Yöntem makalesi

At Enterik Glial Kültürü ve At Kolikinde Nöral İnflamatuar Mekanizmanın Çalışmasına Uygulama

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

Bu makalede

Özet

Enterik glia, postoperatif komplikasyonlar da dahil olmak üzere bağırsak homeostazı ve hastalık süreçlerindeki rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Acil keşif laparotomisinden iyileşen at hastaları, yüksek inflamatuar postoperatif durum riskinden muzdariptir ve bu da çalışma için tekrarlanabilir at enterik glial primer hücre kültürü oluşturmanın önemini vurgulamaktadır.

Özet

At kolikinin (akut karın) enflamatuar postoperatif koşulları, yalnızca müşteri maliyetinin artmasına, hasta rahatsızlığına ve hastanede kalış süresine katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda birçok durumda yaşamı tehdit edici olduğunu kanıtlar. Eşsiz bir bağırsak hücresi popülasyonu olan enterik glia, gastrointestinal ortamı algılamadaki ve çevredeki hücre tipleriyle iletişim kurmadaki rolleri nedeniyle giderek daha fazla kabul görmektedir. Enterik glia ve bağırsak epiteli arasındaki etkileşimler, at enterik gliasının sağlık ve kolikteki iltihabı modüle etmek için mukozal bariyeri nasıl değiştirebileceğini belirlemede kritik olabilir.

Bu etkileşimi incelemek için, at jejunumundan primer at enterik glial kültürleri oluşturmak ve kültürleri kolikte mevcut olduğu bilinen enflamatuar koşullara maruz bırakmak için bir yöntem sunuyoruz. Primer enterik glial kültürler, kolik ile ilgisi olmayan nedenlerle ötenazi yapılan yetişkin atlardan elde edildi. İntestinal villus ve lamina propria, submukozayı ortaya çıkarmak için mikrodiseke edildi. İzole edilen submukozaya 2-3 saat boyunca kollajenaz, proteaz ve sığır serum albümini ile enzimatik sindirim uygulandı. Daha sonra, santrifüjleme, pipetleme ve hücre süzgeçlerini (40-100 μm) içeren mekanik sindirim, ~ 400.000 hücre / 300 μL ortam konsantrasyonunda 0.05 mg / mL poli-L-lizin kaplı kuyucuklar üzerinde kaplama için kullanılan bir pelet verdi.

Birleşme ve ilk geçişi takiben, enterik glial hücreler daha sonra 24 saat boyunca at rekombinant IL-1β'ya (0, 10, 25 ng) maruz bırakıldı. Kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için, çift elektrotlu bir EndOhm odası kullanılarak transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçülürken, kontrol veya tedavi edilen enterik glia tarafından koşullandırılan ortam, doğrudan birleşik at jejunal tek katmanlarına eklendi. Bu veriler, at enterik glial kültürünün birçok potansiyel etkili uygulamasından sadece birini göstermektedir.

Giriş

At kolik, acil konsültasyon için en sık tıbbi başvuru şikayetidir1. Bu atların %17'sine kadar cerrahi düzeltme gerektiğinden, ameliyat sonrası sonuçları artırma çabaları at tıbbi araştırmalarının ön saflarında yer almalıdır2. Şu anda, postoperatif kolik hastaları, sepsis/endotoksemik şok (hastaların %12,3'ü) ve postoperatif ileus (hastaların %13,7'si) dahil olmak üzere yaşamı tehdit eden çeşitli bozukluklar için yüksek risk altındadır3. Postoperatif komplikasyonların tedavisindeki ilerlemeye rağmen, bu durumların önlenmesi veya tedavisi için ileri tedavilere ihtiyaç duyulmaya devam etmektedir.

Son araştırmalar kolik hastalarının lokal ve sistemik inflamatuar durumunu vurgulamıştır4. Örneğin, tümör nekroz faktörü (TNF) alfa, interlökin 1β (IL-1β), interlökin 6 (IL-6) ve monosit kemoatraktan protein-1 gibi proinflamatuar proteinlerin tümünün, normal bağırsak dokusuna göre kolik bağırsak mukozasında ekspresyonda önemli ölçüde arttığı gösterilmiştir4. Sistemik bir bakış açısından, bağırsak dokusunda artmış TNF alfa'nın, postoperatif dismotilitenin genel bir ölçümü olan 2 L'den daha büyük postoperatif nazogastrik reflü riskinin artması ile ilişkili olduğu gösterilmiştir4. İnterlökin IL-1β ve TNF alfa uygulamasının septik şok5'in klinik belirtilerini indükleyebildiği de bilinmektedir.

Kolik bağırsak dokusunun enflamatuar durumu ve bunun postoperatif komplikasyonlarla bağlantısı için potansiyel bir açıklama bağırsak epitel bariyeridir. Sağlıkta, bağırsak yolunu kaplayan tek kolumnar epitel tabakasını birbirine bağlayan sıkı bağlantı kompleksleri, luminal içeriğin ve bakteri bileşenlerinin submukozal boşluğa ve kan dolaşımına ulaşmasını sınırlamak için fonksiyonel bir bariyer sağlar. Ancak ameliyat sırasında kolikle ilişkili barsak tıkanıklığı ve barsak manipülasyonu sonucu oluşan şişkinlik ve hasar, bu barsak bariyer fonksiyonunu bozabilir.

Bir bütün olarak bağırsak duvarının fonksiyonel bileşenleri açısından, enterik sinir sistemi içindeki submukozal enterik glial ağın, inflamatuar yolaklarla ilişkili postoperatif komplikasyonların patofizyolojik gelişiminde çok önemli olduğu ve spesifik bir terapötik hedef sağlayabileceği gösterilmiştir 6,7,8,9 . Enterik glia sadece tüm gastrointestinal sistem boyunca mevcut olmakla kalmaz, aynı zamanda bağırsak ortamının sensörleri olarak işlev görür, bağırsak duvarının çok sayıda hücre tipi ile sinyalleşmeyi etkiler ve bağırsak bariyerinidoğrudan düzenler 6. Bu nedenle, bağırsağın bu güçlü sensörlerinin yaralanma ve iltihaplanma ile aktive edileceğini ve bariyer geçirgenliğindeki değişiklikler gibi akut bir yanıt üretebileceğini varsaymak haklıdır.

Bu çalışma, at enterik glia kültürünü ve daha spesifik olarak, inflamatuar at enterik glia'nın bağırsak bariyer fonksiyonu üzerindeki rolünü tanımlayan ilk çalışmadır. Burada, at submukozal enterik gliasının birincil kültür yöntemlerini ve bunların inflamatuar IL-1β'ya maruz kalmaya yanıtlarını, IL-1β maruziyeti sonrası enterik glial ürünlerin at enterosit tek tabakalarının geçirgenliği üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini ve at serumu uygulaması yoluyla olası blokajı sunuyoruz.

Protokol

At enterik glial primer kültürleri, bu çalışma ile ilgisi olmayan nedenlerle aşırı dozda barbitürat ile insanca ötenazi yapılan üç attan elde edildi. Kültür çalışmaları için seçilen atlar, mevcut gastrointestinal hastalık öyküsü olmayan yetişkin atlardı.

1. Submukozal at enterik glial primer kültür

  1. Üç ayrı yetişkin at atından elde edilen jejunal kriptlerden at epitel tek katmanları yetiştirin.
    1. 24 oyuklu plakaları 37 ° C'de 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kaplama solüsyonu ile kaplayın, 2 kez steril suyla yıkayın ve hücreler kaplamaya hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
    2. İnsancıl ötenaziyi takiben, 60 dakika içinde jejunumun bir bölümünü çıkarın ve buz üzerinde soğuk Ringer solüsyonuna yerleştirin.
    3. Jejunumdan 10 cm'lik bir kısmı çıkarın ve lenfoid olmayan bölgeleri dokunun merkezinde tutmak için antimesenterik sınırda açın. Parçayı yaklaşık 7 cm x 7 cm'lik bir bölüme kesin. Diseksiyondan önce dokuyu taze Ringer solüsyonunda iyice durulayın.
    4. Dokuyu soğuk Ringer solüsyonunda veya PBS mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı bir Petri kabına sabitleyin ve dokuyu mümkün olduğunca gerin (Şekil 1A).
    5. Yaklaşık 5 cm x 5 cm boyutlarındaki lenfoid olmayan bölgeden lamina propria tabakasını kıvrık forsepsli barsak villusları (Şekil 1B) ve ardından lamina propria tabakasını çıkarın.
      NOT: Bu tabakalar submukozadan kolayca ayrılır (Şekil 1B).
    6. Bir köşede mikrodiseksiyon makası ile serbest bırakarak bir tabaka halinde submukozayı çıkarın ve submukozayı jejunumun iç dairesel kas tabakasından soyarken doğal ayrılmayı gözlemleyin (Şekil 1D).
    7. Toplanan submukozal tabakayı 2-5 mm'lik parçalar halinde doğrayın ve 5 mL "Organo-FBS" (Tablo 1), 0.825 mg kollajenaz, 5 mg proteaz ve 20 mg sığır serum albümini içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Enzimatik sindirim için dokuyu 37 ° C'de 2-3 saat inkübe edin.
    8. İnkübasyonun ardından, enzim etkisini durdurmak için 10 mL oda sıcaklığında "Organo + FBS" ekleyin. Hücreleri dokudan ayırmak için doku karışımını 10 mL'lik bir serolojik pipetle yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
    9. Süpernatanı atın ve hücreleri dokudan ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet ile yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 10 mL oda sıcaklığında PBS ile yeniden süspanse edin.
    10. Konik tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri dokudan ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet ile yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 10 mL oda sıcaklığında "Organo + FBS" ile yeniden süspanse edin.
    11. Hücreleri 100 μm, 70 μm ve ardından 40 μm gözenek boyutunda hücre süzgecinden seri olarak süzün.
    12. Filtrelenmiş hücreleri ve ortamı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL "Organo + FBS" içinde yeniden süspanse edin.
    13. Canlı hücreleri tanımlamak için tripan mavisi ile boyayın ve bunları bir hemositometre ile sayın.
    14. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 300 μL'lik "Organo + FBS" içinde yaklaşık 400.000 hücreyi tohumlayın ve her oyuğa büyüme faktörleri ekleyin: N2 5 μL/kuyucuk, G5 5 μL/kuyucuk ve B27 10 μL/kuyucuk. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için 24 oyuklu plakayı %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Yirmi dört saat sonra, ortamı yukarıdaki büyüme faktörleriyle "glia media" (Tablo 1) olarak değiştirin ve her 48 saatte bir değiştirin (Şekil 2).

2. İmmünofloresan sitoloji

  1. Enterik glial hücreleri birincil kültürden (P0) (adım 2.1.14) %70-80 birleşime kadar büyütün ve bir kez geçirin (P1).
  2. % 0.1 PBS azid uygulamasından önce 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak% 0.1 birincil kültür (P0) hücrelerini kuyucuklara sabitleyin.
  3. PBS azid,% 4 eşek serumu ve% 0.5 Triton-X'ten oluşan doygunluk solüsyonu hazırlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca geçirgen hale getirmek için kuyucuklara 300 μL doygunluk çözeltisi ekleyin.
  4. Glial markör, glial fibriler asidik protein (GFAP) için birincil antikoru ve fibroblast markörü için birincil antikoru, alfa düz kas aktini, 4 °C'de gece boyunca inkübasyon için doygunluk çözeltisinde 1: 1.000 dilüsyonda ekleyin.
  5. Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594 ve keçi anti-fare IgG Alexa Flour 488 için ikincil antikor eklemeden önce 2-3 saat boyunca doygunluk çözeltisinde 1:500 seyreltmede 3x'i PBS ile yıkayın.
  6. Çekirdekleri 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile PBS'de 1: 1,000 seyreltmede 5 dakika boyayın.
  7. PBS ile üç yıkamadan sonra, hücreleri% 0.1 PBS azid içinde saklayın.

3. Submukozal at enterik glial primer kültür IL-1β maruziyeti

  1. İlk geçitten (P1) gelen hücreler %70-80 birleşmeye ulaştığında, IL-1β maruz kalma deneyini gerçekleştirin. Kuyuları 24 saat boyunca 0 ng, 10 ng ve 25 ng IL-1β'ya maruz bırakın. 24 saat sonra, her bir kuyucuğun ortamını -80 °C'de saklayın ve saklayın.

4. Enterosit tek tabakalarının üretimi için at organoid kültürü

NOT: Stewart ve ark. 2018'de yayınlanan protokol, kriyobanked edilmiş banklı at bağırsak kriptleri ve tomurcukları 2D enteroid çalışmaları için genişletildi10.

  1. Transwell eki başına yaklaşık 700-1.000 tomurcuk / kript parçası (tek hücrelere ayrıldığında 40.000-50.000 hücre) kullanın. Enterositlerin eklenmesinden önce transwell eklerini 42 μL% 0.05 Matrigel ile kaplayın. 37 oC'de 1 saat inkübe ederek Matrigel'in ek parçaya sabitlenmesine izin verin Ekstra ortamı aspire edin ve transwell'lerin üstü açık olarak 30 dakika kurumasını bekleyin. Her bir transwell ekine 200 μL DMEM-F12 ortamı ekleyin ve plakayı kullanana kadar 37 °C'de saklayın.
  2. Organoidleri içeren Matrigel köftelerini PBS ile yıkayın ve ardından buz üzerindeyken 500 μL Hücre Geri Kazanımına maruz bırakın. Hücrelerin 15 mL'lik bir tüpe tam olarak toplanmasını sağlamak için bunları tekrar tekrar pipetleyin.
  3. Tüpü 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini bağırsak epitel kök hücre (IESC) ortamının hedef hacminde askıya alın. İstenilen tek katman sayısını 200 μL ortamla çarparak hedef hacmi hesaplayın. (Tablo 1).
  4. 1 mL'lik bir şırıngayı IESC ortamında önceden kaplayın ve hücre süspansiyonunu 16 G'lik bir iğne ile aspire edin. 16 G'lik iğneyi 28 G'lik bir iğne ile değiştirin ve organoidlerin ayrılmasını teşvik etmek için hücre süspansiyonunu içinden çıkarın.
  5. Elde edilen hücre süspansiyonunun 200 μL'sini kaplanmış transwell'lerin apikal tarafına ve 500 μL IESC'yi ve ayrıca transwell insert'in10 bazal tarafına daha önce tarif edilen büyüme faktörlerini yerleştirin. Birleşme noktasına ulaşılana kadar ortamı ve büyüme faktörlerini her 24-48 saatte bir değiştirin. Birleşmeyi, 1.000 ohmsxcm'lik bir TEER'ye karşılık gelen hücre yoğunluğu olarak tanımlayın 2,11. Ölçüm için adım 5.1'e bakın.

5. İnflamatuar sitokinlere ve at enterik glial ürünlerine maruz kaldıktan sonra at enterosit tek tabaka geçirgenliği

  1. Tek katmanlar boyunca TEER'i ölçmek için çift elektrotlu bir TEER ölçüm odası kullanın ve her bir transwell geçirgen membran boyunca bir baz okuması oluşturun. Ölçüm yapmadan önce IESC ortamının ve transwell'in oda sıcaklığına gelmesi için 15 dakika olduğundan emin olun. Kültür kabını 1,5 mL IESC ortamı ile doldurun ve ölçüm sırasında sıvı çizgilerinin eşleşmesi için transwell ekinde tam olarak 200 μL ortam bulunduğundan emin olun.
  2. Transwell eklerinin bazolateral yönünü, kuyucuk başına 25 ng IL-1β, 10 ng ve 25 ng interlökin 6 (IL-6) inflamatuar sitokinlere veya 10 ng veya 25 ng IL-1β'ya maruz kalan kültürlerin glial ürünlerine maruz bırakın. Kontrol transwell eklerinin bazolateral yönünü glia ortamına ve IL-1β'ya maruz kalmayan kültürlerden glia ortamına maruz bırakın.
  3. TEER'i 10-15 dakikalık aralıklarla 45 dakika boyunca ölçün ve her bir transwell'i kültür kabına yerleştirin.

6. İstatistik

  1. 0, 10, 20, 30 ve 45 dakika zaman noktaları için her bir transwell'in TEER'inin kat değişimini hesaplayın.
  2. Tercih edilen yazılımı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), azalmış TEER ile IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng ve 100 ng) ve glia ortamına (0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β ve 25 ng IL-1β'ya maruz kalan) bazolateral maruziyet arasındaki korelasyonları karşılaştırın.

Sonuçlar

Daha fazla enzimatik ve mekanik sindirim ile at jejunumunun submukozal tabakaya (Şekil 1) mikrodiseksiyonu, at enterik gliasının canlı hücre kültürlerini üretebilir. Hücreler, diğer türlerin enterik glia'sı ile tutarlı iğ şeklindeki hücrelerin baskınlığı ile bir pleomorfizm gösterdi (Şekil 2A). Kültürler, düşük fibroblast kontaminasyonu ile seçici glial markör, glial fibriler asidik protein (GFAP) için pozitifti (alfa SMA, Şekil 2B). Bazı durumlarda, submukozal tabakaların mikrodiseksiyonu yeterince yüksek derecede kontrol edilemedi ve kültürler, fibroblast belirteci düz kas aktininin immünofloresan yoluyla gözlenen yüksek yüzdelerde fibroblast ile kontamine oldu (Şekil 3).

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

Bu çalışmanın amacı, at submukozal enterik gliasının primer kültürü için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmek ve kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için uygulamasını göstermekti. Atta yeni olan enterik glia izolasyonu ve kültürünün, domuz ve kemirgen modellerinde ve insanlarda bağırsak hastalık yolaklarını anlamada faydalı olduğu kanıtlanmıştır 6,7,13,14. Bu hücre popülasyonunu incelemek, bağırsak ortamının subepitel sensörleri olarak rollerinin yanı sıra bağırsak duvarı içindeki çevredeki hücrelerle etkileşime girme ve onlarla iletişim kurma yetenekleri nedeniyle potansiyel olarak önemlidir. Keskin algılama yetenekleriyle, bağırsak dokusunun distansiyon, iskemi ve potansiyel olarak cerrahi manipülasyon ile strese girdiği at koliğinde glia'nın potansiyel olarak kritik bir rolünü hayal etmek zor değildir6.

Lisowski ve ark. kolik cerrahisi sırasında at bağırsak dokusunun artmış inflamatuar durumunu göstermiştir. Bu enflamatuar ortamın hafifletilmesinin önemi, bağırsak bariyer fonksiyonunu bozma kabiliyetine sahip ürünleri sentezleyebildiği kanıtlanmış kemirgen enterik glia kültürleri ile vurgulanmaktadır 7,12. Bağırsak lümen içeriğinin bağırsak duvarına sızması sadece enflamatuar bir yanıta yol açmakla kalmaz, aynı zamanda dolaşıma potansiyel infiltrasyona da yol açabilir ve bu da endotoksemik şok / sepsise neden olabilir. At kolik postoperatif hastalar ne yazık ki sepsis ve postoperatif ileus dahil olmak üzere çok sayıda inflamatuar temelli postoperatif komplikasyonla boğuşmaktadır, bu sadece sağkalımı ve hasta konforunu azaltmakla kalmaz, aynı zamanda hasta maliyetlerini ve duygusal sıkıntıyı da artırır3. Kolik zamanında epitelyal-gliyal etkileşimlerin bir modelinin oluşturulması, kolikte at bağırsak bariyeri geçirgenliği ve olası önlemenin potansiyel bir yolunu aydınlatabilir.

At submukozal enterik glia kültürü, türlerin özelliklerinden dolayı adaptasyonları ve sınırlamaları içerir. En önemlisi, etkili enzimatik sindirim için gereken sürenin uzunluğu titrasyon gerektiriyordu. Yazarlar, at enterik gliasının başarılı bir şekilde izole edilmesi için 37 ° C'de 2-3 saat boyunca enzimlerle inkübasyonun gerekli olduğunu bulmuşlardır. Ek olarak, at enterik kültürlerinin geçmeden önce% 80'in üzerinde birleşmeye ulaşmasına izin vermek, kültür canlılığına zararlı görünmektedir. Bu tarihteki bu yöntemin ana sınırlaması örneklem büyüklüğüdür. Bu çalışma sadece çalışma ile ilgili olmayan nedenlerle kolik cerrahisi veya ötenazi geçiren atlardan elde edilen doku / hücreleri içeriyordu. Ek deneklerden at enterik glia kültürünün devam etmesinin yanı sıra, at enterik gliasının dondurulması ve saklanması için bir protokol geliştirilmesi bu çalışmanın gücünü büyük ölçüde artıracaktır.

Bu çalışma, at kolik ve gastrointestinal hastalıklarının anlaşılmasına yardımcı olmak için potansiyel metodolojiler olarak at submukozal enterik glial kültürünün ve at enterositlerinin birincil kültürünün yeni kullanımını tanıtmaktadır. Ek olarak, izole edilmiş bağırsak kriptlerinden ve organoidlerinden yetiştirilen at epitel tek tabakaları geçmişte iyi bir şekilde kurulmuş olsa da, bu çalışma sadece bir model olarak kullanışlılıklarını sergilemeye devam etmekle kalmadı, aynı zamanda at bağırsak enterositi ve bağırsak duvarında bulunan diğer hücre tipleri ile etkileşimi inceleyen ek çalışmaları da teşvik etti.

Bu hücre tipleri arasında gözlenen etkileşimler, hem kolik hem de inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolit gibi diğer inflamatuar gastrointestinal bozukluklara potansiyel uygulamalar içerir. Ek olarak, enterik glia ve enterositler için kültür yöntemlerinin sürekli olarak rafine edilmesi, gelecekte kokültür çalışmalarının kurulmasına izin verecektir. Ayrıca, bu çalışma, epitelyal tek tabakaya yakınlığı ve bağırsak bariyeri fonksiyonuna odaklanması nedeniyle submukozal enterik glial popülasyona odaklanırken, bağırsak duvarının myenterik pleksusundan at enterik glialinin işlevini kültürlemek ve değerlendirmek için ek çalışmalar yapılabilir, bu da inflamatuar at enterik gliasının motilite15 üzerindeki etkisinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu projeyi finanse ettikleri için Morris Hayvan Vakfı'na teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M HEPES tamponGibco15630-080
10 mM HEPESYaşam Teknolojileri15630-106
2 mM GlutaMAXYaşam Teknolojileri25050-061
4' 6-Diaminidino-2-FenilindolİnvitrojenD3571
İleri DMEM / F12Yaşam Teknolojileri12634-010
Alfa düz kas aktin antikoruAbcam7817
Amfoterisin BSigmaAA95294.4 g / mL stok alikotları, nihai konsantrasyon 1.1 ve mikro; g/mL
Anti-Antimikotik 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Sığır Serumu AlbüminiSigmaAA3311
BSA 50 mg/mL stok çözeltisiSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Equine Ringer'ın Bileşeni ' Stok 1: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 2 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
KollajenazSigma9891
DMEM-F12 ortamıThermo Fisher11320033
Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm çift elektrot TEER-ölçüm odasıDünya Hassas AletlerEVM-EL-03-01
TEER Ölçümü için EVOM KılavuzuDünya Hassas AletleriEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Gentamisin çözeltisiSigmaG1272Nihai konsantrasyon 20 & mikro; g/mL
GFAP antikoruAbcam4674
Keçi anti-fare IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1 & beta; ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Equine Ringer' Bileşeni Stok 1: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 2 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
L-glutamin çözeltisiCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Equine Ringer'ın Bileşeni Stok 1: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 2 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Equine Ringer ' s Stok 2: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 1 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
NaClThermo FisherS271-10At Ringer'ın Bileşeni Stok 1: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 2 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500At Ringer'ın Bileşeni s Stok 2: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 1 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
NaHCO3Thermo FisherS637-212At Ringer'ın Bileşeni s Stok 2: diğer bileşenlerle birleştirin, ardından bu stoktan 100 mL'yi dereceli bir silindire ekleyin ve deiyonize su ile 1L'ye seyreltin. %5 CO2.
ile pH'ı 7.4'e ayarlayın Equine Ringer ile birleştirin s Stok 1 tamamlamak için " Zil sesi' s Çözümü".
Kalem/Strep çözeltisiGemini400-109
Poli-L-lizinSigmaP26361x borat tamponunda 0,5 mg/mL
Prizma yazılımıGraphPad
ProteazSigmaP4630
Sodyum bikarbonat çözeltisiSigmaS8761%7,5 stok çözeltisi

Kaynaklar

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Equin Enterik GliaBa rsak Bariyer FonksiyonuSubmukozal H cre zolasyonuEnzimatik SindirimTransepitelyal Elektriksel DirenEpitelyal Glial Etkile iminterl kin 1 BetaBa rsak Epitelyal Monotabakas
At Enterik Glial Kültürü ve At Kolikinde Nöral İnflamatuar Mekanizmanın Çalışmasına Uygulama
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.