Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67385

⸱

18 Ekim 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

Bu makalede

Özet

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Özet

(Makro) otofaji, temel bir hücresel bozunma yolunu temsil eder. Bu süreçte, otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller sitoplazmik içerikleri yutar ve daha sonra bozunma için lizozomlarla birleşir. Kanonik rolün ötesinde, otofaji ile ilgili genler ayrıca enflamatuar moleküllerin, doku onarım faktörlerinin ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) salınmasını içeren bir salgı yolunu da modüle eder. Özellikle, özellikle beyin ve omuriliği etkileyen nörodejeneratif hastalıklarda, hücreler arasında patolojik proteinlerin yayılması süreci, bu fenomeni anlamanın önemini vurgulamaktadır. Son araştırmalar, amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal lober dejenerasyonda önemli bir oyuncu olan transaktif yanıt DNA bağlayıcı protein 43 kDa'nın (TDP-43), otofagozom işaretleyici mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B hafif zincir 3B-II (LC3-II) ile zenginleştirilmiş EV'ler aracılığıyla, özellikle otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde, otofajiye bağlı bir şekilde salındığını göstermektedir.

LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımının altında yatan mekanizmayı aydınlatmak için, hem hücre içi hem de hücre dışı LC3-II-pozitif vezikülleri değerlendirmek için erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak zorunludur. Bu çalışma, diferansiyel santrifüjleme yoluyla elde edilen hücresel ve EV fraksiyonlarında immünoblotlama yoluyla LC3-II seviyelerinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Otofagozom-lizozom füzyonunun bir inhibitörü olan Bafilomisin A1 (Baf), hücre içi ve hücre dışı LC3-II pozitif veziküllerin seviyelerini arttırmak için pozitif bir kontrol görevi görür. Tümör duyarlılık geni 101 (TSG101), multiveziküler cisimler için bir belirteç olarak kullanılır. Bu protokol uygulandığında, sporadik Creutzfeldt-Jakob hastalığı için genetik bir risk faktörü olan siRNA aracılı syntaxin-6'nın (STX6) yıkılmasının, TSG101 seviyeleri üzerinde önemli bir etki göstermezken, Baf ile tedavi edilen hücrelerin EV fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini arttırdığı gösterilmiştir. Bu bulgular, STX6'nın, özellikle otofagozom-lizozom füzyonunun bozulduğu koşullar altında, EV'ler yoluyla LC3-II'nin hücre dışı salınımını negatif olarak düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Otofajiyi değerlendirmek için yerleşik yöntemlerle birleştirildiğinde, bu protokol, LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımında spesifik moleküllerin rolü hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Transaktivasyon yanıtı DNA bağlayıcı protein 43 (TDP-43), tümü hücre sağkalımıiçin hayati önem taşıyan, ekzon ekleme, gen transkripsiyonu ve mRNA stabilitesinin düzenlenmesinde rol oynayan, yaygın olarak eksprese edilen heterojen bir nükleer ribonükleoproteindir 1,2. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve frontotemporal lober dejenerasyon (FTLD) gibi nörodejeneratif durumlarda, sitoplazmada anormal bir şekilde bir nükleer protein TDP-43 birikir. Bu kayma, çekirdekte TDP-43 fonksiyon kaybı ve sitoplazmada toksik bir fonksiyon kazancı ile sonuçlanır. TDP-43'ün patolojik birikimi, beynin ve omuriliğin belirli bölgelerinde başlar ve bu bölgelere prion benzeri bir şekilde yayılır, bu süreç hastalığın ilerlemesi ile yakından ilişkilidir3. Bununla birlikte, TDP-43 patolojisinin beyin ve omurilik yoluyla yayıldığı kesin mekanizma bilinmemektedir.

TDP-43, hücre dışı veziküller (EV'ler) yoluyla salgılanır ve ALS ve FTLD-TDP hastalarının plazma ve beyin omurilik sıvısında (BOS) yüksek TDP-43 seviyeleri tespit edilir 4,5,6. ALS ve FTLD teşhisi konan hastalardan elde edilen BOS, insan glioma hücrelerinde hücre içi yanlış lokalizasyona ve endojen TDP-43'ün agregasyonunaneden olur 7. Bu nedenle, EV'ler yoluyla hücre dışı olarak salınan TDP-43, TDP-43 patolojisinin hücreden hücreye yayılmasına aracılık edebilir.

Otofaji, istenmeyen maddelerin LC3 ile işaretlenen otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller içinde muhafazasını içeren iyi korunmuş bir hücresel bozunma mekanizmasıdır. Bu otofagozomlar, lizozomal ilişkili zar proteini 1 (LAMP1) pozitif lizozomlarla birleşerek otolizozomlar (LC3 + / LAMP1 +) oluşturur ve içeriklerininbozulmasına yol açar 8. Histolojik analizler, inklüzyonları yutan otofagozomların sporadik ALS hastalarınınnöronlarında biriktiğini göstermektedir 9. Ailesel ALS ve FTLD-TDP'nin bazı nedensel genleri, otofajinin düzenlenmesi ile bağlantılıdır 10,11,12. Bu bulgular ALS ve FTLD-TDP hastalarında otofajinin baskılandığını göstermektedir.

Önceki çalışma, TDP-43'ün, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde otofagozom belirteci LC3-II için pozitif EV'ler yoluyla salgılandığını göstermiştir13. Otofaji-lizozom yolunun düzensizliği sadece TDP-43'ün hücre içi birikimine değil, aynı zamanda TDP-43'ün EV'ler14 yoluyla hücre dışı salınmasına da neden olabilir. Bununla birlikte, LC3-II pozitif EV'lerin nasıl salındığı ve bunun TDP-43 patolojisinin yayılmasında ne kadar önemli olduğu bilinmemektedir.

EV'ler, hücre yüzeyi tomurcuklanmasından üretilen büyük EV'ler (100 ila 1000 nm çapında) ve endozomal zarların endozomun iç kısmına doğru tomurcuklanmasından üretilen küçük EV'ler (50 ila 150 nm çapında) (eksozomlar olarak bilinir) ve Golgi aygıtı. Büyük ve küçük EV'leri ayrı ayrı toplamak için sıralı santrifüjleme gerçekleştiriyor ve peletleri sırasıyla 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjleme ile topluyoruz. P1 EV fraksiyonu (20.000 × g peletler) büyük EV'leri toplamak için hazırlanır ve P2 EV fraksiyonu (110.000 × g peletler) küçük EV'leri toplamak için hazırlanır15. İmmünoblotlama ile ardışık santrifüjlemeden türetilen büyük ve küçük EV'lerde LC3-II seviyelerini değerlendirme metodolojisi stabil ve tekrarlanabilirdir16. EV'lerde LC3-II seviyelerini analiz etmenin yanı sıra, otolizozom ve omegazom oluşumunu analiz etmek, otofajinin düzensizliğinin LC3-II pozitif EV'lerin salınmasına nasıl yol açtığının anlaşılmasını geliştirir. Burada, bu çalışma, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II pozitif EV'lerin salınmasında, taşıma veziküllerinin hedef membran17'ye hareketini destekleyen bir SNARE proteini olan syntaxin 6'nın (STX6) baskılayıcı rolünü göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından hücre, P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması

  1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması
    1. 1. Gün
      1. Hücreleri bir hücre sayacı kullanarak sayın ve DMEM Yüksek Glikoz,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin'den oluşan bir kültür ortamı içeren 6 cm'lik bir plaka üzerine 1 × 106 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
    2. 2. Gün (isteğe bağlı)
      1. 20 μM siRNA çözeltisi hazırlayın.
      2. Çözelti A'yı hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamını ve 3 μL siRNA'yı düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      3. Çözelti B'yi hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamı ve 5 μL transfeksiyon reaktifini düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      4. Çözelti A ve çözelti B'yi karıştırın, ardından karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
      5. HeLa hücrelerini kültürlemek için kullanılan ortama A ve B çözeltilerinin karışımını ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
    3. 3. Gün
      1. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO2 ve 5 dakika boyunca kontrollü nem ile 500 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 2,5 mL kültür ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL'lik bir pipet ucu takılı bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve 10 cm'lik bir plakaya 1 ×10 6 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
        NOT: İmmünoblotlama analizi için gerekli kültür ortamından EV'leri toplamak için en az 1 × 106 hücre hazırlamak gerekir.
    4. 4. Gün
      1. Araç (DMSO) veya 100 nM Bafilomisin A1 (Baf) içeren kültür ortamını (bkz. adım 1.1.1.1) hazırlayın.
      2. Hücreleri araç veya 100 nM Baf içeren ortama maruz bırakın ve bunları 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
    5. 5. Gün
      1. Tüm kültür ortamını 10 cm'lik plakadan toplayın, 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
        NOT: 10 cm'lik plakada kalan hücreler bölüm 1.2.1'de kullanılacaktır.
      2. P1 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 3.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 20.000 × g'da santrifüjleyin.
      3. P2 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 20.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 110.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendili ile sildikten sonra, santrifüjleme tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda [% 2.5 SDS, 125mM Tris-HCl tamponu (pH 6.8)% 30 gliserol,% 10 2-merkaptoetanol,% 0.4 Bromofenol Mavisi] P1 EV fraksiyonunu hazırlamak için.
      5. Süpernatanı boşaltarak çıkarın, tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendiliyle silin ve ardından P2 EV fraksiyonunu hazırlamak için ultrasantrifüj tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda yeniden süspanse edin.
      6. P1 ve P2 EV fraksiyonlarını 100 °C'de bir ısı bloğu üzerinde 10 dakika inkübe edin.
        NOT: Santrifüjlemeden sonra 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjlemeden sonra kalan peletlerin yanlışlıkla atılmasını önlemek için tüpleri sallamayın. Süpernatanı aktarmak için tüpü eğdikten sonra, peletin kalan süpernatanın tekrar daldırılmasını önlemek için tüpün konumunu koruyun.
  2. Kültürlenmiş HeLa hücrelerinden hücre fraksiyonunun hazırlanması
    1. 5. Gün
      1. Kültür ortamının 10 cm'lik plakadan 15 mL'lik bir tüpe aktarılmasından sonra, 10 cm'lik tabaktaki hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO2 ve kontrollü nem ile 2 mL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 8 mL büyüme ortamı ekleyin, ardından hücreleri pipetlemek ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL pipet uçlu bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın, hücre peletine PBS ekleyin ve ardından 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      5. Bir aspiratör kullanarak PBS'yi çıkarın ve hücre peletini 1 mL A68 tamponunda [10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM etilen glikol bis (β-aminoetil eter) -N, N, N, N-tetraasetik asit (EGTA)] % 1 sarkosil içerir.
      6. Bir BCA protein tahlil kiti kullanarak hücre lizatının protein konsantrasyonunu ölçün.
      7. 300 μL hücre lizatını 100 μL 4x numune tamponu ile karıştırın ve hücre fraksiyonunu hazırlamak için karışımı 100 °C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.

2. İmmünoblotlama analizi

  1. Numunelerdeki eşdeğer miktarda proteini SDS-PAGE18 ile ayırın.
  2. Ayrılan proteinleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
  3. Transferden sonra, membranları 20 dakika boyunca bloke edici ajan ile bloke edin.
  4. RT'de %10 (h/h) buzağı serumu içeren Tris tamponunda belirtilen primer antikor ile tıkalı membranı gece boyunca inkübe edin.
  5. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'de 2 saat boyunca biyotin konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.
  6. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'deki kitten %0.4 (h/h) çözelti A ve çözelti B'yi içeren Tris tamponu ile 1 saat inkübe edin.
  7. Membranı PBS ile yıkayın ve ardından bantların kolorimetrik tespiti için% 0.04 (a / h) diaminobenzidin,% 0.8 (a / h) NiCl2 · 6H2O ve% 0.3 (h / h) H2O2 içeren PBS ile inkübe edin.
    NOT: Sinyallerin tespiti için bir kemilüminesans yöntemi de kabul edilebilir.
  8. Zarın görüntüsünü bir tarayıcı ile sayısallaştırın ve Fiji kullanarak dansitometri analizine tabi tutun.
    1. Fiji kullanarak sayısallaştırılmış görüntüyü açın ve RGB renkli görüntüyü Görüntü | Türü | 8 bit.
    2. Dikdörtgen aracına tıklayın ve şeritleri çevrelemek için sürükleyerek dikdörtgenin boyutunu ayarlayın. Analiz Et | Jeller | İlk şerit'i seçin.
    3. Dikdörtgeni ikinci ve sonraki bantların üzerine yerleştirin ve Analiz Et | Jeller | Sonraki Şerit'i seçin.
    4. Son bandı tanıdıktan sonra, Analiz Et | Jeller | Şeritleri çizin.
    5. Bandın sinyal alanını düz bir çizgi ile çevreleyin, değnek aracına tıklayın ve bandın sinyal yoğunluğunu hesaplamak için alana tıklayın.

3. Otofagozom ve otolizozom sayısının analizi

  1. 1. Gün
    1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta LAMP1-GFP ve mCherry-LC3 eksprese eden 1 ×10 5 HeLa hücresi tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
  2. 2. Gün (isteğe bağlı)
    1. 3,5 cm'lik tabaklarda bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
  3. 3. Gün
    1. Kültür ortamını 3,5 cm'lik tabaklardan atın.
    2. Hücreleri PBS ile yıkayın, 400 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın ve% 5 CO2 ve kontrollü nem ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    3. Hücrelere 1.6 mL büyüme ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bunları bir Pasteur transfer pipeti ile pipetleyin.
    4. Hücre sayacını kullanarak hücre sayısını sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 104 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
      NOT: Odacıklı lamel iki kuyusu, bölüm 3.4.2'de açıklandığı gibi DMSO veya Baf muamelesini takiben sırasıyla kontrol ve STX6 knockdown hücreleri için hazırlanır.
  4. 4. Gün
    1. Fenol kırmızısı içermeyen büyüme ortamını hazırlayın (Fenol Kırmızısı içermeyen DMEM,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin), her iki araç (DMSO) veya DMSO'da çözünmüş 100 nM Baf içerir.
    2. Kültür ortamını, araç veya 100 nM Baf içeren fenol kırmızısı içermeyen ortamla değiştirin ve 4 saat inkübe edin.
      NOT: Baf'ın otofagozom ve otolizozom sayıları üzerindeki etkisini değerlendirmek için, araçla tedavi edilen hücreleri kontrol olarak hazırlayın.
    3. Gözlemden önce çekirdekleri 30 dakika boyunca 0.33 μg / mL Hoechst 33342 ile boyayın.
    4. Konfokal lazer mikroskobunda 60x objektif lens kullanarak Canlı hücre görüntüleme yapın ve on farklı kare yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüyü Fiji'de açın ve Görüntü | Renk | Kanalları Böl.
      2. Her görüntüdeki kırmızı ve yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlayın tıklayarak Görüntü | Ayarla | Her deney için eşik .
      3. Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. Otofagozom ve lizozomla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayım'daki değerleri kaydedin.
      4. Yeşil görüntüyü kırmızı görüntünün üzerine bindirmek için, Düzenle | Yapıştırma Kontrolü. Yeşil görüntüyü kopyalayın ve ardından hem kırmızı hem de yeşil sinyaller için pozitif olan alanları vurgulayarak birleştirmek için kırmızı görüntünün üzerine yapıştırın.
      5. Otolizozom sayılarını tanımlamak için, Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin, Tamam'a tıklayın ve otofagozomlar ve lizozomlarla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayı bölümündeki değerleri kaydedin.
    5. Hücre başına otolizozom ve otofagozom sayısını hesaplamak için toplam otolizozom ve otofagozom sayısını toplam hücre sayısına bölün.
      NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 35 hücre sayın.

4. Omegazom oluşumu için analiz

  1. 1. Gün
    1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabağa 1 ×10 5 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
  2. 2. Gün (isteğe bağlı)
    1. Bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
  3. 3. Gün
    1. Adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
    2. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta 1 × 105 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
  4. 4. Gün
    1. Düşük retansiyonlu bir tüpte 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL DNA transfeksiyon reaktifi ve 100 μL indirgenmiş serum ortamını karıştırın. Karışımı 20 dakika inkübe edin, ardından kültürlenmiş ortama ekleyin.
    2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
  5. 5. Gün
    1. Hücreleri adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tripsinize edin.
    2. Hücrelere 2.5 mL büyüme ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için karışımı bir Pasteur transfer pipeti kullanarak pipetleyin.
    3. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 104 hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
  6. 6. Gün
    1. Konfokal lazer mikroskobu kullanarak adım 4.5.3'ten itibaren hücrelerin canlı hücre görüntülemesini yapmak için 3.4.1-3.4.4 adımlarını izleyin. On farklı görüntü karesi yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüleri ilgili kırmızı, yeşil ve mavi görüntü bileşenlerine bölmek, her görüntüdeki yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlamak ve GFP sinyal yoğunluğunu belirlemek için 3.4.4.1-3.4.4.3 adımlarını izleyin. GFP-ATG13'ün sinyal yoğunluğunu belirlemek için Toplam Alan bölümündeki değerleri kaydedin.
      2. Hücre başına sinyal yoğunluğunu hesaplamak için toplam sinyal yoğunluğunu incelenen hücre sayısına bölün.
        NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 34 hücre sayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, Baf tedavisi TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) ve LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) EV açısından zengin fraksiyonda. Özellikle, Baf tedavisi ayrıca EV fraksiyonundaki STX6 seviyelerini de arttırdı (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) (Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İmmünoblotlama çalışmasında hücresel fraksiyonda LC3-II ve TSG101 seviyeleri, mikrovezikülden zengin P1 EV fraksiyonu ve eksozomdan zengin P2 EV fraksiyonu ortaya çıktı. Otofagozomları, otolizozomları ve omegazomları incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanıldı ve STX6 yıkımının otofajiyi etkileyip etkilemediğine dair fikir verdi. Bu birleşik sonuçlar, STX6 yıkımının, potansiyel olarak otofaji yolunun düzensizliği ile bağlantılı olan LC3-II pozitif EV'lerin salınım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği KAKENHI [Hibe Numarası 23K06837] (Tokyo, Japonya) ve Takeda Bilim Vakfı'ndan (Osaka, Japonya) Y.T.'ye sağlanan fonlarla desteklenmiştir. Yazarlar, HeLa hücrelerini sağladığı için Dr. David C. Rubinsztein'e (Cambridge Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Cambridge, İngiltere) teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0,25 Tripsin EDTAFujifilm Wako201-16945
10 cm ÇanakThermo Fisher Scientific150464
15 mL TüpThermo Fisher Scientific339650
200 & mu; L Pipet UcuNippon GeneticsFG-301pipetleme
2-MerkaptoetanolNacalai Tesque21417-52için bir malzeme
numune tampon çözeltisi
3,3'-Diaminobenzidin TetrahidroklorürNacalai Tesque11009-41DAB çözeltisi için bir malzeme
3,5 cm Tabak Thermo Fisher Scientific150460
6 cm Tabak TrueLineTR4001
Alüminyum Blok Termostatik Banyolar (kuru termobanyolar)EYELA273860
AspiratörSANSYOSAP-102inhalasyon solüsyonu
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomisin A1AdipogenBVT-0252
Biotin konjuge Keçi Anti-tavşan IgG AntikorVektörü Laboratuvarlar BA-1000İmmünoblotlama için 2. antikor
Biotin konjuge At Antimouse IgG Antikoru VektörLaboratuvarları BA-2000İmmünoblotlama için 2. antikor
BirNacalai Tesque03953-95immünoblotlama için bir malzeme
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61
numune tampon çözeltisi için bir malzeme
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Tarayıcı
Santrifüj 5702 Reppendolf5703000039
Sayma Slaytları Çift OdacıklıBio-Rad1450015Jhücre sayımı
Dijital Sonifier 450BRANSON
Dimetil SülfoksitNacalai Tasque09659-14araç
DMEM Yüksek GlikozNacalai Tesque08458-45kültür ortamı
Fenol Kırmızısı olmadan DMEMNacalai Tesque08489-45kültür ortamı
EGTADojindo 348-01311A68 çözümü için bir malzeme
ExcelMicrosoftsürüm 16.16.27satistik analiz
EZRReferans No. 24sürüm 1.68satistik analiz
FBSSigma173012Kültür ortamı
FijiNIHGörüntü analiz aracı
GliserolNacalai Tesque09886-05için bir malzeme
örnek tampon çözeltisi
Hoehst33342Dojindo H342
Hidrojen PeroksitFujifilm Wako080-0186DAB çözeltisi için bir malzeme
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011temizleme mendili
Düşük Tutma TüpüNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA ve DNA transfeksiyonu
LSM780 Konfokal Lazer MikroskobuCarl Zeiss
Monoklonal Fare Anti-LC3 AntikorMBLM186-3İmmünoblotlama için 1. antikor
Nikel(II) Klorür HekzahidratFujifilm Wako149-01041DAB çözeltisi için bir malzeme
N-Lauroylsarcosine Sodyum TuzuNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltrasantrifüjBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Bilimsel31985-070siRNA ve DNA transfeksiyonu
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penisilin / StreptomisinNacalai Tesque26253-84Kültür ortamı
Pierce BCA Protein Test KitleriThermo Fisher Scientific23225
Poliklonal Tavşan Anti-PCNA AntikoruBioAcademia70-0801. antikor immünoblotlama
Poliklonal Tavşan Anti-syntaxin 6 AntikorProteinTech10841-1-APİmmünoblotlama için 1. antikor
Poliklonal Tavşan Anti-TSG101 AntikoruProteinTech28283-1-APİmmünoblotlama için 1. antikor
Poliklonal Tavşan Anti-ULK1 AntikoruProteinTech20986-1-APİmmünoblotlama için 1. antikor
Poliviniliden Diflorür MembranMillioreIPVH00010immünoblotlama için bir malzemedir
RR geliştirme çekirdek ekibisürüm 4.4.1satistik analiz
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA transfeksiyon reaktifi
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604transfeksiyon için siRNA
Sodyum KlorürNacalai Tesque31320-05Tris
tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme
Sodyum Dodesil SülfatFujifilm Wako192-13981> için bir malzeme
SPARK Mikroplaka OkuyucuTECAN
Stealth RNAi Negatif Kontrol Dubleksleri, Med GCThermo Fisher Scientific12935300siRNA transfeksiyonu
SükrozFujifilm Wako193-00025A68 çözümü için bir malzeme
TC20 Termal Yazıcılı Otomatik Hücre SayacıBio-Rad1450109J1hücre sayımı
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100inkübasyon
TransIT-293Mirus BioMIR 2700DNA transfeksiyon reaktifi
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300DNA transfeksiyon reaktifi
Tris (hidroksimetil) aminometanNacalai Tesque35406-75Tris tamponu, numune tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme
Tripan Mavi Boya% 0.40Bio-Rad1450021hücre sayımı
Ultra Şeffaf Üstü Açık Tüp, 16 x 96mm  Beckman Coulter361706P1 EV fraksiyonu için toplama
yapıyor Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89mmBeckman Coulter344059P2 EV fraksiyonu için toplama
Vectastain ABC Standart KitiVector Laboratories PK-4000immünoblotlama
Yıkama ŞişesiBir Olarak1-4640-02yıkama membranı
μ-Slide 8 Kuyulu Yüksekibidi80806

Kaynaklar

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Otofaji YolağıTDP-43 PatolojisiDiferansiyel SantrifüjlemeBafilomisin A1İmmunoblotlamasiRNA BaskılamaSintaksin-6Multiveziküler Cisimler
Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.