Akış Sitometrisi ile Puromisin İçermesini Ölçmek için Kimya Kullanarak Lenfoid Hücrelerde Metabolizmayı İnceleme Yöntemi

Özet

Protokol, hücrelerde enerji metabolizmasını incelemek için kimyayı kullanan akış sitometrisi tabanlı bir yöntemi göstermektedir.

Özet

Antijen stimülasyonu üzerine, naif T hücreleri hızlı proliferasyona ve efektör T hücrelerine genişlemeye uğrar. Metabolizma, hızla çoğalan bu hücreler için gerekli olan biyokütlenin üretilmesinde ve enfeksiyon veya kanserlerde adaptif bağışıklık tepkisinin sonucunu etkileyen efektör T hücresi farklılaşması ve işlevi için gerekli moleküllerin üretilmesinde önemli bir rol oynar. Naif T hücreleri, büyümelerini, biyosentezlerini ve efektör fonksiyonlarını desteklemek için gerekli olan ATP oluşumunu artırmak için antijenik stimülasyon üzerine metabolizmalarını yeniden programlar. ATP, bir hücrede mitokondriyal-oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yolu veya glikolitik yol ile üretilebilir. Bölünen, büyüyen bir hücrede üretilen ATP'nin çoğu proteinlerin sentezi için kullanıldığından, protein sentezi ATP seviyeleri için bir vekil olarak kullanılmıştır. Protein sentezi, modifiye edilmiş bir tirozin ile yüklenmiş bir tRNA'nın 3' adenosinini taklit eden ve protein translasyonunun kendiliğinden sonlandırılmasına yol açan puromisinin dahil edilmesiyle ölçülebilir. Glikolitik yolu bloke eden 2-deoksiglukoz (2DG) ve elektron taşıma zincirinin (ETC) kompleks 5'ini bloke eden Oligomisin (O) gibi metabolik inhibitörler, hücresel ATP üretiminin bu iki yol üzerindeki bağımlılıklarını incelemek için kullanılabilir. Burada, kimya kullanarak akış sitometrisi ile puromisin katılımını tespit eden bu yöntemin bir varyasyonunu açıklıyoruz. Metabolizmayı incelemek için bu yöntem nispeten kolaydır ve nadir hücre popülasyonlarının yanı sıra hasta örneklerini akış sitometrisi ile değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Son yıllarda, T hücrelerinin düzenlenmesinde metabolizmanın önemli rolü giderek daha fazla takdir edilmektedir. Hücresel metabolizma, patojene özgü T hücrelerinin klonal genişlemesi ve patojenleri öldürmek için gerekli olan inflamatuar sitokinler ve sitolitik granzimler dahil olmak üzere çeşitli efektör molekülleri sentezleyen efektör hücre alt kümelerine farklılaşması dahil olmak üzere lenfositlerde birçok kritik işlevi düzenler¹. Bu nedenle T hücresi metabolizmasının incelenmesi hem normal T hücresi fonksiyonunun değerlendirilmesi hem de potansiyel terapötiklerin geliştirilmesi için önemlidir.

Protokol

Hayvancılık ve deneyler, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi (NIH) tarafından onaylanan protokol G98-3'e ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi (NIH) tarafından onaylanan LISB 22E protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 6-12 haftalık erkek C57Bl / 6J fareleri, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullarda yetiştirildi ve barındırıldı. Dişi farelerde de benzer sonuçlar elde edildi. İnsan tam kanı, NIH Klinik Merkezi IRB onaylı protokol 99-CC-0168 In Vitro Araştırma Kullanımı için Sağlıklı Donörlerden Kan Bileşenlerinin Toplanması ....

Sonuçlar

Naif CD4 ⁺ T hücreleri, farelerin dalak ve lenf düğümlerinden izole edildi ve 72 saat boyunca Th0 veya polarize olmayan (NP) soylara farklılaştırıldı. Hücreler 0 saat, 48 saat ve 72 saat kültürden sonra hasat edildi ve OPP katılımı, OPP'nin MFI'sine bakılarak ölçüldü. Naif CD4 ⁺ T hücreleri, OPP'nin MFI'si tarafından görüldüğü gibi, aktive edilmiş T hücrelerinden daha az sentetikti (Şekil 3). Naif hücreler kısmen glikolize bağımlıydı, ancak MFI tarafından değerlendirile.......

Tartışma

Bu makale, SCENITH teknolojisine dayanan, ancak dahil edilmiş puromisinin kimyasal etiketlemesini kullanan, akış sitometrisi ile lenfoid hücrelerdeki metabolizmayı incelemek için bir yöntem sağlar. Lenfositlere odaklanmış olsak da, bu protokol herhangi bir hücre tipinde metabolizmayı incelemek için ayarlanabilir. Bu yöntem aynı zamanda, Denizatı gibi diğer tekniklerin daha fazla sayıda hücre gerektirdiği nadir hücre popülasyonlarında ve hasta örneklerinde metabolizmayı incelemek için de .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Merkaptoetanol	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 anti-Puromisin Antikor Biolegend		381506	Kullanılan seyreltme: 1/100
Alexa Fluor 647 anti-insan CD4 Antikor	Biolegend	357422	Kullanılan seyreltme:  1/50
BD Horizon BUV737 Sıçan Anti-Fare CD4	BD Biosciences	612761	Kullanılan seyreltme:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Protein Sentezi Test Kiti	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
İnsan Serumu	Millipore Sigma	H4522
IMDM, GlutaMAX Takviyesi, 500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb anti-fare CD28, Klon:  37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb anti-fare CD3ε, Klon:  145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb anti-fare IFNγ, Klon:  XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb anti-fare IL-12 p40, Klon:  C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb anti-fare IL-4, Klon:  11B11	BioXcell	BE0045
L-Glutamin (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için	Thermo Fisher	L34966	Kullanılan seyreltme:  1/600
LSM lenfosit ayırma ortamı	MP Biomedicals	50494X
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)
Mitomisin C		Naif
EM Dereceli Elektron	Mikroskobu Bilimleri	15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 mL	Kaliteli Biyolojikler	114-058-101
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL). 100mL	Thermo Fisher	15140122
Fitohemaglutinin-L (PHA-L)	Milipore Sigma	11249738001
Premium Grade Fetal Sığır Serumu (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 Orta, glutamin içermez	Thermo Fisher	21870076
Saponin	Thermo Fisher	A18820.22
Sodyum Piruvat (100 mM)	Thermo Fisher	11360070

Streptomyces caespitosus Sigma'dan Thermo Fisher 11140050 CD4 İzolasyon Kiti, fare Miltenyi Biotec 130-104-453 Paraformaldehit %16 Sulu Çözelti