PFA. AKHistoloji; perfüzyon çözeltisi
C& B metabondPatterson Dental, Richmond, Virginia, ABDtoz: 5533559, hızlı taban: 5533492, katalizör: 55335007Başlık & Kulaklık İmplantasyonu
C57/6J fareler 4-6 hafta, erkeklerJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, Maine, ABD000664
Capnomac UltimaDatex, Helsinki, Finlandiya ULT-SVi-27-07Gaz Analizörü; durduruldu; alternatif gaz analizörü Bionet America 'den satın alınabilir;
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABDV22888Silikon probun kaplanması için kırmızı floresan boya
Konektör BaşlığıDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, ABD1212-1788-NDECoG Kulaklık
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, ABD0100-20Histoloji
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Virginia, ABD044-1113Başlık & Kulaklık İmplantasyonu; için  Paslanmaz çelik tellerin kafatasına sabitlenmesi
Düşük toksisiteli silikon yapıştırıcıWorld Precision Instruments, Sarasota, Florida, ABDKWIK-SILBaşlık
Mikro Manipülatör SistemiYeni Ölçek Teknolojileri, Victor, New York, ABDÇoklu Prob Manipülatörü: XYZ Sahne Montajı: 06464-0000, MPM Sistem Kiti: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM Manuel Kollar için MPM halkası, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Silikon prob kaydı; Probun beyne yerleştirilmesi
MikroproblarUCLA, Los Angeles, Kaliforniya, ABD256 ANS, 64MDurduruldu; alternatif silikon problar Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, ABD'denM8410-100MLSilikon prob kaydı; kayıt sırasında dokunun kurumasını önlemek
Normal tuzlusu ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABDZ1376Başlık & Kulaklık İmplantasyonu; Ameliyat sırasında beynin kurumasını önlemek
PFA Kaplı Paslanmaz Çelik Tel Çapı 0.008 inç. çizgili uçlarla kaplanmışA-M sistemleri, Sequim, Washington, ABD791400ECoG Kulaklık ve ECoG için referans elektrodu 
Platin tel 24AWG World Precision Instruments, Sarasota, Florida, ABDPTP201Silikon prob kaydı için referans elektrodu 
Shandon Colorfrost Plus mikroskop slaytlarıThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD99-910-01Histoloji
Paslanmaz çelik BaşlıkStar Rapid, Çinısmarlama parçaBaşlık & Kulaklık İmplantasyonu; tasarım istek üzerine mevcuttur
Stereotaksik cihazKOPF, Tujunga, California, ABDModel 940 Dijital Ekranlı Küçük Hayvan Stereotaksik Alet KonsolBaşlığı & Kulaklık İmplantasyonu
PBS J61899'da satın alınabilir.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Related Articles