Method Article

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

DOI:

10.3791/67237

⸱

April 11th, 2025

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), camsı buzda asılı duran makromoleküler yapıların doğal koşullara yakın koşullarda incelenmesini sağlayarak yapısal biyolojide devrim yaratmıştır. Bu teknik, proteinlerin ve diğer biyomoleküllerin kristalizasyona ihtiyaç duymadan yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine olanak tanıyarak işlevleri ve mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sunar. Tek parçacık analizindeki son gelişmeler, gelişmiş hesaplamalı veri işleme ile birleştiğinde, cryo-EM'yi modern yapısal biyolojide vazgeçilmez bir araç haline getirmiştir. Artan benimsenmesine rağmen, cryo-EM, özellikle düzensiz partikül dağılımı olmak üzere etkinliğini sınırlayabilecek kalıcı zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sorun genellikle yeniden yapılandırılmış protein yapılarında düşük çözünürlüğe ve düşük doğruluğa yol açar. Bu makale, örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii'den (MjsHSP16.5) elde edilen küçük ısı şoku proteinini kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmek için basit ve pratik bir yaklaşımı özetlemektedir. Yöntem, tercihli adsorpsiyonu en aza indirmek için numune hazırlamayı optimize ederek daha homojen partikül dağılımı ve daha yüksek kaliteli protein cryo-EM yapıları sağlar. Bu teknik, yapısal çalışmalarda benzer zorlukların üstesinden gelmeyi amaçlayan araştırmacılar için değerli bir rehberlik sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem cihaz donanımı 1,2 hem de görüntü işleme yazılımı 3,4,5'teki son gelişmelerle birlikte, kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), modern yapısal biyolojide popüler ve güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu atılımlara rağmen, cryo-EM kullanarak yüksek çözünürlüklü makromoleküler yapıların elde edilmesinde darboğazlar devam etmektedir. Bu tür önemli zorluklardan biri, ağırlıklı olarak hava-su arayüzü 6,7,8,9'da

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Protein saflaştırma

  1. E. coli BL21 (DE3) içinde rekombinant MjsHSP16.5'in ekspresyonunu indükleyin ve daha önce tarif edildiği gibi bir nikel şelatlama kromatografi sütunu kullanarak proteini saflaştırın26. Boyut dışlama kromatografisi (SEC) sütunu26'da saflaştırmanın ardından, %12.5'lik bir SDS-PAGE jele 5 μL tepe fraksiyonu yükleyerek ve standart Coomassie mavisi boyama28 ile görsell....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MjsHSP16.5 için en uygun ızgara koşullarını belirlemek için, öncelikle çeşitli protein tampon koşullarının incelenmesine odaklanan bir ilk kriyo-EM taraması yapıldı: (1) MjsHSP16.5'in stabilitesini ve homojenliğini sağlayan ve kristalleşmesi için önemli olan son saflaştırma tamponu30; (2) yüksek kırınım kalitesine sahip MjsHSP16.5 kristallerinin30 büyümesi için gerekli koşullardan uyarlanmış tamponlar; ve (3) daha önce MjsHSP16.5 31,32'nin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm protein yapısal çalışmaları, doğal işlevselliklerini korurken yüksek saflık ve homojenliğe sahip protein hedeflerinin izole edilmesi arasında bir denge sağlamak için yinelemeli bir süreç olan protein saflaştırması ile başlar. Protein numunelerini saflaştırmak ve korumak için tampon bileşimleri saflaştırma işlemi sırasında dikkatli bir şekilde seçilse de, bu tamponlar sonraki kriyo-EM numune hazırlama ve görüntüleme sırasında sıklıkla zorluklar ortaya çıkar6. B.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma Tesisleri Kooperatif Merkezi'ne (CCRF) (Sungkyunkwan Üniversitesi, Kore) kriyo-EM tesislerine cömertçe erişim izni verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından KKK'ya (No. 2021M3A9I4022936) finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi ile desteklenmiştir. NEXUS konsorsiyumunun kriyo-EM tesislerinin kullanımı, Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibesi RS-2024-00440289 tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 mL Yuvarlak Tabanlı BoruSPL Yaşam Bilimleri40114
250 & mikro; L Gaz Geçirmez Şırınga Modeli 1725 LTNHamilton81100Çimentolu İğne, 22s ölçü, 2 inç, nokta stili 2
50 ve mikro; l Diyaliz düğmesiHampton ResearchHR3-326
50 mL Cam BeherDIAMONDHA.1010D.50
ä KTA saf 25 LCytiva29018224FPLC
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre ÜnitesiMilliporeUFC90502450-KDa NMWL
Bradford ReaktifiSupelcoB6916
Dumoxel Stil N5Dumont0103-N5-PO
Buzullar 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 sayfaCytiva28989335
Mikro Santrifüj Tüpü 1.5 mLHD MikroH23015
PCR Tüpleri 0.2 mL, düz kapakAxygenPCR-02-C
PELCO easiGlow Kızdırma Deşarj ünitesiTed Pella91000
PELCO TEM ızgara tutucu blokTed Pella16820-25
Kuantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu ElektronMikroskobu BilimlerQ2100CR1.3
Spectra / Por 3 RC Diyaliz Membran Tüpü ve nbsp;Fisher Scientific086705B3500 Dalton MWCO
Superose 6 Artış 10/300 GLCytiva29091596
Uranil asetatMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase Tampon Tarama Kiti ve DeterjanlarThermoFisher ScientificA49856

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Sc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Electron MicroscopySample PreparationSingle Particle AnalysisProtein Structure VisualizationTransmission Electron MicroscopyPlunge FreezingSize Exclusion ChromatographyDialysis MembraneParticle DistributionGlow Discharge Grid

Related Articles