Yöntem makalesi

Genom Düzenleme Teknolojileri ile Fonksiyonel Pirinç için Tasarım Yoluyla Islah

DOI:

10.3791/67336

⸱

3 Ocak 2025

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, genom düzenleme teknolojilerini hassas, verimli ve teknik olarak basit bir şekilde kullanarak tasarım yoluyla ıslaha dirençli nişasta pirinç çeşitlerini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ağırlıklı olarak geleneksel hibridizasyon ve mutasyon ıslahı gibi zaman alıcı ve emek yoğun yöntemlere dayanan mahsul ıslahına yönelik geleneksel yaklaşımlar, hedeflenen özelliklerin verimli bir şekilde tanıtılmasında ve çeşitli bitki popülasyonlarının oluşturulmasında zorluklarla karşı karşıyadır. Tersine, genom düzenleme teknolojilerinin ortaya çıkışı, istenen özellikleri kasıtlı olarak ortaya çıkarmak için bitki genomlarının hassas ve hızlandırılmış manipülasyonunu sağlayan bir paradigma kaymasına yol açmıştır. En yaygın düzenleme araçlarından biri, araştırmacılar tarafından biyoloji ile ilgili önemli sorunları incelemek için kullanılan CRISPR / Cas sistemidir. Bununla birlikte, genom düzenlemenin kesin ve etkili iş akışı, mahsul ıslahında iyi tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, diyabet ve obezite gibi hastalıkların önlenmesinde çok önemli bir rol oynayan fonksiyonel bir özellik olan yüksek seviyelerde dirençli nişasta (RS) ile zenginleştirilmiş pirinç çeşitlerinin ıslah sürecinin tamamını gösterdik. İş akışı, fonksiyonel SBEIIb geninin seçimi, tek kılavuzlu RNA'nın (sgRNA) tasarlanması, uygun bir genom düzenleme vektörünün seçilmesi, vektör dağıtım yönteminin belirlenmesi, bitki doku kültürünün yürütülmesi, genotipleme mutasyonu ve fenotipik analiz gibi birkaç önemli adımı kapsıyordu. Ek olarak, sürecin her aşaması için gerekli olan zaman çerçevesi açıkça gösterilmiştir. Bu protokol sadece ıslah sürecini kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda özellik tanıtımının doğruluğunu ve verimliliğini de artırır, böylece fonksiyonel pirinç çeşitlerinin geliştirilmesini hızlandırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel ıslah, ekinlere özelliklerin eklenmesine veya yeterli varyasyona sahip bitki popülasyonlarının üretilmesine dayanır, bu da uzun süreli saha gözlemi gerektirir 1,2. Geleneksel ıslahın sınırlamaları nedeniyle, bitki popülasyonlarının istenen özelliklerini elde etmek için mahsullerin genomunu hassas bir şekilde değiştirebilen gen düzenleme teknolojisi geliştirilmiştir3. Bitkilerde en yaygın kullanılan gen düzenleme sistemi, DNA'da hedeflenen çift iplikli kırılmalar (DSB'ler) oluşturmak için programlanabilir bir RNA güdümlü endonükleaza dayanan CRISPR/Cas'tır (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar/CRISPR ile ilişkili Cas endonükleaz) 4,5. Bu DSB'ler daha sonra hücrenin doğal DNA onarım mekanizmaları 6,7 tarafından onarılır ve genellikle istenen genetik değişikliklerin ortaya çıkmasına neden olur. Bu teknoloji buğday8, mısır9, soya fasulyesi10 ve pirinç11 dahil olmak üzere çeşitli mahsullerde uygulanmış olsa da, ağırlıklı olarak biyolojik sorunları ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Bitki gen fonksiyonlarının aydınlatılmasındaki kapsamlı uygulamasıyla karşılaştırıldığında, gen düzenleme teknolojilerinin mahsul ıslahına uygulanmasına ilişkin araştırmalar nispeten az kalmaktadır12.

Ekinlerde gen düzenleme süreci tipik olarak birkaç temel adımı kapsayan iyi tanımlanmış bir iş akışını takip eder13. İlk adım, istenen özelliği elde etmek için modifiye edilmesi gereken spesifik gen veya genetik bölgenin tanımlanmasını içerir. İkinci olarak, uygun bir gen düzenleme sisteminin (örneğin, CRISPR-Cas9 veya CRISPR-Cas12) seçimini ve endonükleazı hedef bölgeye yönlendirmek için spesifik kılavuz RNA'ların tasarımını içeren bir gen düzenleme stratejisi tasarlanır. Üçüncü olarak, gen düzenleme sistemi daha sonra düzenleme makinesini bitki hücrelerine sokmak için kullanılan bir dağıtım vektörüne dahil edilir. Bu vektörler DNA, RNA veya ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri olabilir. Daha sonra, gen düzenleme vektörleri, Agrobacterium aracılı dönüşüm, parçacık bombardımanı veya elektroporasyon dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak bitki hücrelerine verilir. Hemen, dönüştürülmüş bitki hücreleri, genetik olarak düzenlenmiş kallus veya embriyojenik dokular oluşturmak için uygun koşullar altında kültürlenir. Bu dokular daha sonra doku kültürü teknikleri ile bütün bitkilere dönüştürülür. Rejenere bitkiler, istenen genetik değişikliklerin varlığını doğrulamak için titiz moleküler karakterizasyona tabi tutulur.

Tsakirpaloglou ve ark.14 tarafından yazılan önceki bir makale, vektör tasarımından düzenlenmiş fidelerin oluşturulmasına kadar gen düzenleme sürecine geniş bir genel bakış sağlar, ancak hedeflenen genle ilişkili spesifik özelliklerin ayrıntılı analizine veya agronomik performansın müteakip değerlendirmesine veya düzenlenmiş mahsullerin fonksiyonel doğrulamasına girmez. Pirinçte bir geni düzenlemenin fizibilitesini göstermenin ötesine geçtik. Çalışmamız, bu düzenlemenin, düzenlenen pirinç hatlarının biyokimyasal, moleküler ve agronomik özellikleri üzerindeki etkisini kapsamlı bir şekilde değerlendirmektedir. Bu, önceki gen düzenleme çalışmalarında kapsamlı bir şekilde araştırılmamış, tahıl kalitesini ve besin değerini etkileyen kritik bir faktör olan nişasta bileşiminin değerlendirilmesini içerir.

Pirinç nişastası tipik olarak ~%20 amiloz ve ~%80 amilopektin15'ten oluşur. SBEIIb, amilopektin sentezi için gerekli bir enzimdir ve endosperm16'da eksprese edilir. OsSBEIIb'nin firkete RNA'sı (RNAi) ve mikroRNA ekspresyonu ile yıkılması, dirençli nişasta içeriğini17,18 arttırdı. Dirençli nişasta, ince bağırsakta sindirilemeyen ve emilmeyen, ancak bağırsaklardaki bazı sindirim bakterileri tarafından kısa zincirli yağ asitlerine ve gazlara parçalanabilen bir substrat nişastasıdır. Hızlı bir şekilde parçalanamadığı için diğer nişastalara göre daha düşük glisemik indekse sahiptir ve yemekten kısa bir süre sonra kan şekerinde hızlı bir yükselmeye neden olmaz, bu da diyette şeker hastalığını bir dereceye kadar hafifletebilir19. Ek olarak, dirençli nişastanın insülin yanıtını azaltmak, bağırsak fonksiyonunu düzenlemek, yağ birikimini önlemek, kilo kontrolünü kolaylaştırmak ve mineral iyonlarının emilimini teşvik etmek gibi daha fizyolojik işlevleri vardır. Bu nedenle, yeni bir diyet lifi türü olarak yaygın bir şekilde takip edilmektedir20.

Bu zorlukların üstesinden gelmek ve fonksiyonel pirinç çeşitlerinin ıslahı için gen düzenleme teknolojilerini başarılı bir şekilde kullanmak için, pirinç içindeki operasyonel protokolleri rafine ettik ve optimize ettik. Odak noktamız, hedef gen lokuslarının tasarımını titizlikle analiz etmek, en uygun gen düzenleme araçlarını dikkatlice seçmek ve ıslah süreci boyunca titiz fenotipik analizler yapmak olmuştur. Bu teknolojilerin gücünün ve verimliliğinin bir kanıtı olarak, yüksek dirençli nişasta ile zenginleştirilmiş fonksiyonel bir pirinç çeşidinin hızlı gelişimini gösteren bir vaka çalışması sunuyoruz. Bu örnek, fonksiyonel pirincin ıslahını hızlandırmada gen düzenlemenin potansiyelinin altını çizmekte ve bu alandaki mevcut araştırma eksikliğini ele almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini izleyerek Çin'deki Bellagen Biotechnology Co. Ltd'de gerçekleştirildi. Katılımdan önce, bilgilendirilmiş onam veren deneklere çalışma protokolü kapsamlı bir şekilde açıklandı.

1. sgRNA ve yapım vektörünün tasarlanması (zamanlama 5-7 gün)

NOT: CRISPR/Cas-SF01 sistemi21'i ifade etmek için ikili bir vektör kullanılmıştır. sgRNA için potansiyel hedef dışı bölge ile 3'ten az nükleotid (nt) uyumsuzluğuna sahip değildir. SgRNA adaptörünün, düzenleme vektörünün Bsa I enzim sindirimi tarafından üretilen yapışkan ucu tamamlaması gerekir. Yazılım seçimi, yazılımın pirinç14'te bildirilen yüksek verimliliği ve özgüllüğünün yanı sıra kullanım kolaylığı ve araştırma grubuna erişilebilirliğine dayanıyordu.

  1. Japonica'daki OsSBEIIb (LOC4329532) genini almak için NCBI web sitesine (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) gidin. SnapGene yazılımı içindeki referans genomu indirin ve erişin.
  2. X134 çeşidinden OsSBEIIb'nin ekzon dizisindeki ekleme/delesyonları (InDel) ve tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP) referans genomla karşılaştırarak analiz edin. Ekzon bölgelerini çevreleyen primerleri tasarlamak için NCBI Primer Blast22'yi kullanın (Ek Tablo 1).
  3. X134'teki OsSBEIIb geninin ekzon dizisini Sanger dizilimi ile doğrulamak için reaksiyonu şu şekilde hazırlayın: 1 μL ileri primer ile 10 μL polimeraz karışım tamponu, 1 μL Ters primer, X134 dokularından 1 μL gDNA ve 7 μL damıtılmış su. PCR programını aşağıdaki gibi çalıştırın: 95 °C, 3 dakika; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 döngü ve 72 °C, 5 dk.
  4. Tsakirpaloglou ve ark.14protokolüne bağlı kalarak ve PAM dizisinin TTN olduğundan emin olarak, X134'ün OsSBEIIb ekzon dizisi üzerinde sgRNA'yı tasarlayın.
  5. İleri astarın 5' ucuna -ACAC- oligos ekleyerek ve ters astarın 5' ucuna -GGCC- oligos ekleyerek sgRNA dizisini değiştirin. İleri / geri primerleri ticari olarak sentezleyin (sgRNA için).
  6. İleri ve geri astarları 10 μmol/L'lik bir konsantrasyonda çözün, her birinden 1 μL alın ve 8 μL tavlama tamponuna (Tris-EDTA tamponu + 50 mM NaCl) ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. PCR makinesine yerleştirin ve tavlama programını bir PCR makinesinde aşağıdaki gibi çalıştırın: yavaş soğutma işlemi 0,1 °C/s'de 95 °C ila 16 °C.
  7. sgRNA'yı genom düzenleme vektörüne birleştirin. Reaksiyonu şu şekilde hazırlayın: 0.5 μL T4 DNA ligaz ile 20 μL karışım tamponu, 1 μL Bsa I, 2 μL 10x kısıtlama tamponu, 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 2 μL tavlama astarı, 2.5 μL vektör (hacmi orana uyacak şekilde ayarlanır) ve 10 μL damıtılmış su. Her durumda, montaj verimliliği elde etmek için 2:1 kesici uç-vektör oranı kullanın. PCR montaj programını 30 döngü ile (37 °C, 2 dk; 16 °C, 3 dk) ve 55 °C, 30 dk olarak çalıştırın.
  8. Elde edilen vektörü tarif edildiği gibi E. coli hücrelerine dönüştürün23.
  9. Plazmid içindeki gRNA yerleştirme bölgesini çevreleyen primerler tasarlayın. Bu primerleri kullanarak, başarılı yerleştirmeleri taramak için tek tek kolonilerde PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Başarılı klonlamayı doğrulamak ve plazmid24'ü izole etmek için PCR ürünlerinin Sanger dizilimini gerçekleştirin.

2. Agrobacterium'un Dönüşümü (zamanlama 4 gün)

  1. EHA105 Agrobacterium Yetkin Hücreyi buz üzerinde çözdürün. Hücre süspansiyonuna 1-2 μL plazmit DNA (~ 100-200 ng DNA içeren) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  2. Tüpü 5 dakika buza, 5 dakika sıvı nitrojene, 37 °C'de 5 dakika ısı şokuna ve ardından 5 dakika buz banyosuna yerleştirerek ısı şoku dönüşümü gerçekleştirin.
  3. Tüpe antibiyotiksiz 700 μL Maya Ekstraktı Pepton (YEP) ortamı ekleyin ve hafifçe karıştırın. Hücreleri 28 ° C, 200-250 rpm'de 2-3 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde kurtarın.
  4. Kültürü 1 dakika boyunca 2.800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantın çoğunu atın, yaklaşık 100 μL bırakın ve hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri, plazmit seçimi için %1 antibiyotik (Kanamisin ve Rifampisin) içeren YEP agar plakalarına yayın. Plakayı 28 °C'de 24-48 saat inkübe edin.
  5. YEP (antibiyotik dirençli) plakasını CRISPR/Cas'ı barındıran tek bir Agrobacterium kolonisi içeren bir pipet ucu ile çizgi oluşturun ve hücreleri uygun antibiyotiklerle 5 mL YEP sıvı ortamına aktarın. Sıvıyı 28 °C'de 3 gün inkübe edin.
  6. Dönüştürülmüş Agrobacterium suşlarını daha fazla kullanım için -80 ° C'de gliserol stokları olarak saklayın.

3. Agrobacterium ile pirinç dönüşümü (zamanlama 3 ay)

NOT: Bitki hücresi25'teki yabancı DNA dizisinin iletilmesi ve ekspresyonu için çeşitli bitki transformasyon yöntemleri bildirilmiştir. Genomdaki tek kopya entegrasyonu ve DSB'lerin düşük frekansı göz önüne alındığında, Agrobacterium aracılı dönüşüm, ekspresyon DNA fragmanını pirinç kromozomlarına entegre etmek için tercih edilen yöntemdir.

  1. 25'teki protokolü takiben pirincin Agrobacterium aracılı dönüşümünü gerçekleştirin. Aktif olarak büyüyen calli (sarımsı beyaz, nispeten kuru ve 1-3 mm çapında) verimli dönüşüm için kilit bir noktadır. Nasırı Agrobacterium ile enfekte etmeden önce fide gelişimi veya kahverengi nasır olan tohumları atın.

4. Transgenik bitkilerin genotiplendirilmesi ve tohum hasadı (zamanlama 8 ay)

NOT: Homozigot mutasyon ve yabancı DNA içermeyen hatlar elde etmek için iki nesil pirinç yetiştirilecektir.

  1. Fide dokusundan numune alınması: Transgenik bitkileri saksılara nakledin ve bir serada 1 ay boyunca büyütün. Mutasyon tipini test etmek için, tek bir fidanın her bir yekesinden 2-3 mg taze yaprak toplayın ve bunları tek bir örnekte birleştirin.
  2. Genomik DNA'nın ekstraksiyonu: Bitki genomu DNA ekstraksiyonu için belirlenmiş bir protokolü takip edin26.
  3. Mutasyon primerlerinin tasarlanması (Ek Tablo 1): sgRNA hedef bölgesini çevreleyen SBEIIb gen bölgesini amplifiye etmek için PCR primerleri tasarlayın14. Amplifiye edilmiş parçanın uzunluğu 493 bp'dir.
  4. Mutasyonun genotiplenmesi: PCR fragmanlarını doğrudan sıralayın veya bir T-klon vektörüne klonlayın ve mutasyonları tanımlamak için Sanger yöntemini kullanarak dizileyin14.
  5. Tohum hasadı: Homozigot çerçeve kayması mutasyonları sergileyen E0 çizgilerini seçin ve tohum elde etmek için bunları bir seraya dikin.
  6. T-DNA'yı tanımlamak için primerlerin tasarlanması: Mutasyonlar arasındaki yabancı DNA içermeyen çizgileri tanımlamak için yapının Higromisin kaseti, UBI kaseti ve Cas kaseti için üç spesifik primer tasarlayın (Ek Tablo 1).
  7. Yabancı T-DNA içermeyen hatların doğrulanması: 2 haftalık fidelerden yaprakları hasat edin ve adım 4.2'de açıklandığı gibi bitki genom DNA'sını çıkarın. Aşağıdaki programla genomik PCR gerçekleştirin: 95 °C, 3 dakika; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 döngü ve 72 °C, 5 dk. Bu, bitki genomunda higromisin, UBI ve Cas kasetinin tespit edilmesini sağlar.
  8. PCR ürünlerini jel elektroforezi ile analiz edin ve transgen içermeyen E1 çizgileri olduklarını gösteren bant göstermeyen çizgileri seçin. Seçilen bu hatlardan tohumları hasat edin.

5. Dirençli nişasta içeriği ölçümü (zamanlama 4 gün)

  1. Mutant ve X134 bitkilerinin tohumlarını hasat edin ve yaklaşık% 13 -% 15 nem içeriğini koruyarak oda sıcaklığında doğal olarak kurumasına izin verin. Aşağıda özetlenen pankreas α-amiloz/amiloglukosidaz (AMG) prosedürünü kullanarak dirençli nişasta içeriğini belirleyin.
  2. Soyma makinesini çalıştırın ve yapışkan kabuğu verimli bir şekilde çıkarmak için besleyiciye 10 g pirinç tanesi ekleyin, bu da işlenmiş pirinç tohumları ile sonuçlanır.
  3. Soyulmuş pirinç tohumlarını pirinç değirmenine aktarın ve 60 aleurone tabakasını ortadan kaldırmak için s, cilalı pirinç elde etmek.
  4. Cilalı pirinci doku öğütücüye yerleştirin, öğütme frekansını 60 Hz'e ayarlayın. Öğütücüyü 15 saniye çalıştırın ve pirinç tozu elde etmek için döngüyü 2 kez tekrarlayın.
  5. Öğütülmüş pirinç tozunu bir Petri kabına koyun ve önceden ısıtılmış bir fırına koyun. Sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın ve 12 saat kurumaya bırakın.
  6. 100 mg ± 5 mg numuneyi hassas bir şekilde tartın ve doğrudan 2.0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dökün. Numunenin dibe çöktüğünden emin olmak için tüpe hafifçe vurun.
  7. Tüpe 180 μL arıtılmış su ekleyin ve numuneleri bir su banyosunda 20 dakika kaynatın.
  8. Numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin, ardından her tüpe pankreas α-amilaz (10 mg / mL) içeren 4 mL AMG (3 U / mL) ekleyin.
  9. Tüpleri güvenli bir şekilde kapatın, bir girdap osilatörü üzerinde karıştırın ve tüpleri sürekli çalkalama ile 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  10. 4 mL etanol ekleyin ve bir girdap kullanarak karıştırın. Tüpü 10 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı boşaltın, 2 mL %50 etanol ve ardından 6 mL %50 IMS ekleyin ve bir girdap ve santrifüj kullanarak karıştırın.
  12. Süpernatanı dikkatlice dökün ve fazla sıvıyı boşaltmak için tüpü ters çevirin. Tüpleri bir buz banyosuna yerleştirin, her tüpe 2 mL 2 M KOH ekleyin ve flok yeniden süspanse etmek ve dirençli nişastayı çözmek için numuneleri 20 dakika karıştırın.
  13. Her test tüpüne 8 mL 1.2 M sodyum asetat tamponu (pH 3.8) ekleyin ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırın.
  14. Hemen 0.1 mL AMG (3300 U/mL) ekleyin, iyice karıştırın ve bir girdap kullanarak aralıklı karıştırma ile 50 ° C'de bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Ardından, tüpü 10 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin.
  15. 0.1 mL süpernatanı bir cam tüpe aktarın, 3 mL Glikoz oksidaz / peroksidaz (GOPOD) reaktifi ekleyin ve 50 ° C'de 20 dakika inkübe edin. 0.1 mL 100 mM sodyum asetat tamponu ve 3 mL GOPOD reaktifini karıştırarak boş bir reaktif hazırlayın. 0.1 mL D-glikozu 3 mL GOPOD reaktifi ile karıştırarak standartları hazırlayın.
  16. Her bir boş çözeltiden 200 μL'yi, test edilecek çözeltiyi ve standart çözeltiyi 96 oyuklu bir plakaya dikkatlice pipetleyin.
  17. Her bir numunenin boş çözeltiye karşı 510 nm'de emilimini ölçün ve sağlanan formülü kullanarak dirençli nişasta içeriğini hesaplayın.
    Dirençli Nişasta (g/100 g) = ΔA × F/W ×9.27
    Burada ΔA = reaktif boşluğuna karşı okunan absorbans; F = absorbanstan mikrograma dönüşüm (GOPOD reaksiyonunda 100 μg D-glikoz için elde edilen absorbans belirlenir); W = analiz edilen numunenin kuru ağırlığı.

6. Tokluk kan şekeri yanıtı (zamanlama 5 gün)

  1. Katılımcılar için aşağıdaki dahil etme kriterlerini kullanın: 18 ila 60 yaşları arasındaki sağlıklı Asyalı Çinli yetişkinler, sigara içmeyen, 18,5 ila 25 kg /m2 arasında bir vücut kitle indeksi (BMI) ve normal kan basıncı (< 140/90 mm. Hg). Aşağıdaki dışlama kriterlerini kullanın: metabolik hastalıklar (diyabet, hipertansiyon vb.), gastrointestinal bozukluklar, endokrin sistem anormallikleri veya akıl hastalıkları. Toplam 10 katılımcı tarandı ve işe alındı.
  2. Test oturumu prosedürü (art arda iki güne yayılmış)
    1. 0. Gün (Hazırlık Günü): Katılımcılardan testten önceki ilk 3 gün boyunca düzenli uyku düzenlerini ve normal bir diyet sürdürmelerini isteyin. Testten önceki akşam (saat 20:00'den sonra), katılımcılardan yüksek lifli ve yüksek şekerli yemeklerden kaçınmalarını isteyin. 1. Günün sabahı şiddetli egzersiz yapılması önerilmez.
    2. 1. Gün (Test Günü): Pirinç tohumlarını öğüterek beyaz pirinci hazırlayın, ardından beyaz pirinci 2 kez durulayın. Bir tencereye 1,5 ölçü su ve 1 ölçü beyaz pirinç doldurun. Pirinci suyunu tamamen çekene kadar haşlayın. Ocağın altını kapatın, tencerenin kapağını kapatın ve 10 dakika dinlendirin.
    3. 10 katılımcıyı rastgele olarak iki eşit gruba atayın: bir test grubu Dirençli Nişasta beyaz pirinçle beslenecek ve bir kontrol grubu X134 beyaz pirinçle beslenecek. Test başlamadan önce katılımcılardan 10 dakika dinlenmelerini isteyin.
    4. Parmak uçlarınızı %75 tıbbi alkolle sterilize edin. Lanset cihazını parmak ucuna hafifçe bastırın ve cildi delmek için yayı serbest bırakın. Küçük bir kan damlası oluşturmak için parmağınızı hafifçe sıkın ve bu damlacığı ölçüm cihazındaki test şeridinin kan emici ucuna dokundurun. Ölçüm cihazı otomatik olarak kanı çeker ve test sürecini başlatır. Kan şekeri ölçümünün görüntülenmesini bekleyin.
    5. Pirinç tüketimi ve kan örneklemesi: Katılımcılara 200 mL su ile 50 g hazırlanmış pirinç sunun ve bunu 5-10 dakika içinde rahat bir hızda yemelerini isteyin. Yemekten sonra, aşağıdaki zaman noktalarında venöz kan örnekleri toplayın: yemeğin başlangıcından itibaren 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika ve 120 dakika. Adım 6.2.4'teki gibi kan şekeri analizi yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, fonksiyonel pirincin ıslahının tüm prosedürleri, stabil dirençli nişasta pirinç çeşitleri elde etmek için genom düzenleme ile gösterilmiştir. SBEIIb'yi hedefleyen sgRNA'yı CRISPR/Cas-SF01'e entegre ettik (Ek Şekil 1), Agrobacterium transformasyonu kullanarak pirince sızdık ve eleme ve köklendirme aşamalarından sonra E0 nesil bitkiler elde ettik. Gen fonksiyon kaybı olan bitkiler taranmış ve tohum hasadından sonra dirençli nişasta içerikleri belirlenmiştir (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas-SF01 tabanlı yıkım vektörleri oluşturma sürecinde, tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA) titiz seçimi çok önemlidir. Bu, minimum hedef dışı efektle yüksek düzenleme verimliliği sergileyen dizilerin benimsenmesini gerektirir. Ek olarak, hedefleme primerlerinin sentezi, vektörün ek yerleriyle eşleşen kısa adaptör oligolarını içerir ve sorunsuz entegrasyon sağlar. Özellikle, sıralı enzimatik sindirim, jel saflaştırma ve ligasyon gerektiren önceki metodolojilerin aksine, çalışmamız enzi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Biyolojik Islah-Büyük Projeler (2023ZD04074) tarafından sağlanan finansmanla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co., LtdP213  Genlerin Tek Nükleotid Polimorfizminin (SNP) Saptanması
2,4-Diklorofenoksiasetik (2,4-D) Asit ÇözündürücüFito TeknolojisiD309
AAM ortaShandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFNew England biolabsR3535Bsa I düzenleme vektörünün enzim sindirimi
Karbenisilin antibiyotikleriApplygenAPC8250-5Seçim  orta, rejenerasyon ortamı
KasaminoasitBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500Kallus indüksiyon ortamı, birlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı
DH5 ve alfa; Kimyasal Olarak Yetkin Hücre Weidi BiotechnologyCo., Ltd.DL1001 E. coli < / em> yetkin hücreler
D-SorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA, disodyum tuzu, dihidratElmasA100105-0500CTAB tamponu
EHA105 Kimyasal Olarak Yetkin HücreWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010 Agrobacterium yetkin hücreler
FastPure Plazmid Mini KitVazyme Biotech Co., LtdREC01-100Plazmid izole
Higromisin antibiyotiklerYeasen60224ESbirlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı ve kök ortamı
Kanamisin antibiyotiklerYeasen60206ES10Seçim agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB tamponu
L-GlutaminFito TeknolojisiG229Kallus indüksiyon ortamı, birlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı
L-ProlinFito TeknolojisiP698Nasır indüksiyon ortamı, birlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı
Mautre kuru pirinç tohumları (Xiushui134)-Japonica çeşitleri ıslah RS pirinç
Değirmen pirinç mechineMARUMASUMHR1500ABeyaz pirinç üretmek için
Murashige Skoog FitoTeknolojisiM519Kök ortamı, rejenerasyon ortamı
Myo-inositolFito TeknolojisiI703Rejenerasyon ortamı
NaClMacklinS805275İçin  YEP ortamı
NB Bazal OrtaFito TeknolojisiN492Kallus indüksiyon ortamı, birlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı
Pepton ve nbsp;SolarbioLA8800İçin  YEP medya
PhytogelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Midea grup A.Ş.MB-5E86Pirinç pişirmek için
BuzdolabıHaierBCD-170Ortamın depolanması
Dirençli Nişasta Tahlil KitiMegazymeK-RSTARÖlçüm ve analiz dirençli nişasta
Rifampisin antibiyotiklerSigmaR3501-250MGSeçim agrobakteri
Sodyum hipoklorit çözeltisiMacklinS817439Tohum sterilizasyonu için
SükrozShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Nasır indüksiyon ortamı, birlikte yetiştirme ortamı, seçim ortamı, rejenerasyon ortamı
T4 DNA LigaseNew england biolabsM0202sgRNA'nın CEISPRY/Cas-SF01 vektörüne katılması
Glikoz monitörüTıbbi Ekipman ve Supply Co., LtdXuetang 582Kan şekeri
tespiti Tris-HCLMacklinT766494CTAB tamponu
Maya AgarSolarbioLA1370İçin  YEP medyası
YEP medyası-Agrobacterium Yetiştiriciliği

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR CasDiren li Ni astaSBE2b GeniTek K lavuz RNABitki Doku K lt rMutasyon GenotiplemesiFenotipik AnalizKan Glikoz Analizi

İlgili makaleler