Bu çalışma, mikroalglerden yağda çözünen pigmentlerin ekstrakte edilmesi ve miktarının belirlenmesi için Jeffrey ve Humphrey tarafından geliştirilen yöntemin kullanılmasının avantajlarını vurgulamaktadır. Bu yöntem, büyüme faktörlerinin bu organizmalarda klorofil üretimi ve hücresel içerik üzerindeki etkisini değerlendirmek için değerli bir araç olarak hizmet eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Büyüme Faktörlerinin Mikroalglerden Klorofil a ve b Üretimi Üzerine Etkisinin Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroalgler iki ana pigment grubu içerir: klorofiller ve karotenoidler. Klorofil, organik bileşiklerin sentezini kolaylaştırmak için ışık enerjisini emen ve onu kimyasal enerjiye dönüştüren yeşil bir pigmenttir. Bu pigment, yüksek antioksidan özellikleri ve renklendirme yetenekleri nedeniyle gıda, ilaç ve kozmetik endüstrilerindeki biyoteknolojik girdi ürünleri için değerli bir birincil kaynak görevi görür. Bu araştırmanın amacı, TaguchiL4 deneysel tasarımı aracılığıyla büyüme faktörlerinin (CO2 konsantrasyonu, açık renk ve ışık yoğunluğu) hücre büyümesi ve Chlorella sorokiniana'daki klorofil a ve b'nin hücresel içeriği üzerindeki etkisini değerlendirmek ve ardından Haematococcus pluvialis kullanılarak yöntemin doğrulanmasıydı ek bir çalışma modeli olarak mikroalgler. Hücre büyümesi, 550 nm dalga boyunda optik yoğunluk spektrofotometrik tekniği kullanılarak ölçüldü. Klorofillerin miktar tayini için,% 90 saf aseton çözeltisi kullanılarak bir hücre ekstraktı elde edildi ve daha sonra, klorofil a ve b konsantrasyonları, Jeffrey ve Humphrey tarafından açıklanan yönteme göre 647 nm ve 664 nm dalga boylarında spektrofotometrik teknikler kullanılarak ölçüldü. Deneysel sonuçlar, düşük CO2 ilavesi, mor ışık ve düşük ışık yoğunluğu koşullarının kontrol edilmesinin hem hücre büyümesini hem de hücreler içindeki klorofil a ve b konsantrasyonunu artırdığını göstermiştir. Bu klorofil miktar tayin yönteminin uygulanması, klorofil içeriğinin hızlı, basit ve kesin bir şekilde belirlenmesine olanak tanır, çünkü kullanılan dalga boyları her iki klorofil tipinin de absorbans zirvelerinde olduğundan, bu tekniği incelenen herhangi bir mikroalg için kolayca tekrarlanabilir hale getirir.
Giriş
Son yıllarda, antropojenik faaliyetlerin neden olduğu artan çevre sorunları ve bunların ekosistemlerin sağlığı ve dengesi üzerindeki olumsuz etkileri, daha verimli ve çevre dostu üretim sistemleri arayışlarını artırmıştır. Bu, endüstrilerdeki süreçleri hızlandırdı ve bu zararlı etkileri azaltmak için biyoremediasyon tedavilerinin uygulanmasını ve biyo bileşiklerin geliştirilmesini teşvik etti1.
Bu bağlam, mevcut çevresel ve ekonomik zorluklara yenilikçi çözümler bulma ihtiyacından kaynaklanan mikroalg çalışmalarında önemli bir büyümeye yol açmıştır. Mikroalgler, sırasıyla güneş ışığını ve karbondioksiti enerji ve karbon kaynağı olarak kullanarak su ortamlarında gelişir. Bu özellik, onları çeşitli değerli ürünler üretmek için sürdürülebilir ve gelecek vaat eden bir alternatif haline getirir. Bu alandaki araştırmalar, bu hücrelerin fizyolojisini ve metabolizmasını anlamanın yanı sıra bunların yetiştirilmesi ve işlenmesi için verimli teknolojiler geliştirmeye odaklanmıştır2.
Araştırma süreçlerini hızlandırmak ve fizyolojileri, metabolizmaları ve potansiyel uygulamalarının anlaşılmasını derinleştirmek için mikroalgleri incelemek için erişilebilir ve güvenilir araçlar geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır. Bu araçlar, çevresel ve üretim faktörlerinin, bu organizmaların sağlığının ve gelişiminin temel bir göstergesi olan klorofil konsantrasyonu gibi temel parametreler üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlamalıdır. Klorofil içeriğindeki bir azalma çevresel stresi, beslenme eksikliklerini veya hastalıkları gösterebilir.
Bu yeşil pigmentler fotosentezde çok önemli bir rol oynar, karbondioksit ve suyu glikoz ve oksijene dönüştürmek için güneş ışığı enerjisini yakalar ve mikroalglerin3 biyokütlesinin %0,5 ila %5'ini oluşturur. Klorofiller, yaşam süreçlerini sürdürmedeki temel rollerinin ötesinde, çeşitli endüstrilerde uygulamalar bulmuştur. Klorofil özleri, yiyecek ve içecek işlemede doğal renklendiriciler olarak kullanılır, ürünlere canlı yeşil tonlar verirken aynı zamanda antioksidan özellikler de sağlar. Ayrıca, klorofil bazlı takviyeler, iddia edilen detoksifiye edici ve antienflamatuar etkileri nedeniyle sağlık ve zindelik sektöründe popülerlik kazanmaktadır. Endüstriler, klorofilin çok yönlü özelliklerinden yararlanarak hem görsel çekiciliğe hem de tüketici refahına katkıda bulunan yenilikçi ürünler geliştirebilir1.
Bu bağlamda, biyoteknolojik önemi büyük olan bir mikroalg C . sorokiniana'dır. Bu mikroorganizma, hızlı büyüme hızıyla öne çıkıyor ve bu da onu biyokütle üretiminde oldukça verimli hale getiriyor. Ek olarak, C. sorokiniana , proteinler, lipitler ve vitaminler dahil olmak üzere yüksek oranda besleyici bileşiklerden oluşan çeşitli içerikler sergiler ve bu da onu gıda, yem ve biyoyakıt üretimindeki çeşitli uygulamalar için değerli kılar2. Ayrıca, bu mikroalg türünün, atık su arıtma, biyoremediasyon ve farmasötik gibi biyoteknolojik uygulamalar için olanaklar yaratarak, çeşitli işlevlere sahip hücre dışı enzimler ürettiği bulunmuştur4. Hızlı büyümesi ve çok yönlü uygulamalarına ek olarak, C. sorokiniana ayrıca klorofil üretimi için önemli bir potansiyel göstermektedir. Fotosentetik bir mikroorganizma olarak C. sorokiniana , mikroalglerin3 biyokütlesinin %0,5 ila %5'ini oluşturan klorofil sentezi için gerekli mekanizmaya sahiptir. Bu yetenek, C. sorokiniana'yı ticari ölçekte klorofil üretimi için çekici bir aday haline getirir ve acil çevresel ve beslenme sorunlarına sürdürülebilir bir çözüm olmayı vaat eder5.
Öte yandan, önemli ilgi çeken bir başka mikroalg türü de H. pluvialis'tir. Bu mikroalg, çok sayıda endüstriyel uygulamaya sahip güçlü bir antioksidan pigment olan astaksantin üretimi ile ünlüdür. Astaksantin, H. pluvialis fotosistemi için koruyucu bir mekanizma görevi görür ve onu çevresel faktörlerin neden olduğu oksidatif stresten korur. Bu pigment, antioksidan özellikleri ve potansiyel sağlık yararları nedeniyle kozmetik, nutrasötikler ve su ürünleri yetiştiriciliği endüstrilerinde çok aranır. Astaksantin üretme kabiliyeti ile H. pluvialis , çeşitli endüstriyel ve tüketici ihtiyaçlarına hitap eden yenilikçi ürünler geliştirmek için umut verici bir yol sunmaktadır6.
Son çalışmalar ayrıca H. pluvialis1'in klorofil üretimi için potansiyelini vurgulamış ve endüstriyel önemini daha da artırmıştır. Örneğin, bir çalışma, değişen büyüme koşulları altında H. pluvialis'in klorofil içeriğini araştırdı ve optimal yetiştirme parametreleri altında, H. pluvialis'in diğer mikroalg türlerinin oranlarını aşan dikkate değer klorofil üretim oranları sergilediğini buldu7. Bu bulgu, H. pluvialis'in sürdürülebilir bir klorofil kaynağı olarak potansiyelinin altını çizmekte ve çeşitli endüstriyel sektörlerde kullanımı için yeni fırsatlar sunmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kültür ortamının hazırlanması ve aşı hazırlığı
- 1 L 3N-BBM + V (CCAP) büyüme ortamı hazırlayın (Makro besinler: NaNO3 [0.75 g L-1], CaCl2 [0.019 g L-1], MgS04 [0.019 g L-1], K2HPO4 [0.057 g L-1], NaCl [0.025 g L-1], KH2PO4 [0.175 g L-1]; mikro besinler: Na2 EDTA [0.0186 g L-1], FeCl3 [0.0024 g L-1], MnCl2 [0.001 g L-1], ZnCl2 [1.25 x 10-4 g L-1], CoCl2 [5 x 10-5 g L-1], Na2MoO4 [9.98 x 10-5 g L-1])8 ve 121 ° C ve 1.5 psi'de 15 dakika sterilize edin.
- Mikroalg C. sorokiniana için yaklaşık 3 x 106 hücre mL-1 konsantrasyonunda 1 L büyüme ortamı içeren bir şişeyi aşılayın; veya büyüme ortamına% 5 ila% 10 (h / h) inokülum ekleyin.
NOT: Steril koşulları korumak için laminer akış başlığı, eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz maskesi kullanılması önerilir. - Aşılanmış şişeyi, yaklaşık yoğunluğu 3.600 ila 4.200 lux olan kırmızı ışık kaynakları altında, 22-26 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, C. sorokiniana için 12 saat ışık ve 12 saat karanlık fotoperiyodu ve H. pluvialis için 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodu ile inkübe edin ve her 24 saatte bir manuel olarak çalkalayın, her iki suş için yaklaşık 7 gün.
NOT: C. sorokiniana için en az 7-10 gün (yoğun bir yeşil renk elde edene kadar) ve H. pluvialis için 10-12 gün büyüme koşulları altında koruyun. Kinetikte aşı görevi görecek mikroalg konsantresini elde etmek için, üretilen alglerden süpernatan ortamın uzaklaştırılması gerekir. - Steril bir ortamda, steril 15 mL konik santrifüj tüplerini yaklaşık 10 mL aşılanmış ortamla doldurun ve 25-30 °C'nin altında 20 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Steril koşullar altında, bir mikropipet kullanarak veya biyokütleyi steril bir 50 mL konik santrifüj tüpüne dökerek ve konsantre ederek süpernatanı çıkarın.
- Kinetik için gerekli inokülum hacmi elde edilene kadar bu işlemi gerektiği kadar tekrarlayın.
- Mikroalglerin hücre konsantrasyonunu belirlemek için aşının optik yoğunluğunu (OD550 nm) ölçün ve kullanıma hazır olana kadar 3-4 °C sıcaklıkta saklayın.
NOT: Doğrudan hücresel sayım başlangıçta hücre konsantrasyonunu absorbans ile ilişkilendirmek için yapıldı. Sayıldıktan sonra, aşı en fazla 4 gün boyunca buzdolabında saklanabilir.
2. Büyüme kinetiğinin incelenmesi
- Her deney için uygun olan gerekli 3N-BBM+ V(CCAP) HACMINI ( C. SOROKINIANA için fotobiyoreaktör seviye testleri için 8 L ve H. pluvialis için şişe seviyesi testler için 0,5 L) standart laboratuvar prosedürlerine göre hazırlayın ve uygun sterilizasyonu sağlayın.
- Hem fotobiyoreaktör hem de şişeler için, ışık kaynağını istenen renk spektrumuna göre yapılandırın (460 nm'de mavi, mor, C. sorokiniana için 460 nm ve 630 nm karışımı ve H. pluvialis için 630 nm'de kırmızı); Harici ışık girişimini önlemek için her iki sistemi de örtün.
NOT: Her bir ışık yayan diyottan yayılan dalga boyundaki değişiklik nedeniyle, her bir diyotun9 dalga boyunu ve emisyon gücünü belirlemek için ışık kaynakları üzerinde bir spektroradyometre kullanılarak spektroradyometri gerçekleştirildi. Mor ışık, kırmızı ve mavi LED'lerin birleştirilmesiyle elde edildi, bu da mavi LED'ler için 1,65 W nm-1 emisyon gücüyle 460 nm ve kırmızı LED'ler için 0,6 W nm-1 emisyon gücüyle 630 nm dalga boylarıyla sonuçlandı. Bu ölçümler yalnızca mavi ve kırmızı ışık altında yapılan testler için kullanılmıştır. - Zamanlayıcıyı, C. sorokiniana için 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık döngü ve H. pluvialis için 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık döngü arasında geçiş yapacak şekilde programlayın.
- C. sorokiniana için 12 saatlik aralıklarla karbondioksit beslemesi sağlamak için CO2 havalandırma sistemini fotobiyoreaktör kültür kabına bağlayın.
- 3 x 105 hücre mL-1 veya optik yoğunlukta eşdeğeri (OD550 nm) = 0.180'lik bir başlangıç hücre yoğunluğu elde etmek için kültür kabını yeterli hacimde ön aşılama ile aşılayın.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için aşılama sırasında aseptik teknikten emin olun. - Hücre büyümesini ve fizyolojik parametreleri izlemek için kültürü C. sorokiniana için 12 saat ve H. pluvialis için 8 saat düzenli aralıklarla örnekleyin. Kültürün bütünlüğünü korumak için steril teknikler kullanarak örnekler toplayın.
3. Klorofillerin miktar tayini
NOT: Hücresel miktar tayini için veriler Ek Dosya 1'de verilmiştir.
- Numunenin 40 mL'sini plastik konik santrifüj tüplerine yerleştirin.
- 15 ° C'de 20 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon veya bir Pasteur pipeti kullanarak atın.
- Oksidasyonu önlemek için hücre peletini alüminyum folyo ve vidalı kapakla kaplı bir cam tüpe aktarın.
- Hücre peletini bir girdap kullanarak 3 mL %90 saf aseton çözeltisi ile yeniden süspanse edin.
- Askıya alınmış numuneyi bir buz banyosunda her biri 5 dakikalık iki döngü boyunca sonikasyon yapın ve 16 saat10 boyunca 4 ° C'de dinlendirin.
- 16 saat sonra, önceki adımda (adım 3.5) belirtilen aynı koşullar altında tekrar sonikasyon yapın ve daha önce açıklanan koşullar altında (adım 3.2) tekrar santrifüjleyin.
- Pigment ekstraktını bir Pasteur pipeti kullanarak ayırın ve ışıktan korunan başka bir temiz tüpe aktarın.
- 630 nm, 647 nm ve 664 nm dalga boylarında bir spektrofotometrede okumak için pigment ekstraktını bir kuvars hücresine yerleştirin.
NOT: Spektrofotometreyi önceden %90 aseton ile kalibre edin. - Klorofil konsantrasyonlarını hesaplamak için aşağıdaki denklemleri11 kullanın:
Klorofil A = 11.93 A664 - 1.93 A647
Klorofil b = 20.36 A647 - 5.50 A664
NOT: Sonuçlar, ekstrakt hacmi ile çarpılan ve kültürün μg mL-1'inde klorofil konsantrasyonları elde etmek için numunenin mL sayısına bölünen μg mL-1 ekstrakt cinsinden ifade edilir. - μg chl hücresi-1'deki değerleri elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın:
μg chl hücresi-1 = 1 mL kültürde μg chl / kültürdeki [hücreler mL-1] hücre konsantrasyonu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Klorofil hücresel konsantrasyonundaki değişiklikleri tespit eden tekniğin etkinliğini gözlemlemek ve büyüme faktörlerinin etkisini değerlendirmek için C. sorokiniana, CO2 hacim ilavesi, ışık rengi ve ışık yoğunluğunu değerlendiren bir Taguchi L4 deney tasarımı kurulmuştur. Her faktör, Tablo 1'de gösterildiği gibi, Tablo 2'deki deney tasarımı tarafından tanımlanan koşullar altında düşük ve yüksek seviyelerde değerlendirildi.
Deney...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
H. pluvialis ve C. sorokiniana arasındaki karşılaştırmalı çalışma, klorofil üretim dinamiklerinde önemli farklılıklar olduğunu ortaya koydu. H. pluvialis deney boyunca klorofil konsantrasyonunda bir azalma sergilerken, C. sorokiniana sabit bir artış gösterdi. Ek olarak, başlangıçta her iki türde de daha düşük bir klorofil a oranı vardı, ancak bu oran, belirli dalga boylarının seçiciliği veya maruz kalması yoluyla söz konusu klorofillerin üreti...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, Institutos Tecnologicos Federales için Bilimsel Araştırma, Teknolojik Gelişme ve Yenilik Çağrısı (16898.23-P) kapsamında TecNM'den sağlanan kısmi finansmanı minnetle kabul ederler. Ayrıca Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo'nun (FCCHTI23_ME-4.1.-0001) desteğini de takdir ediyorlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | Aseton %90 |
| 15 mL tüp | Biologix | 10-9502 | Test tüpü |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Sonikatör |
| 5 mL vidalı kapaklı test tüpü | Kimax | 45066-13100 | Test tüpü |
| 50 mL santrifüj tüpü | Biologix | 10-9151 | Test tüpü |
| Alüminyum folyo | Reynolds | 611 standart, 12 "x 1000 fit | Test tüpü kapağı |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | Kalsiyum Klorür |
| Santrifüjü | Dynamica | 14 R | Santrifüj Soğutmalı |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | Kobalt diklorür |
| FeCl3 | Merck | 157740 | Demir (III) Klorür |
| K < alt > 2 < / sub >HPO< sub>4< / sub> | Meyer | 2051-250 | Dipotasyum Fosfat |
| KH2< / sub>PO4 | Meyer | 2055-250 | Monopotasyum Fosfat |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | Magnezyum Sülfat Mikropipet |
| LabNet | Modeli Beta-Pette | Mikropipet | |
| MnCl2 | Merck | 429449 | Manganez(II) Klorür |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Edetato Disodyum Tuzu Dihidrat |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | Sodyum Molibdat |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | Sodyum Klorür |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | Sodyum Nitrat |
| RGB LED şerit | Steren | GAD-LED2 | Işık kaynak |
| Spektrofotometre | PerkinElmer | Model Lambda35 | Spektrofotometre |
| spektroradyometre | Gigahertz-Optik | model BTS256 | |
| Vorteks | Bilimsel Endüstriler | Vortex-Genie® 2 | Vorteks |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | Çinko Klorür |
Kaynaklar
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
