Yöntem makalesi

Adeno-ilişkili virüs serotip 8 (AAV8) ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonu yoluyla karaciğerde etkili gen yıkımı

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 Kasım 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

Bu makalede

Özet

Bu protokol, AAV8 ile verilen küçük firkete RNA'sının intrasplenik enjeksiyonunun, karaciğerde portal ven enjeksiyonu ile aynı gen yıkım etkinliğini nasıl sağladığını açıklar ve çok daha düşük perioperatif ve postoperatif mortalite ve komplikasyonlar ile daha basit bir prosedürü temsil eder.

Özet

Karaciğer, temel metabolik işlevleri yerine getiren önemli bir organdır. Karaciğerde gen ekspresyonunu yıkmak için etkili ve güvenli bir yöntem geliştirmek, karaciğer patofizyolojisinde gen fonksiyonunu belirlemek için önemli bir araç sağlar. Bu çalışmada, ilgilenilen bir hedef gen olan nükleostemin'e (NS) karşı küçük bir firkete RNA'sını (shRNA) eksprese etmek üzere tasarlanmış adeno-ilişkili virüs serotip 8'in (AAV8) intrasplenik enjeksiyonu için bir yöntem tanımlanmıştır. NS hedefli bir shRNA'yı (AAV8-shNS1) eksprese eden AAV8'in intrasplenik enjeksiyonu, şifreli bir dizi shRNA'yı (AAV8-shScr) eksprese eden AAV8 enjeksiyonuna kıyasla, portal ven enjeksiyonu ile karaciğerde NS'nin aynı yıkım etkinliğini elde etti. Ayrıca, AAV8-shRNA virüsünün enjeksiyonu, karaciğer parankiminde minimal inflamatuar reaksiyonları tetikledi. En önemlisi, bu intrasplenik enjeksiyon protokolü teknik olarak zorlayıcı değildi ve portal ven enjeksiyonu yapılırken perioperatif ve postoperatif mortalitenin önde gelen nedeni olan enjeksiyon bölgesinde minimal kanamaya neden oldu. Bu çalışma, karaciğerde verimli gen yıkımı elde etmek için gelişmiş ve nispeten güvenli bir yöntem bildirmektedir.

Giriş

Karaciğer, besinleri ve kimyasalları metabolize eden hayati bir organdır, ancak aynı zamanda sitotoksik ve kanserojen hakaretlere sürekli maruz kalır. Yetişkin karaciğeri yaralanmadan sonra yeniden büyüyebilirken, rejeneratif gücü1 yaşına kadar ciddi şekilde engellenir. Bugüne kadar, son dönem kronik karaciğer hastalıkları veya masif akut karaciğer hasarı olan hastalar için tek terapötik seçenek, kendi başına birçok zorluk teşkil eden karaciğer transplantasyonudur2. İlgilenilen genlerin fonksiyonlarını sorgulayarak karaciğerin moleküler patofizyolojisini daha iyi anlamak için, loxP bölgelerininvarlığında bir Cre rekombinaz ile RNAi aracılı yıkım ve hedefli delesyon dahil olmak üzere in vivo uygulama için genetik manipülasyonlar geliştirilmiştir 3. Cre-ekspresyon kaseti ve shRNA yapısı viral araçlar tarafından sağlanabilir.

Adeno ilişkili virüs serotip 8 (AAV8), seçici doku tiplerine (ör. karaciğer, iskelet kası, kalp, beyin ve pankreas) yüksek verimlilik ve düşük inflamatuar yanıt ile gen iletimi için sağlam bir vektördür 4,5. İç vücut organlarını hedeflemek için, AAV8 yaygın olarak, viral partiküllerin sistemik dolaşıma ulaşmadan önce akciğerden geçtiği kuyruk damarı enjeksiyonu ile tanıtılır. Buna karşılık, portal ven enjeksiyonu, potansiyel bir sekestrasyon ve seyreltme kaynağı olan akciğerde dolaşmadan önce karaciğere ulaşmalarını sağlar. Bununla birlikte, portal ven enjeksiyonu teknik olarak zordur ve genellikle operasyona bağlı kanama ve yüksek mortalite oranı ile komplike hale gelir. Yüksek peri/postoperatif mortalite sorunundan kaçınırken karaciğerde etkili bir gen yıkımı (KD) elde etmek için, tasarlanmış bir shRNA'yı hedefleyen nükleostemin (NS) (AAV8-shNS1) taşıyan AAV8'in intrasplenik enjeksiyon yöntemini test ettik ve KD etkinliğini portal ven enjekte edilen AAV8-shNS1 ile karşılaştırdık.

NS, ilk olarak nöral kök hücrelerde ve daha sonra diğer bazı kök hücre ve kanser türlerinde keşfedilen kök/progenitör hücreden zenginleştirilmiş bir proteindir 6,7. NS'nin biyolojik önemi, in vivo 3,8 ve in vitro 9,10 NSKD'nin neden olduğu kendini yenilemenin NSKD kaynaklı bozulma ile gösterilmiştir. Yetişkin hayvanlarda, testiste ve lentektomi sonrası farklılaşan newt pigmentli epitel hücreleri ve uzuv amputasyonundan sonra kas hücreleri11 dahil olmak üzere rejenerasyon geçiren çeşitli dokularda yüksek seviyelerde NS ekspresyonu bulunur ve ayrıca kalp hasarı sonrası fare kardiyomiyositleri12 ve karaciğer hasarı sonrası hepatositler (örn., CCl4) veya cerrahi rezeksiyon (örn. parsiyel hepatektomi)13,14. Ayrıca, NS'nin meme, karaciğer ve oral tümörlerin gelişiminde önemli roller oynadığı gösterilmiştir 15,16,17. Mekanik olarak, NS'nin replikasyon yapan genomu DNA hasarından koruyarak kendini yenilemeyi teşvik ettiği gösterilmiştir18,19. Bununla birlikte, germ hattı NSKO'nun erken embriyonik ölümcül fenotipi nedeniyle, yetişkin organlarındaki biyolojik aktivitelerini daha fazla belirlemek için doku gelişiminin tamamlanmasından sonra NSKD'yi geçici olarak tanıtmak için deneysel bir yönteme ihtiyaç vardır.

Bu makalede, NS'yi bir vaka olarak kullanarak, etkili ve işleme bağlı mortalitesi düşük olan bir in vivo karaciğer geni KD yönteminin kurulumunu ve testini göstermek için kullandık.

Protokol

Bu çalışmada tamamlanan tüm hayvan deneyleri, Houston'daki Texas A&M Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası: 2021-0264-IBT) ve ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal yönergelere uygun ve uyumlu bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Dişi C57BL / 6J fareleri (4-5 aylık, vücut ağırlığı 23-30 g) kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. AAV8- shRNA tasarımı ve üretimi

NOT: Prosedür ayrıntıları için lütfen Sands ve ark.4'e bakın.

  1. İlgilenilen genin kodlama bölgesi içinde 21 nükleotid uzunluğunda bir diziyi hedefleyen duyu ve anti-anlamlı shRNA oligonükleotidleri tasarlayın. Bu durumda, fare NS (shNS1) ve negatif kontrol (shScr) olarak 21 nükleotidden oluşan şifreli bir dizi kullanıldı (Şekil 1A, alt panel).
  2. Saç tokası yapısına bir TTCAAGAGA kök döngü dizisi, 5' künt uç, 3' XhoI uyumlu uyumlu bir uç ve 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) gen spesifik hedeflenmiş duyu dizisi veya 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr) şifreli bir dizi ekleyin.
  3. Her bir oligonükleotid çiftini fosforile edin ve tavlayın.
  4. AAV gen transfer vektörünü, AV5-siRNA-GFP'yi (Şekil 1A, üst panel), HpaI ve XhoI, defosforilat ve jel ile sindirin, vektör parçasını saflaştırın.
  5. Tavlanmış oligonükleotidleri jel ile saflaştırılmış vektöre bağlayın.
  6. Bağlanmış DNA ürünlerini, alt klonlama verimliliği ile yetkin DH5α bakterilerine dönüştürün.
  7. Ampisilin direncine göre tek klonları seçin ve plazmid miniprep için 100 mL bakteri kültürü büyütün. Dizileme ile doğru klonlamayı onaylayın ve piyasada bulunan endotoksin içermeyen kiti kullanarak (üreticinin talimatlarını izleyerek) plazmitleri hazırlayın.
  8. AV5 transfer vektörünü, Rep / Cap serotip 8'i ve AdF6 yardımcı plazmitlerini iMFectin transfeksiyon reaktifi kullanarak 293T hücrelerine transfekte ederek AAV8 virüslerini paketleyin. Toplam 40 × 15 cm'lik tabaklar transfekte edildi ve transfeksiyondan 3 gün sonra hasat edildi / sindirildi.
  9. Hücre ile ilişkili AAV8'i hücre lizisi ile geri kazanın ve ortam tarafından salgılanan AAV8'i %40 PEG ile çökeltin. Sindirimden sonra, AAV8 virüslerini hücre lizatında ve ortamda birleştirin, süreksiz bir iyodiksanol gradyanı üzerinde saflaştırın ve moleküler ağırlık kesme santrifüjleme ünitelerinde (1,00,000 MW) konsantre olun.
  10. AAV8 titrelerini primerlerle mutlak uç nokta qPCR ile ölçün: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') ve WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. AAV8'in intrasplenik enjeksiyonu (Şekil 1B, 1C) 

  1. C57BL6/J farelerini %2 izofluran ve oksijenle dolu bir anestezi odasına yerleştirin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Bilinç kaybından sonra, fareleri sağ lateral yaslanmış pozisyonda aseptik cerrahi alana aktarın. Anesteziyi% 2 izofluran ile koruyun ve bir burun konisi yoluyla verilen oksijeni koruyun.
  2. Kesi bölgesini %2 klorheksidin ve ardından %80 etanol ile sterilize edin. Sol üst karın duvarında 6.3 mm'lik bir kesi yapmak için 15 inçlik bir tıbbi makas kullanın, ardından peritonda 10 mm'lik bir kesi yapın.
  3. Forseps kullanarak dalağı nazikçe açığa çıkarın ve organın altına yerleştirilmiş ıslak bir gazlı bezle yerinde tutun.
  4. AAV8 virüslerini (50 μL) 30 G'lık bir iğne kullanarak 30 G'lik bir iğne kullanarak dalağa nazikçe karıştırın ve enjekte edin, ucu yüzeyin 3 mm altına yerleştirilir (Şekil 1B). Enjeksiyon bölgesini bir parça pamuklu çubukla örtün ve 1 dakika boyunca sıkıştırın.
  5. Peritonu 4-0 emilebilir kromik bağırsak sütürü ile dikin.
  6. Karın duvarını ve cildi 4-0 ipek dikiş ile kapatın.
  7. Fareleri elektrikli bir ısı yastığının üzerine temiz bir kafese koyun ve iyileşene kadar izleyin.

3. AAV8'in portal ven enjeksiyonu

  1. C57BL6/J fareleri izofluran inhalasyonu (% 2) ile oksijenle karıştırılarak (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre) uyuşturun.
  2. Laparotomi 4,13'ü cilt üzerinde orta hat kesisinden (~ 1 inç) ve ardından peritona uygulayın.
  3. Farenin sol tarafına steril tuzlu suya batırılmış steril bir gazlı bez yerleştirin ve kalın ve ince bağırsağı nazikçe çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Bağırsağı ıslatılmış bir gazlı bezin üzerine yerleştirin ve ciltle temas etmesini veya kurumasını önlemek için bir bezle örtün.
  4. AAV virüsünü portal ven içine 50 μL'lik bir hacimde 32 G steril bir iğne ile enjekte edin. İğneyi 3-5 mm'lik port damarına 5 dereceden daha az bir açıyla sokun. Geri akışı önlemek için kanın iğneyi 5 saniye boyunca geçmesine izin verin.
  5. Kanamayı önlemek için damarın tamamı kapanana ve kanama olmamasına (yaklaşık 5 dakika) kadar hafif bir basınçla enjeksiyon bölgesinin üzerine steril bir pamuklu çubuk ucu yerleştirin.
  6. İç organları yavaşça karın boşluğuna geri koyun.
  7. Karın duvarını ve cildi 4-0 ipek dikiş ile kapatın.

4. qRT-PCR analizi

  1. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir RNA izolasyon reaktifi kullanarak 50-100 mg karaciğer dokusundan 4,13 RNA'ları çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Rastgele heksamerler ve M-MLV ters transkriptaz20,21 ile toplam RNA'lardan 1. iplikli cDNA'ları sentezleyin.
  3. Daha önce yayınlanmış raporları22,23 takip eden tek renkli gerçek zamanlı PCR tespit sistemi ve süper karışım SYBR yeşil reaktifini kullanarak hedef gen ve referans genler arasındaki ΔC(t) değerlerini belirleyin.
  4. Dört biyolojik kopyadan ve üç teknik tekrardan (n = 12) ΔΔC(t) değerlerini ölçün. Tüm reaksiyonlar içinTm'yi 60 °C'ye ayarlayın. Rps3 ve Rplp0 olmak üzere iki referans gen kullanarak sonuçları onaylayın.
  5. Astar dizilerini aşağıdaki gibi tasarlayın: Ns, 5'-gtc, tga, tct agt, acc, aaa, gg-3' ve 5'-ggg aaa, cca, atc, act, cca, ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' ve 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' ve 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Sonuçlar

Karaciğerde KD geninin intrasplenik vs. AAV8-shRNA'nın portal ven enjeksiyonu
AAV8 viral stokları, mililitre başına (gc/mL) 2E+12 genom kopyası (gc) çalışma konsantrasyonuna seyreltildi. Bireysel farelere intrasplenik veya portal ven enjeksiyonu yoluyla 1E+11 gc AAV8-shNS1 veya AAV8-shScr (50 μL) enjekte edildi. Enjeksiyondan iki hafta sonra, RNA izolasyonu, 1st iplikli cDNA sentezi ve qPCR analizi için karaciğer dokuları toplandı. Sonuçlar, intrasplenik enjeksiyon yönteminin, iç referans olarak Rsp3 ± Rplp0 kullanılarak portal ven enjeksiyon yöntemiyle (.3 ± %3.6) istatistiksel olarak aynı NSKD verimliliğine ( .8 %4.4) ulaştığını gösterdi (Şekil 2). Daha da önemlisi, intrasplenik enjeksiyon prosedürü 15 dakika içinde tamamlanabilir ve prosedürden neredeyse hiç ölüm olmazken, portal ven enjeksiyon yöntemi normalde çok fazla pratikle 25-30 dakika gerektirir ve daha yüksek bir mortalite oranı ile ilişkilendirilmiştir (~% 25 -% 30 mortalite oranı).

Doku inflamatuar yanıtı
Karaciğer dokuları, portal ven enjeksiyonu veya intrasplenik AAV8-shScr (Şekil 3A) veya AAV8-shNS1 (Şekil 3B) enjeksiyonu alan farelerden toplandı ve kontrol farelerininkiyle karşılaştırıldı (Şekil 3C). İnflamatuar reaksiyonlar H&E boyama4 ile incelendi. Sonuçlar, ne AAV8-shScr ne de AAV8-shNS1'in, intrasplenik enjeksiyon (Spl) veya portal ven enjeksiyonu (PV) yöntemi ile enjekte edilen PBS'ye kıyasla karaciğer parankiminde kayda değer inflamatuar reaksiyonlar ortaya çıkarmadığını gösterdi (Şekil 3A-C).

figure-results-1
Şekil 1: AAV8-shRNA tasarımı ve intrasplenik enjeksiyon prosedürünün çizimleri. (A) (Üst) İn vivo knockdown deneyleri için adeno ilişkili virüs serotip 8 (AAV8) yapmak üzere tasarlanmış AV5-siRNA-GFP plazmitinin diyagramı. AV5-siRNA-GFP, bir CMV promotörü güdümlü shRNA dizisi ve EGFP içerir. (Altta) Fare NS'sinde (shNS1) 21 nükleotid dizilerini veya şifreli 21 nükleotid dizisini (Scr) hedeflemek için tasarlanmış küçük firkete RNAi yapıları. (B) İntrasplenik AAV8 enjeksiyon prosedüründe şematik bir iş akışı diyagramı. (C) Cerrahi prosedürün adım adım görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İntrasplenik ve portal ven enjeksiyonu yoluyla karaciğerdeki nükleosteminin (NS) AAV8-shRNA aracılı yıkımının verimlilikleri. AAV8-shScr veya AAV8-shNS1'in intrasplenik (Spl) veya portal ven (PV) enjeksiyonunu aldıktan 2 hafta sonra farelerden toplanan karaciğer örneklerinde NS ekspresyonunun qRT-PCR testleri11 gc. Grafikler, Rps3 (A) ve Rplp0 (B) olmak üzere iki dahili kontrole atıfta bulunan sonuçları gösterir. Çubuklar, her biri üç PCR teknik tekrarına sahip dört biyolojik replikanın ortalama ± SEM'ini gösterir; *p < 0.01; **p < 0,001; p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: PBS, AAV8-shScr veya AAV8-shNS1'in intrasplenik enjeksiyonu veya portal ven enjeksiyonu sonrası karaciğer dokularının histolojisi. AAV8-shScr (A) veya AAV8-shNS1 (B)'nin intrasplenik enjeksiyonu (Spl) veya portal ven enjeksiyonundan (PV) 2 hafta sonra, kontrol AAV8 enjeksiyonu yapılmamış numunelere (C) kıyasla karaciğer dokularının H&E boyanması. Ölçek çubukları: 100 μm. Sağ paneller, sol panellerdeki iç kısımların büyütülmüş görünümlerini gösterir. Ölçek çubukları: 50 μm. Her grupta iki farklı hayvandan altı ila dokuz kesit incelendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Vahşi tip bir arka planda 24,25 shRNA eksprese eden bir yapının veya floxlu bir arka planda26 Cre rekombinaz eksprese eden yapının viral olarak verilmesiyle gen KD, gen fonksiyonunu in vivo olarak indüklenebilir, zaman kontrollü bir şekilde sorgulamanın güçlü bir yoludur. İn vivo gen KO/KD çalışmaları için ideal bir uygulama yöntemi, ilgilenilen organda yüksek bir KO/KD etkinliği sağlamalı ve buna ek olarak, prosedürün kendisi minimum peri/postoperatif mortalite ile teknik olarak kolay olmalıdır.

Karaciğer gibi iç organlar için, viral partiküller kuyruk veni27 veya portal ven 28,29 yoluyla enjeksiyonla veya dalağa doğrudan enjeksiyonla (intrasplenik enjeksiyon)30,31 verilebilir. Portal ven ve intrasplenik enjeksiyonlar, viral partikülleri portal dolaşıma sokar ve bu partiküller inferior vena kavaya ve daha sonra pulmoner dolaşıma girmeden önce karaciğere akar. Buna karşılık, kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla sokulan viral partiküller portal dolaşımı atlar ve sistemik dolaşıma ulaşmadan önce pulmoner dolaşıma girer. Karaciğer gibi portal dolaşımı alan organlar için, portal ven ve intrasplenik enjeksiyonlar, viral partiküllerin akciğer tarafından tutulma veya sistemik dolaşımda seyreltme riski olmadan doğrudan bu organlara iletilmesi avantajını sunar. Beyin gibi portal dolaşımı almayan organlar için, kuyruk veni enjeksiyonu, viral partikülleri pulmoner dolaşıma ve daha sonra sistemik dolaşıma ulaşmadan karaciğere maruz bırakmamak için daha faydalı olabilir.

Bu çalışmada, hayvan başına 1E+11 gc'lik bir dozda AAV8-shNS1'i enjekte ettik, bu da 1E+10 gc'ye kıyasla daha iyi bir KD verimliliği sağladı, ancak intraportal enjeksiyon yoluyla 5E+11 gc ile aynı KD etkisini elde etti (veriler gösterilmemiştir). 1E+11 gc dozunda, portal ven enjeksiyon yöntemi ile intrasplenik enjeksiyon yöntemi karşılaştırıldığında, bu yöntemler arasında karaciğerdeki NSKD etkinliği açısından istatistiksel bir fark bulunmadı ve %70-80 KD etkinliği elde edildi. Karaciğerde portal ven enjekte edilen AAV8'in gen KD etkisi, yapıya bağlı bir şekilde altı haftaya kadar sürebilir23. Özellikle, ameliyata bağlı kanama ve omentum/periton yapışması gibi işleme bağlı komplikasyonların yanı sıra teknik zorluklar, intrasplenik enjeksiyon yöntemi için portal ven enjeksiyon yöntemine kıyasla önemli ölçüde daha az ve daha düşüktür. Sonuç olarak, portal ven enjeksiyonu bir kez yapılırken, intrasplenik enjeksiyon tekrar tekrar yapılabilir32. Son olarak, portal ven enjeksiyonu veya intrasplenik AAV8-shScr veya AAV8-NS1 enjeksiyonu alan karaciğerlerin parankiminde inflamatuar yanıtlar yok denecek kadar azdı. Bununla birlikte, son bulgu, aşırı yüksek AAV titrelerinin hala deneysel bulguları karıştıran inflamatuar yanıtları tetikleyebileceği olasılığını dışlamaz. Bu nedenle, optimal AAV dozajının ampirik olarak belirlenmesi ve KD verimliliği ile AAV8 ile indüklenen reaksiyon arasında dengelenmesi gerekir ve farklı hedeflenen genler ve/veya diziler arasında değişebilir. Sonuç olarak, bu sonuçlar AAV8-shRNA'nın intrasplenik enjeksiyonunun karaciğerde in vivo gen KD elde etmek için oldukça etkili, nispeten güvenli ve basit bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, RYT'ye Teksas Kanser Önleme Araştırma Enstitüsü (CPRIT) Bireysel Araştırmacı Araştırma Ödülü (RP200081) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amicon filtre santrifüj üniteleriMilliporeSigmaUFC9100Hızlı ultrafiltrasyon
AV5-siRNA-GFP Ekle #124972Plazmid
Yetkin DH5 & alfa; bakteri & nbsp;Invitrogen# 18265-017Klonlama için kimyasal olarak yetkin suş  
HpaI New England BiolabsR0105Restriksiyon enzimi
iMFectin transfeksiyon reaktifi GenDepotI7100-101
M-MLV ters transkriptaz PromegaM1708RNA'ya bağımlı DNA polimeraz 
MyiQ tek renkli gerçek zamanlı PCR tespit sistemi Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoksin içermeyen kit BioteckD6915-03Plazmid DNA midi hazırlığı;
Rastgele heksamerler Invitrogen48190-011
Supermix SYBR yeşil reaktifi Bio-Rad1708882Gerçek zamanlı PCR uygulamaları
T4 DNA LigazPromegaM1801
TRIzol Reaktifi Yaşam Teknolojileri15596-018Yüksek kaliteli toplam RNA'nın izolasyonu
XhoINew England BiolabsR0146Kısıtlama enzimi

Kaynaklar

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AAV8 ile letimKaraci er Gen EkspresyonuPortal Ven EnjeksiyonuNucleostemin Bask lanmasFare Karaci eriRNA nterferansKaraci er Rejenerasyonu

İlgili makaleler