Yöntem makalesi

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

DOI:

10.3791/67237

⸱

11 Nisan 2025

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), camsı buzda asılı duran makromoleküler yapıların doğal koşullara yakın koşullarda incelenmesini sağlayarak yapısal biyolojide devrim yaratmıştır. Bu teknik, proteinlerin ve diğer biyomoleküllerin kristalizasyona ihtiyaç duymadan yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine olanak tanıyarak işlevleri ve mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sunar. Tek parçacık analizindeki son gelişmeler, gelişmiş hesaplamalı veri işleme ile birleştiğinde, cryo-EM'yi modern yapısal biyolojide vazgeçilmez bir araç haline getirmiştir. Artan benimsenmesine rağmen, cryo-EM, özellikle düzensiz partikül dağılımı olmak üzere etkinliğini sınırlayabilecek kalıcı zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sorun genellikle yeniden yapılandırılmış protein yapılarında düşük çözünürlüğe ve düşük doğruluğa yol açar. Bu makale, örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii'den (MjsHSP16.5) elde edilen küçük ısı şoku proteinini kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmek için basit ve pratik bir yaklaşımı özetlemektedir. Yöntem, tercihli adsorpsiyonu en aza indirmek için numune hazırlamayı optimize ederek daha homojen partikül dağılımı ve daha yüksek kaliteli protein cryo-EM yapıları sağlar. Bu teknik, yapısal çalışmalarda benzer zorlukların üstesinden gelmeyi amaçlayan araştırmacılar için değerli bir rehberlik sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem cihaz donanımı 1,2 hem de görüntü işleme yazılımı 3,4,5'teki son gelişmelerle birlikte, kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), modern yapısal biyolojide popüler ve güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu atılımlara rağmen, cryo-EM kullanarak yüksek çözünürlüklü makromoleküler yapıların elde edilmesinde darboğazlar devam etmektedir. Bu tür önemli zorluklardan biri, ağırlıklı olarak hava-su arayüzü 6,7,8,9'da gözlenen oryantasyon tercihi fenomeni de dahil olmak üzere eşit olmayan parçacık dağılımıdır.

Numune vitrifikasyonu sırasında, bazı moleküller kendilerini ızgara üzerindeki belirli eksenler boyunca hizalama eğilimi gösterir. Bu, nihai veri kümesinde parçacık görünümlerinin eşit olmayan bir dağılımına yol açar. Bazı yönelimler aşırı temsil edilirken, diğerleri yetersiz temsil edilebilir veya tamamen yok olabilir, bu da toplam protein mimarisinin eksik örneklenmesine neden olur. Proteinin tercihen elektron demetine doğru yönlendirilen bölgeleri, yoğunluk haritasında daha belirgin görünürken, ışından uzağa yönlendirilen bölgeler zayıf bir şekilde çözülebilir veya tamamen eksik olabilir10,11. Sonuç olarak, eşit olmayan parçacık dağılımı, nihai yeniden yapılandırılmış üç boyutlu (3D) yapıya potansiyel sapmalar ve artefaktlar getirir. Özellikle, alfa sarmalları ve beta tabakaları gibi temel yapısal elemanlar çarpık hale gelebilir, amino asit veya nükleotid zincirleri parçalanmış görünebilir ve spesifik protein veya nükleik asit segmentlerinin yoğunlukları bozulma gösterebilir12. Sonuç olarak, bu yanlış beyanlar, biyolojik moleküllerin yapısını ve işlevini doğru bir şekilde çözmek için büyük bir zorluk teşkil etmektedir.

Şu anda bu tür zorlukların üstesinden gelmek için numune hazırlama optimizasyonu 13,14,15, ızgara işleme 16,17,18,19,20,21,22 ve veri toplama stratejisi23 dahil olmak üzere çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanılmaktadır. Özellikle, mümkün olduğunda numune hazırlama aşamasında zorluğun ele alınması tavsiye edilir7. Numune hazırlamadaki yaygın optimizasyonlar arasında tampon bileşiminin değiştirilmesi, küçük moleküler veya makromoleküler bağlayıcı ortakların tanıtılması, molekül içi çapraz bağların oluşturulması ve çeşitli deterjanlar yer alır. Bu aynı zamanda zar proteinleri24,25 için de geçerlidir, ancak deterjanların özellikle saflaştırma ve stabilizasyon amaçları için kullanılması gerekir. Bunlar arasında, protein tamponu optimizasyonunun özelleştirilebilirliği, maliyet etkinliği ve yaygın erişilebilirliği, onu çoğu laboratuvarda tercih edilen bir strateji haline getirmektedir. Bu yaklaşım, her bir protein numunesinin özel gereksinimine uyacak şekilde çeşitli parametrelerin hassas ve anında ayarlanmasına olanak tanır. Yinelemeli iyileştirme sayesinde, araştırmacılar çeşitli tampon koşullarını sistematik olarak test edebilir ve tercih edilen yönelimleri en aza indirmeyi ve kriyo-EM verilerinin genel kalitesini iyileştirmeyi amaçlayan çeşitli parametreleri ayarlayabilir. Basitçe protein tampon bileşenlerinin değiştirilmesi ve konsantrasyonlarının ayarlanması, yüzey yükünü modüle ederek protein stabilitesini etkilemede etkinlik göstermiştir, sonuç olarak camsı buz25 içindeki protein davranışını etkiler. Bu nedenle, protein tampon bileşimini optimize etmek, kriyo-EM'deki yaygın zorlukları ele almak için en uygun ve basit yaklaşımlardan biri olarak kabul edilir.

Burada, kriyo-EM'deki ortak bir engeli ele almak için bir protokol önerilmektedir - eşit olmayan parçacık dağılımının üstesinden gelmek. Bu protokolde, ızgara hazırlığı ile tamamlanan protein hazırlama ve tampon taraması için temel prosedürler, bir vaka çalışması olarak Methanocaldococcus jannaschii'den (MjsHSP16.5)26 küçük bir ısı şoku proteini kullanılarak özetlenmiştir (Şekil 1). Bu sHSP doğal olarak kararlıdır, monomer başına 16.5 kDa'lık bir moleküler kütleye sahiptir ve 24 mer'lik bir oktahedral kafese26,27 monte edilir, bu da onu kriyo-EM ile yapısal analiz için çekici bir aday haline getirir. Bununla birlikte, kriyo-EM veri toplama sırasında eşit olmayan bir parçacık dağılımının gözlemlenmesi beklenmiyordu ve deneyler sırasında önemli bir zorluk olarak ortaya çıktı. Ayrıca, benzer zorluklarla mücadele eden araştırmacılar için faydalı olan potansiyel yaklaşımlar tartışılmakta ve böylece kriyo-EM kullanılarak makromoleküler yapıların verimli bir şekilde aydınlatılması kolaylaştırılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Protein saflaştırma

  1. E. coli BL21 (DE3) içinde rekombinant MjsHSP16.5'in ekspresyonunu indükleyin ve daha önce tarif edildiği gibi bir nikel şelatlama kromatografi sütunu kullanarak proteini saflaştırın26. Boyut dışlama kromatografisi (SEC) sütunu26'da saflaştırmanın ardından, %12.5'lik bir SDS-PAGE jele 5 μL tepe fraksiyonu yükleyerek ve standart Coomassie mavisi boyama28 ile görselleştirerek protein saflığını inceleyin (Şekil 2).
  2. MjsHSP16.5 içeren havuz fraksiyonlarını, üreticinin talimatlarına göre 50 kDa moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip santrifüj filtreler kullanarak 4 ° C'de yaklaşık 65 mg / mL'ye konsantre edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Protein toplanmasını önlemek için santrifüjleme sırasında her 5 dakikada bir protein solüsyonunu nazikçe pipetleyin.
  3. Konsantrasyondan sonra, agregaları çıkarmak için numuneyi 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı 0.2 mL ince duvarlı PCR tüplerinde 50 μL'lik hacimlere ayırın, tüpleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve numuneleri daha fazla kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.

2. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme için protein hazırlama

  1. İki donmuş protein tüpünü buz üzerinde çözdürün. Çözüldükten sonra, homojenliği sağlamak için tüpü birkaç kez hafifçe vurarak çözeltiyi nazikçe karıştırın ve agregaları çıkarmak için protein çözeltisini 16.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı bir SEC kolonuna enjekte edin ve 0.5 mL elüsyon fraksiyonlarını toplayın.
  3. 280 nm'de en yüksek UV emilimini sergileyen zirveye karşılık gelen elüsyon fraksiyonlarını toplayın ve Bradford tahlili29'u kullanarak bu fraksiyonlardaki protein konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: Aşağı akış uygulamaları için tek bir tepe fraksiyonunda yeterli protein konsantrasyonunu sağlamak için, kolonun önerilen kapasitesi içinde kalırken SEC kolonuna yüksek miktarda protein numunesi yüklenmesi gereklidir.

3. Tampon değişimi

  1. İstenen tampon çözeltisini hazırlayın (9 mM MOPS-Tris (pH 7.2), 50 mM NaCl ve 0.1 mM EDTA), tamponları 50 mL'lik beherlere ayırın ve tampon beherlerini 4 °C'de tutun.
    NOT: Hedef protein biyokimyası hakkındaki ön bilgilere dayanarak, 20 mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl ve 0-5 mM DTT gibi farklı bileşimlere (tampon türleri, pH ve iyonik kuvvet) sahip çeşitli tampon çözeltileri hazırlayın, aşağı akış şebeke hazırlığında optimum protein çözünürlüğünü, homojenliğini ve stabilitesini destekleyen koşulları belirlemek için.
  2. Diyaliz membranını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Diyaliz membranını makas kullanarak 30 mm x 30 mm'lik parçalar halinde kesin. Bu zarları damıtılmış su veya tampon çözeltilerde inkübe ederek dengeleyin (Şekil 3A).
  4. 50 μL'lik mikrodiyaliz düğmelerinin haznesine 55 μL protein çözeltisi (yaklaşık 2.5 mg / mL) ekleyin (Şekil 3B).
  5. Diyaliz membranını forseps kullanarak dikey olarak tutun ve fazla sıvıyı boşaltmak için membranın bir kenarını kağıt mendile hafifçe dokundurun (Şekil 3C). Mikrodiyaliz haznesine hava kabarcığı girmediğinden emin olarak mikrodiyaliz düğmesini membranla dikkatlice kapatın (Şekil 3D). O-ringi diyaliz membranının üzerine yerleştirin. O-ringi yavaşça düğmenin kenarındaki oluğa yuvarlayın.
  6. Alternatif yöntem: O-ringi bir golf tişörtünün ekseni boyunca yerleştirin ve golf tişörtünü zarın üzerine baş aşağı yerleştirin (Şekil 3E). O-ringi, düğmenin kenarına kayana kadar golf tişörtünden aşağı yavaşça kaydırın (Şekil 3F). O-ringi dikkatlice düğmenin kenarındaki oluğa yönlendirin (Şekil 3G).
  7. Her diyaliz düğmesini, membran tarafı yukarı bakacak şekilde hedef tamponu içeren ayrı bir behere daldırın (Şekil 3H).
  8. Diyaliz işlemi sırasında beherleri 4 °C'de tutun. Diyaliz tamponunu 2 saat sonra değiştirin ve gece boyunca diyalize devam edin.
  9. İnce iğneli bir şırınga kullanın (ör., Hamilton şırıngası veya insülin şırıngası) membranı dikkatlice delmek ve protein çözeltisini mikrodiyaliz odasından geri kazanmak için (Şekil 3I). Protein örneğini daha fazla kullanılana kadar buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Bradford tahlili29'u kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

4. Izgara hazırlığı

  1. Uygun ızgara türünü seçin.
    NOT: Bakır destek üzerindeki amorf delikli karbon film yaygın olarak kullanılır. Karbon film kalınlığı, delik boyutu ve ağ sayısı istenen buz kalınlığına göre seçilmelidir. MjsHSP16.5'in numune hazırlanması için Holey karbon kaplı ızgaralar kullanıldı.
  2. Izgara deliklerine zarar vermemek için cımbız kullanarak ızgaraları kenarlarından nazikçe kavrayın. Izgaraları, karbon tarafı yukarı bakacak şekilde bir ızgara tutucuya yerleştirin. Izgara tutucuyu kızdırma deşarj sisteminin haznesine yerleştirin.
  3. Şebekeyi hidrofilik hale getirmek için 15 mA'da 60 s boyunca kızdırma deşarjı gerçekleştirin. Bu işlem sırasında negatif bir yük uygulanması önerilir.
    NOT: Önerilen parametreler, bu çalışmada kullanılan kızarma deşarj sistemi için bir başlangıç noktası görevi görür. Kızdırma deşarjı cihaz tipine bağlı olarak ve belirli ızgara malzemeleri için istenen hidrofiliklik seviyesini elde etmek için optimizasyon gerekli olabilir. Plazma temizliği için, hidrojen veya argon-oksijen karışımları gibi alternatif gazları veya gaz karışımlarını test etmeyi düşünün.
  4. İsteğe bağlı adım: açık bir cam şişede %99 amilamin gibi ek kimyasal çözeltileri, ızgara üzerinde özel olarak net bir pozitif yük oluşturmak için ızgara tutucunun yanındaki bir odaya sokun.
  5. Optimum performansı sağlamak için boşaltılan ızgaraları 0,5-1 saat içinde kullanın.

5. Negatif leke ızgarası hazırlığı

  1. 5 μL numune (50-300 nM veya 20-120 ng/mL) kızdırma deşarjlı ızgaraya yükleyin. Proteinlerin çökelmesini kolaylaştırmak için numunenin ızgara yüzeyinde 1 dakika boyunca rahatsız edilmeden dinlenmesine izin verin.
  2. Bir parafin film tabakası üzerinde her biri 50 μL'lik üç su damlası hazırlayın. Izgara yüzeyini ilk su damlasının yüzeyine sürterek numuneyi ızgara üzerinde nazikçe yıkayın. Kalan iki su damlası ile yıkama adımını tekrarlayın.
    NOT: Yıkama süreleri, her deneyin özel gereksinimlerine göre optimize edilebilir.
  3. Filtrelenmiş %1 (a/h) uranil asetat çözeltisinden 5 μL'yi ızgaraya yükleyin ve uranil asetat çözeltisini hemen pipetleyin.
  4. Izgaraya 5 μL daha %1 (a/h) uranil asetat çözeltisi yükleyin. Izgaranın boyama için uranil asetat çözeltisinde 90 saniye inkübe etmesine izin verin.
    NOT: Boyama süresi belirli numunelere göre ayarlanabilir ve optimize edilebilir.
  5. Fazla leke solüsyonunu çıkarmak için ızgaranın cımbız tarafına filtre kağıdı ile hafifçe dokunun. Izgaranın oda sıcaklığında tamamen kurumasına izin verin. Kurutulmuş ızgarayı, gözlem yapılana kadar oda sıcaklığında bir ızgara kabında saklayın.

6. Örnek vitrifikasyon

  1. Protein örneğini istenen konsantrasyona seyreltin.
    NOT: Protein konsantrasyonu, her delikteki parçacık sayısını en üst düzeye çıkaracak kadar yüksek, ancak tek parçacıkların dağılımını sağlayacak kadar düşük olmalıdır. Cryo-EM protein konsantrasyonları tipik olarak 0.5 ila 2 mg / mL arasında değişir. Bununla birlikte, bazı proteinler, moleküler ağırlıklarına ve spesifik numune hazırlama koşullarına bağlı olarak, bu aralığın dışındaki konsantrasyonlar gerektirebilir.
  2. Agregaları çıkarmak için numuneyi 16.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  3. Daldırmalı dondurma aletini açın. Nemlendirici haznesini damıtılmış su ile doldurun. Filtre kağıtlarını halkalarla leke pedlerine monte edin. Vitrifikasyon parametrelerini ayarlayın (sıcaklık: 4 °C, nem: %100, leke süresi: 6 sn, leke kuvveti: 5 birim, bekleme süresi: 10 sn).
    NOT: Leke süresi ve kuvveti, vitrifikasyon cihazı optimizasyonu için önemli parametrelerdir, çünkü ızgaradan suyun uzaklaştırılması ve hava-su arayüzüne partikül maruziyeti ayrışma veya oryantasyon yanlılığına neden olabilir.
  4. Pirinç kap, ızgara kutusu tutucusu, örümcek ünitesi ve kontaminasyon önleyici halka dahil olmak üzere kriyojen kabı bileşenlerini taban tepsisine monte edin. Tepsiyi sıvı nitrojenle doldurarak kap tertibatını soğutun. Pirinç kabı kriyojen (sıvı etan) ile doldurun. Kriyojen erime sıcaklığına ulaştığında örümcek ünitesini çıkarın.
  5. Cımbızı ve ızgara tertibatını cihaza monte edin, numuneyi (tipik olarak 4 μL) ızgaranın karbon tarafına yükleyin ve daldırmalı dondurma işlemini başlatın.
  6. Cımbızı aletten dikkatlice çıkarın, ızgarayı bir saklama ızgarası kutusuna yerleştirin ve kutuyu kapakla kapatın. Vitrifiye edilmiş numuneleri içeren ızgara kutusunu sıvı nitrojen içinde saklayın.

7. Izgaraların TEM'e yüklenmesi

  1. Otomatik şebeke montaj istasyonunu monte edin ve sıvı nitrojen ile soğutun.
  2. Vitrifiye ızgaraları içeren ızgara kutusunu yerleştirin ve ızgaralara erişmek için kapağı dikkatlice çıkarın. Monte edilmiş ızgaraların kolay aktarımı için yakınına boş bir otomatik şebeke saklama kutusu yerleştirin.
  3. Otomatik ızgara halkasını montaj istasyonunda halka için belirlenen kesme alanına yerleştirin. Vitrifiye ızgarayı ızgara kutusundan dikkatlice hareket ettirin ve otomatik ızgara halkasının içine sığdırın. Izgara ve halkanın hizalandığından emin olun.
  4. Daire açıklığını otomatik ızgara halkasının ve ızgara düzeneğinin üstüne yerleştirmek için diski hizalayın. Izgarayı otomatik ızgara halkasına sabitlemek için, C-klipsi yerleştirme aracını ızgaranın üzerine yerleştirin ve içindeki C-klipsi tıklamak için hafifçe aşağı bastırın.
  5. Diski geri döndürün ve monte edilmiş ızgaraları otomatik ızgara saklama kutusuna taşıyın.
  6. Kaset yükleme istasyonunu monte edin ve yükleme istasyonunu sıvı nitrojen ile soğutun.
  7. Autogrid saklama kutusunu yükleme istasyonuna yerleştirin. Izgara tertibatını otomatik ızgara saklama kutusundan kasete taşıyın ve doğru yerleştirmeyi sağlamak için ızgaraya hafifçe vurun.
  8. Kaseti otomatik yükleyici kapsülüne yerleştirmek için kolu kullanın. Serbest hareketini doğrulamak ve donmadığından emin olmak için otomatik yükleyicideki pimi kontrol edin.
  9. Şebeke gözlemi için otomatik yükleyici kapsülünü TEM'e yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MjsHSP16.5 için en uygun ızgara koşullarını belirlemek için, öncelikle çeşitli protein tampon koşullarının incelenmesine odaklanan bir ilk kriyo-EM taraması yapıldı: (1) MjsHSP16.5'in stabilitesini ve homojenliğini sağlayan ve kristalleşmesi için önemli olan son saflaştırma tamponu30; (2) yüksek kırınım kalitesine sahip MjsHSP16.5 kristallerinin30 büyümesi için gerekli koşullardan uyarlanmış tamponlar; ve (3) daha önce MjsHSP16.5 31,32'nin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm protein yapısal çalışmaları, doğal işlevselliklerini korurken yüksek saflık ve homojenliğe sahip protein hedeflerinin izole edilmesi arasında bir denge sağlamak için yinelemeli bir süreç olan protein saflaştırması ile başlar. Protein numunelerini saflaştırmak ve korumak için tampon bileşimleri saflaştırma işlemi sırasında dikkatli bir şekilde seçilse de, bu tamponlar sonraki kriyo-EM numune hazırlama ve görüntüleme sırasında sıklıkla zorluklar ortaya çıkar6. B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma Tesisleri Kooperatif Merkezi'ne (CCRF) (Sungkyunkwan Üniversitesi, Kore) kriyo-EM tesislerine cömertçe erişim izni verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından KKK'ya (No. 2021M3A9I4022936) finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi ile desteklenmiştir. NEXUS konsorsiyumunun kriyo-EM tesislerinin kullanımı, Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibesi RS-2024-00440289 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL Yuvarlak Tabanlı BoruSPL Yaşam Bilimleri40114
250 & mikro; L Gaz Geçirmez Şırınga Modeli 1725 LTNHamilton81100Çimentolu İğne, 22s ölçü, 2 inç, nokta stili 2
50 ve mikro; l Diyaliz düğmesiHampton ResearchHR3-326
50 mL Cam BeherDIAMONDHA.1010D.50
ä KTA saf 25 LCytiva29018224FPLC
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre ÜnitesiMilliporeUFC90502450-KDa NMWL
Bradford ReaktifiSupelcoB6916
Dumoxel Stil N5Dumont0103-N5-PO
Buzullar 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 sayfaCytiva28989335
Mikro Santrifüj Tüpü 1.5 mLHD MikroH23015
PCR Tüpleri 0.2 mL, düz kapakAxygenPCR-02-C
PELCO easiGlow Kızdırma Deşarj ünitesiTed Pella91000
PELCO TEM ızgara tutucu blokTed Pella16820-25
Kuantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu ElektronMikroskobu BilimlerQ2100CR1.3
Spectra / Por 3 RC Diyaliz Membran Tüpü ve nbsp;Fisher Scientific086705B3500 Dalton MWCO
Superose 6 Artış 10/300 GLCytiva29091596
Uranil asetatMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase Tampon Tarama Kiti ve DeterjanlarThermoFisher ScientificA49856

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0. Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  4. Punjani, A., Fleet, D. J. 3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em. Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).
  5. Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models. Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).
  6. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and "visual proteomics". Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).
  7. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).
  8. Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. Challenges in making ideal cryo-Em samples. Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).
  9. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis. J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  10. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nat Commun. 8 (1), 629(2017).
  11. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  12. Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning. Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).
  13. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).
  14. Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).
  15. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  16. Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core. Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).
  17. Nguyen, T. H. D., et al. Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution. Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).
  18. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).
  19. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids. J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).
  20. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).
  21. Patel, A. B., et al. Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA. Science. 362 (6421), eaau8872(2018).
  22. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).
  23. Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  25. Xu, Y., Dang, S. Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em. Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).
  26. Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii. Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).
  27. Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).
  28. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J Vis Exp. (16), e758(2008).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Kim, K. K., et al. crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).
  31. Kim, R., et al. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).
  32. Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding. J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).
  33. Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).
  34. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).
  35. Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).
  36. D'arcy, A. Crystallizing proteins - A rational approach. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).
  37. Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).
  38. Zhang, C. Y., et al. A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).
  39. Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).
  40. Michon, B., et al. Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation. Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).
  41. Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM. Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).
  42. Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective. Q Rev Biophys. 49, e13(2016).
  43. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  44. Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR. J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).
  45. Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy. J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).
  46. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  47. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  48. Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. Cryo-EM: Beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek Par ac k AnaliziProtein Yap s G rselle tirmeGe irimli Elektron MikroskobuDald rma DondurmaBoyut D lama KromatografisiDiyaliz MembranPar ac k Da l mGlow Discharge Izgara

İlgili makaleler