Method Article

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

DOI:

10.3791/67378

⸱

November 1st, 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmodesmata, bitişik bitki hücrelerinin sitoplazmasını birbirine bağlayan ve besinlerin, makromoleküllerin ve istilacı virüslerin hücreden hücreye ticaretini sağlayan zarlı nanogözeneklerdir. Plazmodesmata, hücreler arası iletişimin düzenlenmesinde temel roller oynar, bitki gelişimine, çevresel tepkilere ve viral patojenlerle etkileşimlere katkıda bulunur. Bitki veya viral proteinlerin plazmodesmal lokalizasyonunu keşfetmek, protein hakkında yararlı fonksiyonel bilgiler sağlayabilir ve bitki-virüs etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamak için önemlidir. Bu çalışmaları kolaylaştırmak için, virüs-plazmodesmata etkileşimlerini veya plazmodesmal transportu incelemek için en iyi plazmodesmal markörü seçmek için farklı plazmodesmal hedefleme proteinlerinin konfokal mikroskopi tabanlı analizi için bir protokol açıklıyoruz. Spesifik olarak, bu olayların analizleri, Şalgam damar temizleme virüsünün (TVCV) hücreden hücreye hareket proteini (MP), Arabidopsis Plasmodesmata-Lokalize Protein 5 (PDLP5) ve Plasmodesmata Nasır Bağlayıcı Protein 1 (PDCB1) kullanılarak gösterilmiştir. Protein plazmodesmal lokalizasyon verileri, örneklenen dokuların anilin mavisi boyaması kullanılarak plazmodesmatanın global görselleştirmesine paralel olarak analiz edilir. Bu yaklaşımlar, plantadaki herhangi bir hücresel veya patojen proteinin plazmodesmal lokalizasyonunu analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmodesmata (PD), hücreler arası iletişimin düzenlenmesi yoluyla bitki gelişimini, çevresel tepkileri ve viral patojenlerle etkileşimleri kontrol etmede temel bir rol oynar 1,2. PD başlangıçta sitokinez sırasında oluşur, iki yavru hücre arasındaki yeni hücreye yüzlerce PD yerleştirilir ve böylece hücreden hücreye iletişim kanallarını sağlar 3,4. PD, plazma zarı 3,4 tarafından kaplanan gözeneklerin orta kısmında bir trans-PD desmotubülü olan endoplazmik retikulum (ER) türevi zarı içeren zardan zengin bir yapıdır. Karşılaştırmalı proteomik yaklaşımlar, β-1,3-glukanazlar (BG'ler), kalloz sentazlar (CALS'ler), plazmodesmata yerleşimli proteinler (PDLP'ler), kalloz bağlayıcı proteinler (PDCB'ler), çoklu C2 alanları transmembran bölge proteinleri (MCTP'ler)3 ve lösin açısından zengin tekrar reseptörü benzeri kinazlar (RLK) dahil olmak üzere çok sayıda PD fonksiyonel proteini tanımladı5. Son zamanlarda, Kirk ve ark. plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1) adı verilen bir araç geliştirdi ve bu da 22 bitki türünde yeni PD proteinlerini tahmin etmeyi mümkün kıldı6. PD, bitki gelişimi sırasında geçirgenlik ve yapı bakımından değişir ve çeşitli streslere tepki verir. PD'yi çevreleyen boyun bölgesinde kalloz (β-1,3-glukan) birikimi ve hidrolizi, PD regülasyonu7'nin yaygın olarak bilinen mekanizmalarından biridir.

Mantarlar, bakteriler ve virüsler dahil olmak üzere birçok patojenik mikrop, enfeksiyonları sırasında PD genişlemesini veya yapısını manipüle edebilir 2,8,9. Pirinç patlamasının etken maddesi olan Magnaporthe oryzae, PD8 yoluyla hücreden hücreye hareket etmek için hücre içi invaziv hifleri dağıtır. Bakteriyel bir patojen Pseudomonas syringae pv. domates, hücreler arası hareket için bir efektör protein HopO1-1 gerektirir ve PDLP7 ile etkileşime girerek ve kararsızlaştırarak konakçı bitkide yayılır, böylece Arabidopsis9'daki komşu hücrelerdeki moleküler akıyı arttırır. Bununla birlikte, bitki virüsleri, hücreden hücreye hareketi teşvik eden viral hareket proteini (MP) ile hücreler arası iletimleri sırasında PD'yi düzenlemede daha çok yönlüdür2. Bitki gelişimi ve büyümesinin düzenlenmesindeki önemli işlevlerinin yanı sıra bitki patojenik mikropları ile etkileşimleri nedeniyle, PH son yıllarda artan bir ilgi kazanmıştır. Arabidopsis thaliana'da, PDLP'ler (1-8) ve PDCB'ler (1-5) olmak üzere iki ana PD fonksiyonel protein türü vardır ve bunların çoğunun, örneğin, PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 ve PDCB115'in, kalloz birikiminin düzenlenmesi yoluyla PD geçirgenliğini manipüle etmede rol oynadığı bulunmuştur. Bununla birlikte, bazı PDLP'lerin fonksiyonel bir fazlalığa sahip olduğu bulunmuştur, örneğin, pdlp1 ve pdlp1,2'nin nakavt mutantları moleküler trafiği etkilememiştir, ancak pdlp1,3 ve pdlp2,3'ün çift nakavt mutantları artmış plazmodesmal geçirgenlikgöstermiştir 16. İlginç bir şekilde, tek başına PDLP5'in aşağı regülasyonu/nakavtı veya aşırı ekspresyonu, sırasıyla plazmodesmal geçirgenlikte bir artış veya azalma ile sonuçlanır, 1,17. Son zamanlarda, Li ve ark. PDLP5 ve PDLP6'nın farklı hücre arayüzlerinde işlev gördüğünü bulmuşlardır13. Bu sonuçlar, PDLP5'in diğer PDLP'lerle yedekli olmayan işlevlere sahip olabileceğini göstermektedir.

PD'nin hücreler arası iletişimdeki kritik işlevi nedeniyle, bitki PD proteinleri PDLP5 ve PDCB1'i ve Şalgam damar temizleme virüsünün (TVCV) viral hücreden hücreye hareket proteinini (MP) hücre biyolojisi deneyleri için basit, kullanışlı ve güvenilir PD belirteçleri olarak dağıtmak için bir protokol geliştirdik. Daha fazla doğrulama için, örneklenen dokuların anilin mavisi boyanması kullanılarak PD'nin görselleştirilmesi paralel olarak ilerledi. PDLP5, PDCB1 ve TVCV MP'nin PD lokalizasyonu için açıklanan protokoller, canlı bitkilerde herhangi bir hücresel veya patojen türevli proteinin potansiyel PD lokalizasyonunu analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyümesi

  1. Nicotiana benthamiana tohumlarını ıslak toprakta, 23 ° C'de, 16 saat ışık ve 8 saat karanlıkta kontrollü bir ortam odasında büyütün.
  2. Yaklaşık 2 hafta sonra, fideleri köklerinin etrafındaki turba peletleri ile dikkatlice daha büyük saksılara aktarın ve agroinfiltrasyon deneyleri için 4-5 hafta boyunca aynı koşullar altında büyümeye devam edin.
    NOT: Bitkileri çiçek açmaya başladıklarında kullanmayın, çünkü GFP birikimi çiçeklenme aşamasında18 azalacaktır.

2. Vektör yapımı

  1. Q5 Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz ile ilgilenilen kodlama dizilerini çoğaltmak için PCR kullanın ve bunları ticari olarak temin edilebilen bir BP Klonaz kiti kullanarak BP reaksiyonu19 ile giriş vektörü pDONR207'ye klonlayın.
  2. Elde edilen giriş plazmitlerindeki hedef genleri, hedef proteinlerin C-terminaline kaynaşmış EGFP etiketi ile plazmitler üretmek için ticari olarak temin edilebilen bir LR Klonaz kiti kullanarak LR reaksiyonu19 ile hedef vektör pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1'e aktarın.
  3. Tüm yapıları PCR ve sıralamaile doğrulayın 19.

3. Tarımsal Filtrasyon

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 hücreleri, LB agar plakaları üzerinde farklı vektörler içerir ve 28 °C'nin altında 2 gün inkübe edilir.
  2. Tek bir koloniyi 2 mL LB et suyuna aktarın ve gece boyunca 28 ° C'de çalkalama (250 rpm) ile inkübe edin.
  3. Gece boyunca kültürden 1 mL çıkarın, ardından 4 mL taze LB suyu ekleyin ve aynı koşullar altında 1 saat yeniden kültürleyin.
  4. Bakteriyel süspansiyonu infiltrasyon tamponu (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5.6).
  5. OD600 = 0.1'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için farklı bakteri süspansiyonlarını 1: 1 (v / v) oranında karıştırın. (isteğe bağlı).
  6. Bakteriyel süspansiyonu yumuşak çalkalama ile oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin.
  7. 1 mL iğnesiz tek kullanımlık şırınga ile farklı bitkilerden tamamen genişlemiş yaprakların abaksiyal yüzeyine sızın ve sızan alanı (çevreleyen, sızmamış dokudan daha koyu bir renk) su geçirmez bir kalemle işaretleyin.
  8. Bu protokolün Konfokal mikroskopi bölümüne ilerleyin (adım 5).
    NOT: İlgilenilen bitki türlerinin dönüşümü için uygun olan diğer Agrobacterium tumefaciens suşları da kullanılabilir.

4. Anilin mavisi lekesi

  1. Bir mikroskop lamına200 μL% 1 anilin mavisi (50 mM potasyum fosfat tamponunda, pH 8.0) bir alikot ekleyin.
  2. Damardan yaklaşık 0,5 cm × 0,5 cm uzakta sızan alanı bir bıçakla eksize edin ve yaprak doku örneklerini mikroskop lamı üzerindeki anilin mavisi solüsyonuna (abaksiyal tarafı yukarı) aktarın ve yaprak doku numunelerinin anilin mavisi solüsyonuna batırıldığından emin olun ve ardından bir kapak camı (22 mm x 50 mm) ile örtün.
  3. Mikroskop slaytlarını numunelerle birlikte bir vakum pompasına bağlı bir kurutucuya yerleştirin ve 2 dakika (<0.8 Pa) boşaltın, ardından basıncın yavaşça serbest bırakılması ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyon yapın.
  4. Anilin mavisinin floresan sinyalini, uyumlu yazılıma sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop altında görselleştirin.
    NOT: Burada Huang ve ark.20 tarafından üretilen anilin mavisi boyama yöntemi kullanılmıştır. Bu tekniğin bir modifikasyonunda, aynı deney 2 dakikalık vakum adımı olmadan gerçekleştirildi, bu da benzer sonuçlar verdi ve anilin boyama için vakumlu kurutmanın gerekli olmadığını düşündürdü. Ayrıca, anilin mavisi lekesinin konsantrasyonu ve lekelenme süresi, yaprak dokusunun kaynağına vb. göre değişebilir.

5. Konfokal mikroskopi

  1. Sızmadan sonra farklı zaman noktalarında iki bitkiden iki yaprak hasat edin. Sızma bölgesini bir bıçakla damardan yaklaşık 0,5 cm × 0,5 cm'lik dilimler halinde kesin.
    1. Doku örneklerini bir mikroskop lamının orta kısmındaki bir damla steril suya (abaksiyal tarafı yukarı) yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için bir kapak camı (22 mm x 50 mm) ile örtün.
  2. CFP, GFP ve RFP sinyallerinin tespiti için uyarma dalga boylarının sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 561 nm olduğundan ve algılama için emisyon filtrelerinin CFP için 410-602 nm ve EGFP ve RFP için 400-602 nm olduğundan emin olun, iğne deliği 1 AU ve Ana Kazanç 769 V olarak ayarlanmıştır.
  3. Sızmadan 1 gün, 2 gün, 3 gün, 5 gün, 7 gün ve 10 gün sonra uyumlu yazılıma sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak sızan alandaki otomatik floresan etiketlerin floresan sinyalini görselleştirin.
    1. Floresan sinyalli hücreleri bulmak için 10x objektif lens ve GFP filtreleri kullanın ve ardından hücre altı lokalizasyonun görselleştirilmesi ve görüntü kaydı için 40x objektif lense geçin.
  4. En az iki bağımsız biyolojik kopya kullanarak her koşul için 20 görüntü toplayın.
  5. Hücrenin çevresindeki sinyalin tanısal noktasal görünümüne dayalı olarak test edilen proteinin PD lokalizasyonuskoru 21,22.
    NOT: Bilinmeyen bir proteinin hücre altı lokalizasyonunu tespit ederken, en az üç bitki kullanılması önerilir.

6. Veri analizi

  1. Kanalları bölmek ve görselleştirme için ölçek çubuğunu görüntülere eklemek için Fiji yazılımını kullanın.
  2. Farklı zaman noktalarında GFP (MP, PDCB1 ve PDLP5 için) veya CFP (anilin mavisi boyama için) floresan yoğunluğunu değerlendirmek için her görüntünün ortalama gri tonlama değerini ölçmeden önce kanalları ayırmak için Fiji yazılımını kullanın.
  3. GFP (MP, PDCB1 ve PDLP5 için) veya CFP (anilin mavisi boyama için) görüntülerinin normalleştirilmesinden önce kanalları bölmek için Fiji yazılımını kullanın. Görüntünün alanı ölçüldü ve PD punkta manuel olarak sayıldı. 100μm2'deki PD punkta sayısı hesaplandı.
  4. İstatistik ve grafik yazılımı ile farklı örnekler ve farklı zaman noktaları arasındaki P değerlerini belirlemek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi23 ile iki yönlü ANOVA kullanın.
    NOT: Tek kanallı bir floresan görüntü için, her pikselin gri tonlama değeri, onokta 24'ün floresan yoğunluğunu temsil eder. Burada, her bir numunenin farklı zaman noktalarında floresan yoğunluğunu değerlendirmek için ortalama gri tonlama değeri kullanılmıştır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki fizyolojisinde PH fonksiyonu ve patojenlerle etkileşimler üzerine yapılan çalışmaları kolaylaştırmak için, PD lokalizasyonu için üç basit ve güvenilir referans protein geliştirilmiştir. İki hücresel PD proteini ve bitki tobamovirüsü TVCV tarafından kodlanan patojen türevli bir MP proteini seçildi. Bu proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, her bir proteinin C-terminaline kaynaşmış bir otofloresan raportör EGFP kullanılarak görselleştirildi. Alternatif bir yaklaşımda, PD ile ilişkili kalloz birikintilerinin anilin mavisi boyanması kullanılarak PD görselleştirildi. Deneyler, hem PDLP5'in hem de MP'nin, daha önce belirtildiği gibi, hücre çekirdeğinde de lokalize olan MP ile noktasal PD lokalizasyonu sergilediğini gösterdi (Şekil 1A)25. Buna karşılık, PDCB1'in PD ve ER arasında bölündüğü görülmüştür (Şekil 1A). GFP etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu yorumlamada daha az deneyimli araştırmacılar için, Şekil 1A ayrıca bitki hücrelerinde eksprese edilen EGFP'nin karakteristik nükleositoplazmik modelini de göstermektedir. PDCB1'in ER sinyalini doğrulamak için, PDCB1'i bir ER markörü ile birlikte ifade ettik ve PDCB1 sinyalinin ER markörünün sinyaliyle örtüştüğünü bulduk (Şekil 1B). Test edilen proteinlerin PD lokalizasyonunun etkinliğini değerlendirmek için, bu sinyalin PD lokalizasyonunu sergileyen floresan sinyali ifade eden hücrelerin yüzdesi hesaplanmıştır (Tablo 1).

Referans proteinleri kullanarak hücre altı lokalizasyonunun tanımlanması için, referans protein ekspresyonunun zaman ölçeğini ve lokalizasyonunun potansiyel değişikliklerini anlamak yararlıdır. Şekil 2 , MP, PDLP5 ve PDCB1 için PD'nin kendileri anilin mavisi boyama ile görselleştirildiğinde bu tür kinetikleri göstermektedir. Hem MP hem de PDLP5, infiltrasyondan bir günlük sonra (dpi) PD'de birikmeye başladı ve bu birikim 2 dpi'de belirgin bir maksimuma ulaştı ve 5 gün daha sabit kaldı, ardından sinyal yoğunluğu azaldı, büyük olasılıkla protein bozulması nedeniyle. PDCB1 hücre altı sıralamasının zaman seyri daha karmaşıktı: ilk 3 dpi için, PDCB1, PD'ye özgü sinyal lokalizasyonunu neredeyse tamamen gizleyen nispeten güçlü bir ER sinyali sergilerken, 5 dpi'de bu ikinci sinyal daha az hücrede de olsa daha belirgin hale geldi (Şekil 2). İlginç bir şekilde, 5 dpi'den sonra PDCB1'in net PD lokalizasyon modelinin ortaya çıkması, EGFP sinyalini gösteren önemli ölçüde daha az hücre ile çakıştı (Ek Şekil 1). Bu nedenle, PDLP5 ve MP, 2-5 dpi'lik optimal bir görselleştirme zaman penceresi ile diğer hücresel bölmelerin çoğunda çok az arka plana sahip PD referans proteinleri olarak işlev görebilir. Öte yandan PDCB1, bir PD işaretleyici kadar uygun değildir.

Daha sonra PD belirteçlerinin, diğer PD proteinlerinin varlığında hücre altı lokalizasyon özgüllüklerini korudukları doğrulandı. Bu amaçla, MP-EGFP veya PDLP5-EGFP, CFP ile etiketlenmiş başka bir bitki virüsü olan Tütün mozaik virüsünün (TMV)26 MP'sini PD-lokalize eden bir ile birlikte eksprese edildi. Şekil 3 , her iki durumda da, birlikte eksprese edilen proteinlerin net bir PD lokalizasyon modeli sergilediğini göstermektedir. Benzer şekilde, MP-EGFP- veya PDLP5-EGFP eksprese eden dokuların PD'ye özgü histolojik anilin mavisi boyanması, EGFP ve anilin mavisi sinyallerinin PD lokalizasyonu ile herhangi bir girişim tespit etmedi (Şekil 3).

PD lokalizasyon çalışmaları genellikle referans proteinin genel ekspresyonunun ve PD sinyalinin daha kantitatif bir tahmininden yararlanır. Bu niceleme yaklaşımı Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterilmiştir. Genel ifadenin nicelleştirilmesi için, PDLP5 ve MP'nin sinyal yoğunluğu ölçüldü. Her iki protein de 10 dpi periyodu boyunca tüm görselleştirme zaman noktalarında güçlü sinyaller gösterdi, maksimum sinyal yoğunluğu PDLP5 için 3 dpi ve MP için 2 dpi'de (Şekil 4). Görselleştirme zaman noktalarının hiçbirinde PDLP5 ve MP arasında sinyal yoğunluğunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. PDCB1 sinyal yoğunluğu, zaman noktaları arasında daha fazla dalgalanma sergiledi ve en güçlü sinyal 7 dpi'de gözlemlendi (Şekil 4), ancak ifade eden hücrelerin kıtlığı nedeniyle bu zaman noktasında istatistiksel olarak anlamlı veri toplamak zordu. Bu nedenle, ilk 3 dpi, PDCB1 ifadesini algılamak için en uygun zamanlamayı temsil eder. Beklendiği gibi, anilin mavisi boyama örnekleri, geçici olarak eksprese edilen proteinlerden daha kararlı bir sinyal sergiledi (Şekil 4).

PDLP5 ve MP tarafından oluşturulan PD punkta daha sonra ölçüldü. PDLP5, gözlem süresi boyunca sabit sayıda PD punkta gösterdi ve test edilen zaman noktalarının herhangi ikisi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (Şekil 5). MP tarafından oluşturulan en yüksek PD punkta sayısı 2 dpi'de tespit edildi ve gözlem süresinin sonuna kadar nispeten sabit kaldılar. PDLP5 ve MP arasındaki PD punkta sayıları karşılaştırıldığında, çoğu örnekleme zamanında istatistiksel olarak anlamlı bir fark ortaya çıkmadı (Şekil 5). Anilin mavisi ile boyanmış PD puncta sayısı da 10 dpi'de hafifçe azalmasına rağmen sabit kaldı. Anilin mavisi, PDLP5 veya MP ile süslenmiş PD punkta sayıları, bu belirteçlerin PD özgüllüğü ile tutarlı olarak istatistiksel anlamlılık ile birbirine benzerdi (Şekil 5). PDCB1 için PD puncta sayıları analiz edilmedi, çünkü daha önceki zaman noktalarında PD sinyali ER sinyali tarafından gizlendi ve daha sonraki zaman noktalarında sadece nispeten az sayıda hücrede gözlendi (bkz. Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 1: TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in plazmodesmata (PD) lokalizasyonu, Nicotiana benthamiana'da geçici olarak eksprese edilir ve PD'nin anilin mavisi boyanması. (A) MP-EGFP, PDLP5-EGFP ve PDCB1-EGFP'nin PD lokalizasyonu ve anilin boyama. EGFP sinyali yeşil, anilin mavisi sinyali mavi ve plastid otofloresan kırmızıdır. (B) MP-EGFP, PDLP5-EGFP ve PDCB1-EGFP'nin mRFP ile etiketlenmiş endoplazmik retikulum (ER) markörü ile birlikte ekspresyonu. Görüntüler infiltrasyondan 2 gün sonra (dpi) kaydedildi ve iki bağımsız deneyi temsil eden tek konfokal bölümlerdir (N = 2 bitkiden 20 görüntü). EGFP sinyali yeşil, mRFP sinyali mor ve plastid otofloresan kırmızı renktedir. Sarı oklar, ER'de lokalize PDCB1'i gösterir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak ifade edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in PD lokalizasyonunun ve PD'nin anilin mavisi boyanmasının zaman seyri. Görüntüler 2 dpi'de kaydedildi ve iki bağımsız deneyi temsil eden tek konfokal bölümlerdir (N = 20 tesisten 2 görüntü, PDCB1-EGFP için 7 dpi ve 10 dpi hariç, daha az hücrenin sinyal sergilediği). EGFP sinyali yeşil renktedir ve anilin mavisi sinyali mavi renktedir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: TVCV MP ve PDLP5, PD lokalize edici bir TMV MP ile birlikte ekspresyon ve anilin mavisi ile kostaining'i takiben PD lokalizasyonlarını korurlar. Görüntüler 2 dpi'de kaydedildi ve 4-6 bitkiden N ≥ 10 görüntüyü temsil eden tek konfokal bölümlerdir. EGFP sinyali yeşil renktedir, CFP sinyali ve anilin mavisi sinyali mavi renktedir ve plastid otofloresan kırmızı renktedir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Nicotiana benthamiana ve anilin mavisi PD boyamasında geçici olarak ifade edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in floresan yoğunluğunun zaman seyri. Nicel veriler, Şekil 2'de açıklanan deneylerden toplanmıştır. Hata çubukları, birden fazla deneyden elde edilen ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Bireysel veri noktaları, her ölçüm için ortalama olarak gösterilir. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü varyans analizi ile değerlendirilen ortalama değerler arasındaki farklar P değerleri için istatistiksel olarak anlamlıdır. *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, istatistiksel olarak anlamlı değil. Mavi çubuklar, anilin boyama; açık yeşil çubuklar, MP-EGFP, koyu yeşil çubuklar, PDLP5-EGFP; sarı çubuklar, PDCB1-EGFP. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak ifade edilen TVCV MP ve PDLP5 ile PD punkta oluşumunun zaman seyri ve PD'nin anilin mavisi boyanması. Nicel veriler, Şekil 2'de açıklanan deneylerden toplanmıştır. Hata çubukları, birden fazla deneyden elde edilen ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Bireysel veri noktaları, her ölçüm için ortalama olarak gösterilir. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü varyans analizi ile değerlendirilen ortalama değerler arasındaki farklar P değerleri için istatistiksel olarak anlamlıdır. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Mavi çubuklar, anilin boyama; açık yeşil çubuklar, MP-EGFP, koyu yeşil çubuklar, PDLP5-EGFP. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Deney I
Toplam hücrelerPD lokalizasyonu olan hücrelerKarışık sinyalli hücrelerPD lokalizasyonu olan hücreler (%)
Anilin mavisi40404100
MP-EGFP40404100
PDCB1-EGFP403387.5
PDLP5-EGFP40400100
Deney II
Toplam hücrelerPD lokalizasyonu olan hücrelerKarışık sinyalli hücrelerPD lokalizasyonu olan hücreler (%)
Anilin mavisi40408100
MP-EGFP4039897.5
PDCB1-EGFP40123130
PDLP5-EGFP4039297.5

Tablo 1: PD lokalizasyonunun etkinliği.

Ek Şekil 1: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak eksprese edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in PD lokalizasyonu. Görüntüler 5 dpi (A), 7 dpi (B) ve 10 dpi (C) olarak kaydedildi. EGFP sinyali yeşildir ve plastid otofloresan kırmızıdır. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normal bitki gelişimi ve morfogenezi sırasında ve ayrıca bitki-patojen etkileşimleri sırasında bitki hücreler arası iletişim ve hücreden hücreye taşınımın herhangi bir hücre biyolojik çalışması, hem endojen hem de patojen kodlu proteinlerin bitki hücreler arası bağlantılarına, plazmodesmata (PD) sıralamasının tespit edilmesini ve izlenmesini gerektirir. Bu deneyler, ister endojen ister patojen kaynaklı olsun, PD'ye sadık ve tutarlı bir şekilde lokalize olan, bu yapıları süsleyen ve görselleştiren referans proteinlerin kullanılmasıyla büyük ölçüde kolaylaştırılacaktır. Bu ihtiyaç burada bilinen üç PD lokalize edici protein seçilerek ele alınmaktadır: Arabidopsis PDLP5 ve PDCB1 ve tobamoviral patojen TVCV'den MP. Bu proteinler, otofloresan raportör EGFP ile C-terminallerinde etiketlendi ve elde edilen füzyon proteinlerinin PD'ye sıralama yeteneği, Nicotiana benthamiana'nın yapraklarındaki geçici ekspresyonları ve eksprese eden dokuların konfokal mikroskopi analizlerini takiben belirlendi. Bu dokularda PH'nin genel olarak görüntülenmesi için standart anilin mavisi boyama yöntemi kullanıldı.

Bitki viral MP'lerinin, PH yapısı ve bütünlüğü üzerindeki etkileri açısından iki ana gruba ayrıldığı düşünülmektedir: PD geçirgenliğini geri dönüşümlü olarak ve PD'de herhangi bir yapısal değişiklik olmaksızın artıran MP'ler ve yapılarını değiştirerek PD'yi geçitleyen MP'ler. TVCV gibi tobamovirüslerin MP'leri, birinci grup MP grubuna aittir ve onları hücre altı lokalizasyon çalışmaları için PD'nin çekici belirteçleri olarak konumlandırır27,28.

Bu deneyler, PDLP5-EGFP ve MP-EGFP'yi PD'nin güvenilir ve tekrarlanabilir biyolojik belirteçleri olarak konumlandırdı ve PD tespitinin verimliliği anilin mavisi boyanınkiyle karşılaştırılabilir. PDLP5-EGFP ve MP-EGFP'nin PD lokalizasyonu, karakteristik PD lokalizasyon modelini gözlemlemek için en uygun zaman 2 dpi ile 3 dpi arasında olmak üzere, 10 dpi'lik tüm gözlem süresi boyunca tespit edildi. 35S promotöründen gelen ekspresyon, eksprese edilen genin transkripsiyon sonrası susturulmasına neden olabilse de, bu genellikle stabil şekilde dönüştürülmüş transgenik bitkilerde uzun süreli ekspresyondan sonra ortaya çıkar. Öte yandan, bu güçlü kurucu promotörün kullanılması, marker proteinin kolay tespiti için önemlidir. Referans protein ekspresyonu 7-10 dpi'den sonra azalırsa, daha kısa periyotlar, yani 2-3 dpi kullanılmalıdır. PDLP5 ve MP arasındaki genel hücre altı lokalizasyon modelinde önemli farklılıklar tespit edilmedi, ancak MP'nin PD'ye ek olarak hücre çekirdeğinde birikmesi dışında, PDCB1'in kendi başına bir PD markörü olarak kullanılması önerilmez, bu da ER'ye önemli ölçüde lokalizasyon içerir.

EGFP floresan sinyalinin tespit edilme kolaylığı ayrıca bitkinin büyüme aşamasına da bağlıydı; spesifik olarak, N. benthamiana'da, en düşük EGFP sinyal birikimi, çiçeklenme aşaması18'de kaydedildi.

Bu çalışmada diğer subselüler kompartmanlara maksimize özel PD lokalizasyon belirteçlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle, ek hücre altı lokalizasyon yetenekleri ile ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonu için referans olarak kullanımları, ER, mitokondri, plazma zarı vb. gibi diğer hücre altı belirteçlerin ekspresyonu ile birleştirilmelidir. Bu durumda, agroinfiltrasyon kültürlerinin nihai konsantrasyonu, yani sıvı kültürlerin OD600'ü hesaplanırken, bu belirteçlerin ekspresyonu için ek Agrobacterium hücrelerinin dahil edilmesi dikkate alınmalıdır. Açıkçası, hücre konsantrasyonu ve bitki büyüme süreleri, diğer bitki türlerinde maksimum ekspresyon ve PD lokalizasyon paterni tespiti için uyarlanmalıdır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VC laboratuvarındaki çalışma, NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 ve IOS 1758046) ve BARD (IS-5276-20) tarafından VC'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayınlama kararında hiçbir rolü yoktu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 fazlı motorBRANDTECH  ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Kontaminasyon kontrolü CCI
Ağ Geçidi BP Klonaz II Enzim karışımıİnvitrojen# 11789020
Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim karışımıInvitrojen# 11791020
GraphPad Prizma 8.0.1.GraphPad Yazılım A.Ş.
Resim JUlusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon
Lazer taramalı konfokal mikroskopZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaBitki türleri
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 Yüksek Kaliteli DNA PolimerazNEB#M0491S
Laboratuvarı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal MicroscopyProtein LocalizationPlasmodesmata AnalysisNicotiana BenthamianaCell To Cell MovementAniline Blue StainingAgrobacterium InfiltrationPlasmodesmata TargetingEndoplasmic Reticulum LocalizationViral Movement Protein

Related Articles