Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akış Sitometrisi ile Puromisin İçermesini Ölçmek için Kimya Kullanarak Lenfoid Hücrelerde Metabolizmayı İnceleme Yöntemi

978 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

15 Ağustos 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

Bu makalede

Özet

Protokol, hücrelerde enerji metabolizmasını incelemek için kimyayı kullanan akış sitometrisi tabanlı bir yöntemi göstermektedir.

Özet

Antijen stimülasyonu üzerine, naif T hücreleri hızlı proliferasyona ve efektör T hücrelerine genişlemeye uğrar. Metabolizma, hızla çoğalan bu hücreler için gerekli olan biyokütlenin üretilmesinde ve enfeksiyon veya kanserlerde adaptif bağışıklık tepkisinin sonucunu etkileyen efektör T hücresi farklılaşması ve işlevi için gerekli moleküllerin üretilmesinde önemli bir rol oynar. Naif T hücreleri, büyümelerini, biyosentezlerini ve efektör fonksiyonlarını desteklemek için gerekli olan ATP oluşumunu artırmak için antijenik stimülasyon üzerine metabolizmalarını yeniden programlar. ATP, bir hücrede mitokondriyal-oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yolu veya glikolitik yol ile üretilebilir. Bölünen, büyüyen bir hücrede üretilen ATP'nin çoğu proteinlerin sentezi için kullanıldığından, protein sentezi ATP seviyeleri için bir vekil olarak kullanılmıştır. Protein sentezi, modifiye edilmiş bir tirozin ile yüklenmiş bir tRNA'nın 3' adenosinini taklit eden ve protein translasyonunun kendiliğinden sonlandırılmasına yol açan puromisinin dahil edilmesiyle ölçülebilir. Glikolitik yolu bloke eden 2-deoksiglukoz (2DG) ve elektron taşıma zincirinin (ETC) kompleks 5'ini bloke eden Oligomisin (O) gibi metabolik inhibitörler, hücresel ATP üretiminin bu iki yol üzerindeki bağımlılıklarını incelemek için kullanılabilir. Burada, kimya kullanarak akış sitometrisi ile puromisin katılımını tespit eden bu yöntemin bir varyasyonunu açıklıyoruz. Metabolizmayı incelemek için bu yöntem nispeten kolaydır ve nadir hücre popülasyonlarının yanı sıra hasta örneklerini akış sitometrisi ile değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Son yıllarda, T hücrelerinin düzenlenmesinde metabolizmanın önemli rolü giderek daha fazla takdir edilmektedir. Hücresel metabolizma, patojene özgü T hücrelerinin klonal genişlemesi ve patojenleri öldürmek için gerekli olan inflamatuar sitokinler ve sitolitik granzimler dahil olmak üzere çeşitli efektör molekülleri sentezleyen efektör hücre alt kümelerine farklılaşması dahil olmak üzere lenfositlerde birçok kritik işlevi düzenler1. Bu nedenle T hücresi metabolizmasının incelenmesi hem normal T hücresi fonksiyonunun değerlendirilmesi hem de potansiyel terapötiklerin geliştirilmesi için önemlidir.

Naif T hücreleri metabolik olarak hareketsizdir ve enerji ihtiyaçları için katabolik metabolizmaya ve oksidatif fosforilasyona (OXPHOS) güvenir 1,2. T hücresi reseptörü (TCR) aktivasyonu üzerine, T hücreleri, kısmen hücrelerin yüzeyindeki besin taşıyıcılarının yukarı regülasyonu tarafından yönlendirilen hızlı metabolik yeniden programlamaya uğrar, bu da glikoz ve glutamin dahil olmak üzere çoklu amino asitlerin çevreden alımını arttırır. Bu besin yapı taşları daha sonra hücresel büyümeye katkıda bulunan makromolekülleri yapmak ve artan hücre büyümesi ve bölünmesi ile ilişkili artan enerji taleplerini desteklemek için anabolik yollarda kullanılır 1,2,3. Aktive edilmiş T hücrelerinde metabolik yeniden programlama, hücreleri enerji ihtiyaçları için aerobik glikoliz ve glutaminolize daha bağımlı hale getirir 1,2,3. TCR stimülasyonu üzerine, besinlerin alımı da aşağı akış moleküler yollarının3 aktive edilmesinde kritik bir rol oynar. Örneğin, amino asitlerin alımı ve artan yerel amino asit konsantrasyonu mTORC1 sinyaliniaktive eder 4. Tersine, hücre içi amino asitlerin mevcudiyetini azaltmak, mTORC1 sinyal yolu 2,3,5,6,7'yi azaltır. Böylece, metabolizma ve hücresel fonksiyon, bir efektör T hücresinde sıkı bir şekilde bağlanır.

Hızla bölünen T hücreleri için gerekli olan biyokütledeki büyük artış, protein sentezinin / translasyonunun yukarı regülasyonunu gerektirir8. Protein sentezi, bir hücrede, translasyon ribozomlarındanuzayan polipeptit zincirlerini dahil ederek, işaretleyerek ve serbest bırakarak translasyonu bloke eden bir tirozil-tRNA taklidi olan puromisin 9'un dahil edilmesini inceleyerek ölçülebilir. Protein translasyonu, yüksek enerjiye bağımlı bir süreçtir; gerçekten de, bölünen, büyüyen hücrelerde üretilen ATP'nin çoğu, proteinlerin sentezi için kullanılır. Bu nedenle, protein sentezi, hücresel ATP10 için vekil bir ölçüm olarak kullanılmıştır. ATP üretmek için hücreler genellikle glikolize ve/veya mitokondriyal OXPHOS yoluna11 güvenir. Glikoliz, glikoz molekülü başına iki ATP molekülü üretir. OXPHOS yolu, glikoz12,13 başına 36 ATP üretir, ancak glikoliz ATP'yi daha hızlı üretebilir14. Bu nedenle, kanser hücreleri gibi hızla bölünen aktive T hücreleri, ATP üretimi için büyük ölçüde glikolitik yola dayanır.

Bir hücrenin her bir metabolik yola bağımlılığı, spesifik inhibitörlerin kullanılmasıyla incelenebilir. Bir glikoz analoğu olan glikolitik yol inhibitörü 2-Deoksiglukoz (2-DG), glikolitik enzim hekzokinaz15 için rekabetçi bir inhibitör görevi görür. 2-DG, hekzokinaz tarafından 2DG-fosfata (2DG-P) fosforile edilir. 2DG-P, normalde glikoz-6-fosfatı (G-6-P) fruktoz-6-fosfat16'ya dönüştüren fosfoheksoz izomeraz tarafından daha fazla metabolize edilemez. Bu nedenle 2DG-P hücrelerde hapsolur ve birikir, bu da glikolizin inhibisyonuna ve hücresel ATP'nin tükenmesine yol açar, böylece protein sentezini bloke eder17. Benzer şekilde, hücrelerin mitokondriyal OXPHOS yoluna bağımlılığı, elektron taşıma zincirinin (ETC) ATP sentazının proton kanalına bağlanan ve böylece mitokondriyal ATP sentezini bloke eden Oligomisin kullanılarak incelenebilir (Şekil 1). Bu inhibitörlerin protein sentezinin değerlendirilmesi ile birlikte kullanılması, hücrelerin metabolik durumunun bir resmini sağlayabilir ve akış sitometrisi10 kullanarak puromisin katılımını değerlendiren SCENITH olarak bilinen güçlü bir tek hücreli yöntemde kullanılmıştır. Bununla birlikte, SCENITH reaktiflerinin mevcudiyeti sınırlayıcı olabilir. Glikoliz ve OXPHOS'u değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan diğer teknikler, deneysel olarak mümkün olmayabilecek daha büyük hücre sayıları gerektiren Denizatı hücre dışı akı analizlerini içerir. Bu makalede, ticari olarak temin edilebilen bir Click-it kimya reaktifi kullanarak puromisin katılımını değerlendirmek için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemin kolaylığı, nadir hücre popülasyonları ve hasta örnekleri dahil olmak üzere lenfositlerin metabolik durumunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvancılık ve deneyler, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi (NIH) tarafından onaylanan protokol G98-3'e ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi (NIH) tarafından onaylanan LISB 22E protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 6-12 haftalık erkek C57Bl / 6J fareleri, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullarda yetiştirildi ve barındırıldı. Dişi farelerde de benzer sonuçlar elde edildi. İnsan tam kanı, NIH Klinik Merkezi IRB onaylı protokol 99-CC-0168 In Vitro Araştırma Kullanımı için Sağlıklı Donörlerden Kan Bileşenlerinin Toplanması ve Dağıtımı kapsamında NIH Kan Bankasından elde edildi. Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak tüm deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Fare naif CD4+ T hücre izolasyonu ve kültürü

  1. Üreticinin protokolüne göre bir manyetik hücre ayırma sistemi kullanarak 6 ila 12 haftalık erkek farelerden fare dalağı veya lenf düğümlerinin havuzlanmış tek hücreli süspansiyonlarından negatif seçim yaparak saf CD4 + T hücrelerini saflaştırın.
  2. L-alanil-L-glutamin dipeptid içeren ve% 10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 U / mL streptomisin ve 0.05 mM 2-β-merkaptoetanol ile desteklenmiş IMDM ortamında kültür hücreleri (aşağıda açıklandığı gibi).
  3. Mitomisin-C ile muamele edilmiş T-tükenmiş splenositlerle (aşağıda açıklanmıştır) 1: 8 oranında ko-kültür naif CD4 T hücreleri, polarize olmayan (1 μg / mL anti-CD3 [klon 2C11] ve 3 μg / mL anti-CD28 [klon 37.51]) ve Th0 koşulları (1 μg / mL anti-CD3, 3 μg / mL anti-CD28, 10 μg / mL anti-IFNg [klon XMG1.2], 37 ° C'de 72 saat boyunca anti-IL-12 [klon C17.8] ve anti-IL-4 [klon 11B11]). 48 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 x 106 APC ve 0.13 x 106 saf CD4 T hücresi kullanarak kültürleri ayarlayın (Malzeme Tablosu)
  4. APC'ler olarak mitomisin-C ile muamele edilmiş T-tükenmiş splenositlerin üretimi: Kısacası, fare dalağının tek hücreli bir süspansiyonunu FITC ile konjuge CD4 ve CD8 antikorları ile boyayın. Daha sonra, hücreleri Anti-FITC Mikro boncuklarla manyetik olarak etiketleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, üreticinin protokolüne göre bir manyetik hücre ayırma sistemi kullanarak, APC'leri T hücrelerinden negatif olarak seçin. Daha sonra, APC'leri 37 ° C inkübatörde 40 dakika boyunca 50 μg / mL Mitomisin C ile muamele edin, ardından 3 kez 1 x PBS ile yıkayın.

2. İnsan PBMC'lerinin izolasyonu ve kültürü

  1. Lenfosit ayırma ortamı kullanarak ve üreticinin protokolüne göre PBMC'leri tam kandan izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. 2 mM L-glutamin, 0.01 M HEPES, 1 mM sodyum piruvat, %1 esansiyel olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin ve Streptomisin, 0.05 mM 2-β-merkaptoetanol ve %5 İnsan Serumu ile desteklenmiş RPMI ortamındaki kültür PBMC'leri.
  3. Kültür: 37 ° C'de 18-24 saat boyunca 5 μg / mL Fitohemaglutinin-L (PHA-L) içeren U tabanlı 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 x 106 PBMC.

3. Metabolik tahlil

NOT: Tüm hücreleri, inhibitörleri [Oligomisin (O), 2-Deoksiglukoz (2-DG), DMSO (Co)] ve O-propargil-puromisin (OPP) reaktifini mümkün olduğunca 37 ° C'ye yakın tutmak önemlidir. Hücreleri, inhibitörleri ve OPP reaktifini U tabanlı 96 plakaya alın ve plakaları mümkün olduğunca 37 ° C'lik bir inkübatörde bırakın. Aliquot inhibitörleri 2-DG ve O, çoklu donma-çözülmeleri önlemek için daha küçük hacimlere dönüştürülür.

  1. 2-DG'lik 2 M (20x) stok çözeltisi ve O'nun 40 μM (40x) stok çözeltisi yapın. OPP için, 1 μL OPP'yi 49 μL ortamda seyreltin, böylece konsantrasyon 400 μM olur - bu 20x stok çözeltisi olacaktır.
  2. Deneye başlamadan önce OPP protein sentez kitinin diğer tüm bileşenlerinin ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında (RT) olduğundan emin olun.
  3. Bileşen C şişesinden bir alikotu 1:10 oranında deiyonize su ile seyrelterek 1x OPP reaksiyon tamponu hazırlayın. Kullandıktan sonra, kalan 1x solüsyonu 2-8 °C'de saklayın.
  4. Her koşul (Co / DG / O / DGO) için yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakanın oyuğu başına 0.1-2 x10 6 hücre, 100 μL tam IMDM (fare CD4 T hücreleri için) veya tam RPMI'de (insan PBMC'leri için) veya tercih edilen herhangi bir tam ortam. Plakayı mümkün olduğunca inkübatörde tutun.
  5. Stok çözeltilerinden 1x inhibitör ekleyin (5 μL 20x DG, Co), (2.5 μL 40x O) ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin. Hücreler üzerindeki son konsantrasyonlar 100 mM DG ve 1 μM O'dur. İnhibitörleri hücrelerle bir pipetle dikkatlice karıştırın. Kolaylık sağlamak için, inhibitörleri 96 oyuklu bir plakada ayırın ve inhibitörlere hücreler ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
  6. DGO örneğine 1x DG (5 μL) ekleyin, bir pipetle dikkatlice karıştırın ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra 1x O (2,5 μL) ekleyin, birkaç kez pipetleyin ve 37 °C, %5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.
  7. İnhibitörleri yıkamadan, konsantrasyon hücrelerde 20 μM olacak şekilde her numuneye 20x (400 μM) stok çözeltisinden 5 μL OPP ekleyin, birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin,% 5 CO2. Kolaylık sağlamak için, OPP'yi 96 oyuklu bir plakaya alın, OPP reaktifine inhibitörlü hücreler ekleyin ve iyice karıştırın.
    NOT: Daha az metabolik olarak aktif hücreler ve doğrudan ex vivo izole edilen hücreler için, OPP ilavesinden sonra inkübasyon süresini artırın. OPP ile inkübasyon süresinin her hücre tipi için standartlaştırılması gerekir.
  8. OPP ile inkübe ettikten sonra, 100-150 μL buz gibi soğuk FACS Tamponu (1x PBS'de% 2 FBS ve 1 mM EDTA) ekleyin. 750 x g'da 4°C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve yıkama adımını tekrarlayın.
  9. Hücreleri uygun yüzey belirteçleri, anti-fare CD4 antikoru (1/200 seyreltmede kullanılır) veya anti-insan CD4 antikoru (1/50 seyreltmede kullanılır), Canlı / Ölü reaktif (1/600 seyreltmede kullanılır), Fc Blok varlığında (1/200 seyreltmede kullanılır) boyayın. Karanlıkta 4 °C'de 25-30 dakika inkübe edin.
  10. Plakayı 150-200 μL FACS tamponu ile yıkayın ve 750 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için plakayı hafifçe vurun, ardından yıkama adımını tekrarlayın. Bu aşamada, hücreler yüzeyde lekelenir.
  11. Hücreleri PBS'de% 1 PFA'da yeniden süspanse edin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10-15 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.
  12. FACS Tampon ile yıkayın ve 750 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin ve yıkamayı tekrarlayın.
  13. Hücre peletini 200 μL soğuk 1x Saponin geçirgenlik tamponunda (1x PBS'de %0.1 (ağırlıkça/hacim) Saponin + %3 FBS) yeniden süspanse edin. RT'de inkübe edin, 5-15 dakika ışıktan korunun. Hücreler şu anda sabitlenir ve geçirgendir.
  14. 10x çözeltiyi 1:10 oranında deiyonize suda seyrelterek 1x OPP reaksiyon tamponu katkı maddesi (Bileşen E) hazırlayın. Bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın ve aynı gün kullanın.
  15. OPP reaksiyon kokteylini Tablo 1'e göre hazırlayın. Reaksiyon kokteylini hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde kullanın.
  16. Adım 3.13'teki numuneleri 750 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücreleri 2 kez 200 μL 1x Saponin geçirgenlik tamponu ile yıkayın. Süpernatanı döndürün ve atın.
  17. Her bir oyuğa 50-100 μL OPP reaksiyon kokteyli (adım 3.12'de hazırlanır) ekleyin ve iyice karıştırın. RT'de ışıktan korunarak 30 dakika inkübe edin. Ardından, plakaları 750 x g'da veya 4 °C'de 2 dakika döndürün. Süpernatanı atın.
  18. Peletleri 200 μL 1x Saponin geçirgenlik tamponu ve santrifüj numunelerinde 750 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Süpernatanı atın.
  19. Kuyucuk başına 50 μL Reaksiyon Durulama Tamponu (Bileşen F) içinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 750 x g'da santrifüjleyin. Lekeli hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  20. Numuneleri aynı gün akış sitometrisi ile analiz edin (Ek Şekil 1'e bakınız) veya hücreleri karanlıkta 4 ° C'de saklayın ve ertesi gün analiz edin.

4. Metabolik tahlilin analizi

  1. Aşağıdaki koşullar altında protein sentezi için bir vekil olarak puromisin (OPP) dahil edilmesini ölçün: 1) kontrol koşulu (Co); 2) glikolitik yolun 2-DG tarafından bloke edildiği hücrelerde; 3) mitokondriyal OXPHOS yolunun O tarafından bloke edildiği hücrelerde; ve 4) hem glikolitik hem de mitokondriyal yolların inhibitörler (DGO) tarafından bloke edildiği hücrelerde, OPP'nin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) değerlendirerek (Şekil 2).
  2. Her koşulda OPP'nin MFI'sine bakarak hücrelerin belirli bir yola bağımlılığını analiz edin. MFI'yi doğrudan protein sentezinin bir ölçüsü olarak değerlendirin. Glikoz bağımlılığını, glikolitik kapasiteyi, yağ asidi oksidasyonu (FAO) ve amino asit oksidasyon (AAO) kapasitesini ve mitokondriyal bağımlılığı10'a göre hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Naif CD4 + T hücreleri, farelerin dalak ve lenf düğümlerinden izole edildi ve 72 saat boyunca Th0 veya polarize olmayan (NP) soylara farklılaştırıldı. Hücreler 0 saat, 48 saat ve 72 saat kültürden sonra hasat edildi ve OPP katılımı, OPP'nin MFI'sine bakılarak ölçüldü. Naif CD4 + T hücreleri, OPP'nin MFI'si tarafından görüldüğü gibi, aktive edilmiş T hücrelerinden daha az sentetikti (Şekil 3). Naif hücreler kısmen glikolize bağımlıydı, ancak MFI tarafından değerlendirile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, SCENITH teknolojisine dayanan, ancak dahil edilmiş puromisinin kimyasal etiketlemesini kullanan, akış sitometrisi ile lenfoid hücrelerdeki metabolizmayı incelemek için bir yöntem sağlar. Lenfositlere odaklanmış olsak da, bu protokol herhangi bir hücre tipinde metabolizmayı incelemek için ayarlanabilir. Bu yöntem aynı zamanda, Denizatı gibi diğer tekniklerin daha fazla sayıda hücre gerektirdiği nadir hücre popülasyonlarında ve hasta örneklerinde metabolizmayı incelemek için de ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

PBMC örnekleri ve değerli deneysel öneriler sağladıkları için Dr. Qin Xu ve Dr. Avik Dutta'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen NIAID, NIH Intramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 anti-Puromisin Antikor Biolegend381506Kullanılan seyreltme: 1/100
Alexa Fluor 647 anti-insan CD4 AntikorBiolegend357422Kullanılan seyreltme:  1/50
BD Horizon BUV737 Sıçan Anti-Fare CD4BD Biosciences612761Kullanılan seyreltme:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Protein Sentezi Test KitiThermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
İnsan SerumuMillipore SigmaH4522
IMDM, GlutaMAX Takviyesi, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb anti-fare CD28, Klon:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb anti-fare CD3ε, Klon:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb anti-fare IFNγ, Klon:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb anti-fare IL-12 p40, Klon:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb anti-fare IL-4, Klon:  11B11BioXcellBE0045
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher25030081
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma içinThermo FisherL34966Kullanılan seyreltme:  1/600
LSM lenfosit ayırma ortamıMP Biomedicals50494X
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)
Mitomisin CNaif
EM Dereceli ElektronMikroskobu Bilimleri15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 mLKaliteli Biyolojikler114-058-101
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL). 100mLThermo Fisher15140122
Fitohemaglutinin-L (PHA-L)Milipore Sigma11249738001
Premium Grade Fetal Sığır Serumu (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Orta, glutamin içermezThermo Fisher21870076
SaponinThermo FisherA18820.22
Sodyum Piruvat (100 mM)Thermo Fisher11360070
Streptomyces caespitosus Sigma'dan Thermo Fisher 11140050 CD4 İzolasyon Kiti, fare Miltenyi Biotec 130-104-453 Paraformaldehit %16 Sulu Çözelti

Kaynaklar

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lenfoid H cre MetabolizmasT H cresi ProliferasyonuProtein SenteziMetabolik Yeniden ProgramlamaGlikolitik YolakOksidatif FosforilasyonMetabolik nhibit rlerSCENITH Y ntemi
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.