Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Özet

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Özet

(Makro) otofaji, temel bir hücresel bozunma yolunu temsil eder. Bu süreçte, otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller sitoplazmik içerikleri yutar ve daha sonra bozunma için lizozomlarla birleşir. Kanonik rolün ötesinde, otofaji ile ilgili genler ayrıca enflamatuar moleküllerin, doku onarım faktörlerinin ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) salınmasını içeren bir salgı yolunu da modüle eder. Özellikle, özellikle beyin ve omuriliği etkileyen nörodejeneratif hastalıklarda, hücreler arasında patolojik proteinlerin yayılması süreci, bu fenomeni anlamanın önemini vurgulamaktadır. Son araştırmalar, amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal lober dejenerasyonda önemli bir oyuncu olan transaktif yanıt DNA bağlayıcı protein 43 kDa'nın (TDP-43), otofagozom işaretleyici mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B hafif zincir 3B-II (LC3-II) ile zenginleştirilmiş EV'ler aracılığıyla, özellikle otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde, otofajiye bağlı bir şekilde salındığını göstermektedir.

LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımının altında yatan mekanizmayı aydınlatmak için, hem hücre içi hem de hücre dışı LC3-II-pozitif vezikülleri değerlendirmek için erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak zorunludur. Bu çalışma, diferansiyel santrifüjleme yoluyla elde edilen hücresel ve EV fraksiyonlarında immünoblotlama yoluyla LC3-II seviyelerinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Otofagozom-lizozom füzyonunun bir inhibitörü olan Bafilomisin A1 (Baf), hücre içi ve hücre dışı LC3-II pozitif veziküllerin seviyelerini arttırmak için pozitif bir kontrol görevi görür. Tümör duyarlılık geni 101 (TSG101), multiveziküler cisimler için bir belirteç olarak kullanılır. Bu protokol uygulandığında, sporadik Creutzfeldt-Jakob hastalığı için genetik bir risk faktörü olan siRNA aracılı syntaxin-6'nın (STX6) yıkılmasının, TSG101 seviyeleri üzerinde önemli bir etki göstermezken, Baf ile tedavi edilen hücrelerin EV fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini arttırdığı gösterilmiştir. Bu bulgular, STX6'nın, özellikle otofagozom-lizozom füzyonunun bozulduğu koşullar altında, EV'ler yoluyla LC3-II'nin hücre dışı salınımını negatif olarak düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Otofajiyi değerlendirmek için yerleşik yöntemlerle birleştirildiğinde, bu protokol, LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımında spesifik moleküllerin rolü hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Transaktivasyon yanıtı DNA bağlayıcı protein 43 (TDP-43), tümü hücre sağkalımı^için hayati önem taşıyan, ekzon ekleme, gen transkripsiyonu ve mRNA stabilitesinin düzenlenmesinde rol oynayan, yaygın olarak eksprese edilen heterojen bir nükleer ribonükleoproteindir ^1,2. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve frontotemporal lober dejenerasyon (FTLD) gibi nörodejeneratif durumlarda, sitoplazmada anormal bir şekilde bir nükleer protein TDP-43 birikir. Bu kayma, çekirdekte TDP-43 fonksiyon kaybı ve sitoplazmada toksik bir fonksiyon kazancı ile sonuçlanır. TDP-43'ün patolojik birikimi, beynin ve omuriliğin belirli bölgelerinde başlar ve bu bölgelere prion benzeri bir şekilde yayılır, bu süreç hastalığın ilerlemesi ile yakından ilişkilidir³. Bununla birlikte, TDP-43 patolojisinin beyin ve omurilik yoluyla yayıldığı kesin mekanizma bilinmemektedir.

TDP-43, hücre dışı veziküller (EV'ler) yoluyla salgılanır ve ALS ve FTLD-TDP hastalarının plazma ve beyin omurilik sıvısında (BOS) yüksek TDP-43 seviyeleri tespit edilir ^4,5,6. ALS ve FTLD teşhisi konan hastalardan elde edilen BOS, insan glioma hücrelerinde hücre içi yanlış lokalizasyona ve endojen TDP-43'ün agregasyonuna^{neden olur 7}. Bu nedenle, EV'ler yoluyla hücre dışı olarak salınan TDP-43, TDP-43 patolojisinin hücreden hücreye yayılmasına aracılık edebilir.

Otofaji, istenmeyen maddelerin LC3 ile işaretlenen otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller içinde muhafazasını içeren iyi korunmuş bir hücresel bozunma mekanizmasıdır. Bu otofagozomlar, lizozomal ilişkili zar proteini 1 (LAMP1) pozitif lizozomlarla birleşerek otolizozomlar (LC3 ^{+ /} LAMP1 ⁺) oluşturur ve içeriklerinin^bozulmasına yol açar 8. Histolojik analizler, inklüzyonları yutan otofagozomların sporadik ALS hastalarının^{nöronlarında} biriktiğini göstermektedir 9. Ailesel ALS ve FTLD-TDP'nin bazı nedensel genleri, otofajinin düzenlenmesi ile bağlantılıdır 10,11,12. Bu bulgular ALS ve FTLD-TDP hastalarında otofajinin baskılandığını göstermektedir.

Önceki çalışma, TDP-43'ün, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde otofagozom belirteci LC3-II için pozitif EV'ler yoluyla salgılandığını göstermiştir¹³. Otofaji-lizozom yolunun düzensizliği sadece TDP-43'ün hücre içi birikimine değil, aynı zamanda TDP-43'ün EV'ler¹⁴ yoluyla hücre dışı salınmasına da neden olabilir. Bununla birlikte, LC3-II pozitif EV'lerin nasıl salındığı ve bunun TDP-43 patolojisinin yayılmasında ne kadar önemli olduğu bilinmemektedir.

EV'ler, hücre yüzeyi tomurcuklanmasından üretilen büyük EV'ler (100 ila 1000 nm çapında) ve endozomal zarların endozomun iç kısmına doğru tomurcuklanmasından üretilen küçük EV'ler (50 ila 150 nm çapında) (eksozomlar olarak bilinir) ve Golgi aygıtı. Büyük ve küçük EV'leri ayrı ayrı toplamak için sıralı santrifüjleme gerçekleştiriyor ve peletleri sırasıyla 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjleme ile topluyoruz. P1 EV fraksiyonu (20.000 × g peletler) büyük EV'leri toplamak için hazırlanır ve P2 EV fraksiyonu (110.000 × g peletler) küçük EV'leri toplamak için hazırlanır¹⁵. İmmünoblotlama ile ardışık santrifüjlemeden türetilen büyük ve küçük EV'lerde LC3-II seviyelerini değerlendirme metodolojisi stabil ve tekrarlanabilirdir¹⁶. EV'lerde LC3-II seviyelerini analiz etmenin yanı sıra, otolizozom ve omegazom oluşumunu analiz etmek, otofajinin düzensizliğinin LC3-II pozitif EV'lerin salınmasına nasıl yol açtığının anlaşılmasını geliştirir. Burada, bu çalışma, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II pozitif EV'lerin salınmasında, taşıma veziküllerinin hedef membran^17'ye hareketini destekleyen bir SNARE proteini olan syntaxin 6'nın (STX6) baskılayıcı rolünü göstermektedir.

Protokol

1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından hücre, P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması

1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması
   1. 1. Gün
      1. Hücreleri bir hücre sayacı kullanarak sayın ve DMEM Yüksek Glikoz,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin'den oluşan bir kültür ortamı içeren 6 cm'lik bir plaka üzerine 1 × 10^{6 hücre} tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   2. 2. Gün (isteğe bağlı)
      1. 20 μM siRNA çözeltisi hazırlayın.
      2. Çözelti A'yı hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamını ve 3 μL siRNA'yı düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      3. Çözelti B'yi hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamı ve 5 μL transfeksiyon reaktifini düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      4. Çözelti A ve çözelti B'yi karıştırın, ardından karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
      5. HeLa hücrelerini kültürlemek için kullanılan ortama A ve B çözeltilerinin karışımını ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   3. 3. Gün
      1. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 5 dakika boyunca kontrollü nem ile 500 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 2,5 mL kültür ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL'lik bir pipet ucu takılı bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve 10 cm'lik bir plakaya 1 ×^{10 6} hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
         NOT: İmmünoblotlama analizi için gerekli kültür ortamından EV'leri toplamak için en az 1 × 10⁶ hücre hazırlamak gerekir.
   4. 4. Gün
      1. Araç (DMSO) veya 100 nM Bafilomisin A1 (Baf) içeren kültür ortamını (bkz. adım 1.1.1.1) hazırlayın.
      2. Hücreleri araç veya 100 nM Baf içeren ortama maruz bırakın ve bunları 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   5. 5. Gün
      1. Tüm kültür ortamını 10 cm'lik plakadan toplayın, 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
         NOT: 10 cm'lik plakada kalan hücreler bölüm 1.2.1'de kullanılacaktır.
      2. P1 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 3.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 20.000 × g'da santrifüjleyin.
      3. P2 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 20.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 110.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendili ile sildikten sonra, santrifüjleme tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda [% 2.5 SDS, 125mM Tris-HCl tamponu (pH 6.8)% 30 gliserol,% 10 2-merkaptoetanol,% 0.4 Bromofenol Mavisi] P1 EV fraksiyonunu hazırlamak için.
      5. Süpernatanı boşaltarak çıkarın, tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendiliyle silin ve ardından P2 EV fraksiyonunu hazırlamak için ultrasantrifüj tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda yeniden süspanse edin.
      6. P1 ve P2 EV fraksiyonlarını 100 °C'de bir ısı bloğu üzerinde 10 dakika inkübe edin.
         NOT: Santrifüjlemeden sonra 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjlemeden sonra kalan peletlerin yanlışlıkla atılmasını önlemek için tüpleri sallamayın. Süpernatanı aktarmak için tüpü eğdikten sonra, peletin kalan süpernatanın tekrar daldırılmasını önlemek için tüpün konumunu koruyun.
2. Kültürlenmiş HeLa hücrelerinden hücre fraksiyonunun hazırlanması
   1. 5. Gün
      1. Kültür ortamının 10 cm'lik plakadan 15 mL'lik bir tüpe aktarılmasından sonra, 10 cm'lik tabaktaki hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ve kontrollü nem ile 2 mL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 8 mL büyüme ortamı ekleyin, ardından hücreleri pipetlemek ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL pipet uçlu bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın, hücre peletine PBS ekleyin ve ardından 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      5. Bir aspiratör kullanarak PBS'yi çıkarın ve hücre peletini 1 mL A68 tamponunda [10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM etilen glikol bis (β-aminoetil eter) -N, N, N, N-tetraasetik asit (EGTA)] % 1 sarkosil içerir.
      6. Bir BCA protein tahlil kiti kullanarak hücre lizatının protein konsantrasyonunu ölçün.
      7. 300 μL hücre lizatını 100 μL 4x numune tamponu ile karıştırın ve hücre fraksiyonunu hazırlamak için karışımı 100 °C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.

2. İmmünoblotlama analizi

1. Numunelerdeki eşdeğer miktarda proteini SDS-PAGE¹⁸ ile ayırın.
2. Ayrılan proteinleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
3. Transferden sonra, membranları 20 dakika boyunca bloke edici ajan ile bloke edin.
4. RT'de %10 (h/h) buzağı serumu içeren Tris tamponunda belirtilen primer antikor ile tıkalı membranı gece boyunca inkübe edin.
5. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'de 2 saat boyunca biyotin konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.
6. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'deki kitten %0.4 (h/h) çözelti A ve çözelti B'yi içeren Tris tamponu ile 1 saat inkübe edin.
7. Membranı PBS ile yıkayın ve ardından bantların kolorimetrik tespiti için% 0.04 (a / h) diaminobenzidin,% 0.8 (a / h) NiCl₂ · 6H₂O ve% 0.3 (h / h) H₂O₂ içeren PBS ile inkübe edin.
   NOT: Sinyallerin tespiti için bir kemilüminesans yöntemi de kabul edilebilir.
8. Zarın görüntüsünü bir tarayıcı ile sayısallaştırın ve Fiji kullanarak dansitometri analizine tabi tutun.
   1. Fiji kullanarak sayısallaştırılmış görüntüyü açın ve RGB renkli görüntüyü Görüntü | Türü | 8 bit.
   2. Dikdörtgen aracına tıklayın ve şeritleri çevrelemek için sürükleyerek dikdörtgenin boyutunu ayarlayın. Analiz Et | Jeller | İlk şerit'i seçin.
   3. Dikdörtgeni ikinci ve sonraki bantların üzerine yerleştirin ve Analiz Et | Jeller | Sonraki Şerit'i seçin.
   4. Son bandı tanıdıktan sonra, Analiz Et | Jeller | Şeritleri çizin.
   5. Bandın sinyal alanını düz bir çizgi ile çevreleyin, değnek aracına tıklayın ve bandın sinyal yoğunluğunu hesaplamak için alana tıklayın.

3. Otofagozom ve otolizozom sayısının analizi

1. 1. Gün
   1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta LAMP1-GFP ve mCherry-LC3 eksprese eden 1 ×^{10 5} HeLa hücresi tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
2. 2. Gün (isteğe bağlı)
   1. 3,5 cm'lik tabaklarda bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
3. 3. Gün
   1. Kültür ortamını 3,5 cm'lik tabaklardan atın.
   2. Hücreleri PBS ile yıkayın, 400 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın ve% 5 CO₂ ve kontrollü nem ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   3. Hücrelere 1.6 mL büyüme ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bunları bir Pasteur transfer pipeti ile pipetleyin.
   4. Hücre sayacını kullanarak hücre sayısını sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 10⁴ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
      NOT: Odacıklı lamel iki kuyusu, bölüm 3.4.2'de açıklandığı gibi DMSO veya Baf muamelesini takiben sırasıyla kontrol ve STX6 knockdown hücreleri için hazırlanır.
4. 4. Gün
   1. Fenol kırmızısı içermeyen büyüme ortamını hazırlayın (Fenol Kırmızısı içermeyen DMEM,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin), her iki araç (DMSO) veya DMSO'da çözünmüş 100 nM Baf içerir.
   2. Kültür ortamını, araç veya 100 nM Baf içeren fenol kırmızısı içermeyen ortamla değiştirin ve 4 saat inkübe edin.
      NOT: Baf'ın otofagozom ve otolizozom sayıları üzerindeki etkisini değerlendirmek için, araçla tedavi edilen hücreleri kontrol olarak hazırlayın.
   3. Gözlemden önce çekirdekleri 30 dakika boyunca 0.33 μg / mL Hoechst 33342 ile boyayın.
   4. Konfokal lazer mikroskobunda 60x objektif lens kullanarak Canlı hücre görüntüleme yapın ve on farklı kare yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüyü Fiji'de açın ve Görüntü | Renk | Kanalları Böl.
      2. Her görüntüdeki kırmızı ve yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlayın tıklayarak Görüntü | Ayarla | Her deney için eşik .
      3. Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. Otofagozom ve lizozomla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayım'daki değerleri kaydedin.
      4. Yeşil görüntüyü kırmızı görüntünün üzerine bindirmek için, Düzenle | Yapıştırma Kontrolü. Yeşil görüntüyü kopyalayın ve ardından hem kırmızı hem de yeşil sinyaller için pozitif olan alanları vurgulayarak birleştirmek için kırmızı görüntünün üzerine yapıştırın.
      5. Otolizozom sayılarını tanımlamak için, Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin, Tamam'a tıklayın ve otofagozomlar ve lizozomlarla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayı bölümündeki değerleri kaydedin.
   5. Hücre başına otolizozom ve otofagozom sayısını hesaplamak için toplam otolizozom ve otofagozom sayısını toplam hücre sayısına bölün.
      NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 35 hücre sayın.

4. Omegazom oluşumu için analiz

1. 1. Gün
   1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabağa 1 ×^{10 5} hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
2. 2. Gün (isteğe bağlı)
   1. Bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
3. 3. Gün
   1. Adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
   2. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta 1 × 10⁵ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
4. 4. Gün
   1. Düşük retansiyonlu bir tüpte 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL DNA transfeksiyon reaktifi ve 100 μL indirgenmiş serum ortamını karıştırın. Karışımı 20 dakika inkübe edin, ardından kültürlenmiş ortama ekleyin.
   2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
5. 5. Gün
   1. Hücreleri adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tripsinize edin.
   2. Hücrelere 2.5 mL büyüme ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için karışımı bir Pasteur transfer pipeti kullanarak pipetleyin.
   3. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 10⁴ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
6. 6. Gün
   1. Konfokal lazer mikroskobu kullanarak adım 4.5.3'ten itibaren hücrelerin canlı hücre görüntülemesini yapmak için 3.4.1-3.4.4 adımlarını izleyin. On farklı görüntü karesi yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüleri ilgili kırmızı, yeşil ve mavi görüntü bileşenlerine bölmek, her görüntüdeki yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlamak ve GFP sinyal yoğunluğunu belirlemek için 3.4.4.1-3.4.4.3 adımlarını izleyin. GFP-ATG13'ün sinyal yoğunluğunu belirlemek için Toplam Alan bölümündeki değerleri kaydedin.
      2. Hücre başına sinyal yoğunluğunu hesaplamak için toplam sinyal yoğunluğunu incelenen hücre sayısına bölün.
         NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 34 hücre sayın.

Sonuçlar

Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, Baf tedavisi TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) ve LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) EV açısından zengin fraksiyonda. Özellikle, Baf tedavisi ayrıca EV fraksiyonundaki STX6 seviyelerini de arttırdı (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) (Şekil 1A), STX6'nın EV'lerin bir bileşeni olabileceğini düşündürmektedir. EV fraksiyonunda proliferatif hücre nükleer antijeni (PCNA) gözlenmedi. STX6'nın hücre fraksiyonundaki immünoblotlanması, siRNA yıkımı ile STX6 seviyelerinin yarı yarıya azaldığını ortaya koydu (Şekil 1B). STX6 knockdown, hem araç hem de Baf ile muamele edilen koşullar altında hücre ve EV fraksiyonlarındaki TSG101 seviyelerini etkilemedi (Şekil 1C). Bununla birlikte, STX6 knockdown, araç ile tedavi edilen koşul altında hücre fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini arttırdı, ancak Baf ile tedavi edilen koşul altında değil. STX6 knockdown, Baf ile muamele edilen koşul altında EV fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini de arttırdı (Şekil 1D). Bu bulgular, EV'lerde LC3-II'yi immünoblotlama yoluyla tespit etmek için kullanılan yöntemlerin, knockdown verimliliği önemli olmasa bile, yeterince hassas olduğunu göstermektedir. Ek olarak, bu sonuçlar, STX6 yıkımının hücre içi otofagozom sayılarını arttırdığını ve Baf tedavisi altında otofagozomla ilişkili veziküllerin hücre dışı salınımını arttırdığını göstermektedir.

STX6 yıkımının hücre içi otofagozom ve otolizozom sayılarını etkileyip etkilemediğini daha fazla araştırmak için, otofagozom markörü mCherry-LC3 ve lizozom markörü LAMP1-GFP kullanılarak otofagozomlar ve lizozomlar görselleştirildi. Konfokal canlı hücre görüntüleme, LAMP1-GFP ve mCherry-LC3'ü eksprese eden HeLa hücrelerinde GFP ve mCherry pozitif vezikülleri ortaya çıkardı (Şekil 2A). Otolizozomlar GFP- ve mCherry pozitif veziküller olarak tanımlanırken, otofagozomlar GFP-negatif ve mCherry pozitif veziküller olarak tanımlandı. STX6 knockdown, araçla tedavi edilen koşul altında otofagozomların ve otolizozomların sayısını artırdı (Şekil 2B, C). Bununla birlikte, STX6 yıkımı, Baf ile tedavi edilen koşul altında otofagozom ve otolizozom sayılarını etkilememiştir (Şekil 2B, C).

STX6 yıkımına bağlı hücre içi otofagozom sayılarındaki artışın, artmış otofagozom oluşumundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için, otofagozom oluşumu için gerekli bir süreç olan omegazom oluşumu, omegazom markörü GFP-ATG13 sinyal yoğunluğu kullanılarak incelendi. Konfokal canlı hücre görüntüleme, omegazom oluşumunu gösteren GFP-ATG13'ün birleştirilmiş bir görüntüsünü sağladı (Şekil 3A). STX6 knockdown, GFP-ATG13 sinyal yoğunluğunu azalttı (P = 0.023, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi). STX6 knockdown, araç tarafından tedavi edilen koşullar altında GFP-ATG13 sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemese de, Baf ile tedavi edilen koşullar altında sinyali önemli ölçüde azalttı (Şekil 3B). Toplu olarak, bu bulgular STX6 yıkımının, otofagozomla ilişkili veziküllerin birikimine bağlı LC3-II pozitif veziküllerin salınımını arttırdığını göstermektedir.

Şekil 1: Araç veya Baf tedavisi altında kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilen HeLa hücrelerinden hücre, P1 ve P2 fraksiyonlarının immünoblotlama sonuçları. HeLa hücreleri, kontrol veya STX6 siRNA ile transfeksiyondan sonra 24 saat boyunca araç (DMSO) veya 100 nM Baf ile muamele edildi. Hücre, P1 (20.000 × g pelet) ve P2 (110.000 × g pelet) fraksiyonları izole edildi. (A) STX6, TSG101, LC3 ve PCNA'yı gösteren her fraksiyonun temsili immünoblotlama görüntüleri. (B-D) İmmünoblot görüntülerinden (B) STX6, (C) TSG101 ve (D) LC3-II için dansitometrik analiz yapıldı. Sinyal yoğunlukları, araç veya Baf ile muamele edilen kontrol veya STX6 siRNA transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Çubuk grafikler S.E.M. (N = 3) ± ortalama değerleri temsil eder. * Excel'de iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi ile P < 0.05'i gösterir. Kısaltmalar: STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; DMSO = dimetil sülfoksit; TSG101 = tümör duyarlılık geni 101; LC3 = mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B, hafif zincir 3B; PCNA = çoğalan hücre nükleer antijeni; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Araç ve Baf ile muamele edilen koşul altında kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilmiş Lamp1-GFP ve mCherry-LC3'ü birlikte eksprese eden HeLa hücrelerinin konfokal görüntü analizi. (A) LAMP1-GFP ve mCherry-LC3'ü stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücrelerinin konfokal görüntüleri, 48 saat boyunca kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edildi, ardından 4 saat boyunca DMSO veya 400 nM Baf'a maruz bırakıldı. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B,C) (B) otofagozomların (LAMP1-GFP negatif ve mCherry-LC3 pozitif noktalar) ve (C) otolizozomların (LAMP1-GFP ve mCherry-LC3 çift pozitif noktalar) kunatifikasyonu Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Çubuk grafiklerdeki veriler S.E.M. (N = 3) ± ortalama değerler olarak sunulur. *, Excel'de iki kuyruklu eşleştirilmemiş t-testine dayalı olarak P < 0,05'i gösterir. Kısaltmalar: Lamba1 = lizozomal ilişkili zar proteini 1; LC3 = mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B, hafif zincir 3B; STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; GFP = yeşil floresan proteini; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GFP-ATG13 eksprese eden, kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilen ve araç veya Baf tedavisine tabi tutulan HeLa hücrelerinin konfokal görüntülemesi. (A) HeLa hücreleri kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edildi, ardından pEGFP-C1-hAtg13 transfeksiyonu yapıldı ve 4 saat boyunca DMSO veya 400 nM Baf ile muamele edildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Bağıl sinyal yoğunlukları, her koşuldaki sinyalin Baf ile muamele edilen kontrol siRNA transfekte edilmiş hücrelerinkine normalleştirilmesiyle belirlendi. Çubuk grafik, verileri ± S.E.M. (N = 3) olarak gösterir. * Excel'deki iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi ile P < 0.05'i gösterir. Kısaltmalar: hAtg13 = insan otofajisi ile ilgili gen 13; STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; DMSO = dimetil sülfoksit; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Kontrol siRNA'sı ile transfekte edilen ve Baf ile tedavi edilen HeLa hücrelerinden hücre, P1 ve P2 fraksiyonlarının immünoblot analizi. HeLa hücreleri kontrol siRNA ile transfekte edildi ve 24 saat boyunca 100 nM Baf'a maruz bırakıldı. Daha sonra fraksiyonlar hazırlandı: hücre, P1 (20.000 × g pelet) ve P2 (110.000 × g pelet). ULK1 ve PCNA'nın temsili immünoblot görüntüleri, karşılaştırma için her bir fraksiyondaki seviyelerini gösterir. Kısaltmalar: Baf = bafilomisin A1; ULK1 = unc-51, otofaji aktive edici kinaz 1 gibi; PCNA = çoğalan hücre nükleer antijeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İmmünoblotlama çalışmasında hücresel fraksiyonda LC3-II ve TSG101 seviyeleri, mikrovezikülden zengin P1 EV fraksiyonu ve eksozomdan zengin P2 EV fraksiyonu ortaya çıktı. Otofagozomları, otolizozomları ve omegazomları incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanıldı ve STX6 yıkımının otofajiyi etkileyip etkilemediğine dair fikir verdi. Bu birleşik sonuçlar, STX6 yıkımının, potansiyel olarak otofaji yolunun düzensizliği ile bağlantılı olan LC3-II pozitif EV'lerin salınımını etkilediğini göstermektedir. Bu yöntemin önemli bir avantajı, farklı kaynaklardan kaynaklanan büyük ve küçük EV'leri ayırt etme yeteneğidir. Mikro-parçacıklar, eksozomlar veya Golgi aygıtı için spesifik belirteçler kullanan akış sitometrisi analizi, STX6 yıkımının LC3-II pozitif veziküllerin salınımını nasıl etkilediğini daha da netleştirebilir.

Bununla birlikte, immünoblotlama çalışmasının bir sınırlaması, Baf tedavisi altında STX6 yıkımını takiben EV fraksiyonunda LC3-II seviyelerinde gözlenen artışın, salınan LC3-II pozitif vezikül sayısının artmasından mı yoksa EV başına LC3-II seviyelerinde bir artıştan mı kaynaklandığının belirsizliğini korumasıdır. Bu olasılıkları ayırt etmek için, nanopartikül izleme analizi veya akış sitometrisi analizi kullanarak vezikülleri saymak, LC3-II pozitif veziküllerin sayısının artıp artmadığını veya vezikül başına LC3-II seviyelerinin yükselip yükselmediğini belirlemeye yardımcı olabilir.

Protokoldeki kritik bir adım, EV fraksiyonunu hazırlamak için kültürlenmiş ortamın fraksiyonlanmasıdır. EV'ler, santrifüj tüpünde küçük topaklar olarak gözlenir. Karşılaştırılabilir bir EV fraksiyonu hazırlamak için, EV peletlerinin protein konsantrasyonunun seyreltilmesini önlemek için santrifüjlemeden sonra süpernatantın dikkatli bir şekilde aktarılması veya atılması önemlidir. Hücre fraksiyonundan EV fraksiyonuna kontaminasyonu incelemek için, bir sitoplazmik protein, unc-51 benzeri otofaji aktive edici kinaz 1 (ULK1) ve bir nükleer protein, PCNA seviyeleri bu çalışmadaki fraksiyonlar arasında karşılaştırıldı (Ek Şekil S1). Hücre fraksiyonundaki protein konsantrasyonu genellikle hücre sayılarını yansıtır, ancak hücresel protein konsantrasyonu, hücre döngüsü aşamaları²⁰ veya proteostaz^21'deki bozukluklardan etkilenir. Otofaji, proteostazın sürdürülmesi için çok önemlidir²². STX6 knockdown veya Baf tedavisi ile otofajinin düzensizliği, hücre sayısından bağımsız olarak protein konsantrasyonunu değiştirebilir.

STX6 yıkımı, siRNA transfeksiyonu yoluyla elde edilir ve GFP-ATG13'ün aşırı ekspresyonu, DNA transfeksiyonu yoluyla gerçekleştirilir. Transfeksiyon verimliliği hücre tipi, yoğunluğu ve sayılarından etkilenir. siRNA dizilerinin verimli bir şekilde hizalanması, nakavt verimliliğini de etkileyebilir. Transfeksiyon verimliliği düşük olduğunda ayarlamalar gereklidir.

Mevcut sonuçlar, STX6 yıkımının, Baf ile tedavi edilen koşullar altında EV fraksiyonundaki otofagozom belirteci LC3-II'nin seviyelerini arttırdığını, ancak TSG101 seviyelerini etkilemediğini göstermektedir. Bu, STX6'nın otofagozomlardan türetilen veziküllerin salınımını baskıladığını, ancak otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde MVB'lerden olmadığını göstermektedir.

STX6 yıkımı, büyüme koşulları altında hücresel LC3-II seviyelerini de artırdı, bu da STX6'nın otofajiyi düzenlediğini düşündürdü. Gerçekten de, STX6 yıkımı, omegazom oluşumunu arttırmazken, otofagozomların ve otolizozomların sayısını arttırdı. Otolizozomların olgunlaşması otofajik lizozom reformuna neden olur²³. STX6'nın otolizozomların olgunlaşma sürecine aracılık etmesi mümkündür ve fonksiyon kaybı, olgunlaşmamış otolizozomların sayısını artırabilir, bu da otofajik lizozom reformasyonunun baskılanmasına bağlı olarak otofagozom-lizozom füzyonunun düzensizliğine yol açabilir.

Baf tedavisi, ekspresyonu aşağı regüle edildiğinde bile EV fraksiyonundaki STX6 seviyelerini arttırdı. Önceki çalışmalar, lizozomal fonksiyon inhibe edildiğinde otofagozomla ilişkili veziküllerin EV olarak salındığını göstermiştir^13,14. STX6'nın, Grup A Streptokok (GAS) içeren otofagozom benzeri vakuoller²⁴ gibi otofagozomla ilişkili veziküllere lokalize olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, STX6, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde EV'ler olarak salınan otofagozomla ilişkili veziküllere lokalize olabilir.

TDP-43 patolojisinin yayılması, ALS ve FTLD-TDP^3'ün ilerlemesi ile yakından bağlantılıdır. TDP-43 patolojisinin beyin ve omurilik yoluyla nasıl yayıldığı belirsizliğini korusa da, EV yolu yayılmasına aracılık edebilir. Önceki çalışmalar, otofaji-lizozom yolunun düzensizliğinin, TDP-43¹³ içeren LC3-II pozitif EV'lerin salınmasına yol açtığını göstermiştir. Bu çalışma, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde EV salınımını düzenlemede STX6'nın bir rolü olduğunu göstermektedir. Hücre ve EV fraksiyonlarındaki LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile değerlendirme metodolojisi gelecekteki çalışmalarda yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0,25 Tripsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Çanak	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tüp	Thermo Fisher Scientific	339650
200 & mu; L Pipet Ucu	Nippon Genetics	FG-301	pipetleme
2-Merkaptoetanol	Nacalai Tesque	21417-52	için bir malzeme numune tampon çözeltisi
3,3'-Diaminobenzidin Tetrahidroklorür	Nacalai Tesque	11009-41	DAB çözeltisi için bir malzeme
3,5 cm Tabak	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Tabak	TrueLine	TR4001
Alüminyum Blok Termostatik Banyolar (kuru termobanyolar)	EYELA	273860
Aspiratör	SANSYO	SAP-102	inhalasyon solüsyonu
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomisin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin konjuge Keçi Anti-tavşan IgG Antikor	Vektörü Laboratuvarlar	BA-1000	İmmünoblotlama için 2. antikor
Biotin konjuge At Antimouse IgG Antikoru Vektör	Laboratuvarları	BA-2000	İmmünoblotlama için 2. antikor
Bir	Nacalai Tesque	03953-95	immünoblotlama için bir malzeme
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	numune tampon çözeltisi için bir malzeme
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Tarayıcı
Santrifüj 5702 R	eppendolf	5703000039
Sayma Slaytları Çift Odacıklı	Bio-Rad	1450015J	hücre sayımı
Dijital Sonifier 450	BRANSON
Dimetil Sülfoksit	Nacalai Tasque	09659-14	araç
DMEM Yüksek Glikoz	Nacalai Tesque	08458-45	kültür ortamı
Fenol Kırmızısı olmadan DMEM	Nacalai Tesque	08489-45	kültür ortamı
EGTA	Dojindo	348-01311	A68 çözümü için bir malzeme
Excel	Microsoft	sürüm 16.16.27	satistik analiz
EZR	Referans No. 24	sürüm 1.68	satistik analiz
FBS	Sigma	173012	Kültür ortamı
Fiji	NIH		Görüntü analiz aracı
Gliserol	Nacalai Tesque	09886-05	için bir malzeme örnek tampon çözeltisi
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hidrojen Peroksit	Fujifilm Wako	080-0186	DAB çözeltisi için bir malzeme
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	temizleme mendili
Düşük Tutma Tüpü	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA ve DNA transfeksiyonu
LSM780 Konfokal Lazer Mikroskobu	Carl Zeiss
Monoklonal Fare Anti-LC3 Antikor	MBL	M186-3	İmmünoblotlama için 1. antikor
Nikel(II) Klorür Hekzahidrat	Fujifilm Wako	149-01041	DAB çözeltisi için bir malzeme
N-Lauroylsarcosine Sodyum Tuzu	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	31985-070	siRNA ve DNA transfeksiyonu
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penisilin / Streptomisin	Nacalai Tesque	26253-84	Kültür ortamı
Pierce BCA Protein Test Kitleri	Thermo Fisher Scientific	23225
Poliklonal Tavşan Anti-PCNA Antikoru	BioAcademia	70-080	1. antikor immünoblotlama
Poliklonal Tavşan Anti-syntaxin 6 Antikor	ProteinTech	10841-1-AP	İmmünoblotlama için 1. antikor
Poliklonal Tavşan Anti-TSG101 Antikoru	ProteinTech	28283-1-AP	İmmünoblotlama için 1. antikor
Poliklonal Tavşan Anti-ULK1 Antikoru	ProteinTech	20986-1-AP	İmmünoblotlama için 1. antikor
Poliviniliden Diflorür Membran	Milliore	IPVH00010	immünoblotlama için bir malzemedir
R	R geliştirme çekirdek ekibi	sürüm 4.4.1	satistik analiz
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfeksiyon reaktifi
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	transfeksiyon için siRNA
Sodyum Klorür	Nacalai Tesque	31320-05	Tris tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme
Sodyum Dodesil Sülfat	Fujifilm Wako	192-13981	> için bir malzeme
SPARK Mikroplaka Okuyucu	TECAN
Stealth RNAi Negatif Kontrol Dubleksleri, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfeksiyonu
Sükroz	Fujifilm Wako	193-00025	A68 çözümü için bir malzeme
TC20 Termal Yazıcılı Otomatik Hücre Sayacı	Bio-Rad	1450109J1	hücre sayımı
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	inkübasyon
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfeksiyon reaktifi
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfeksiyon reaktifi
Tris (hidroksimetil) aminometan	Nacalai Tesque	35406-75	Tris tamponu, numune tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme
Tripan Mavi Boya% 0.40	Bio-Rad	1450021	hücre sayımı
Ultra Şeffaf Üstü Açık Tüp, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	P1 EV fraksiyonu için toplama
yapıyor Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	P2 EV fraksiyonu için toplama
Vectastain ABC Standart Kiti	Vector Laboratories	PK-4000	immünoblotlama
Yıkama Şişesi	Bir Olarak	1-4640-02	yıkama membranı
μ-Slide 8 Kuyulu Yüksek	ibidi	80806