Yöntem makalesi

Viral Olmayan Uyuyan Güzel Transpozon Sistemini Kullanarak Mantar Enfeksiyonlarını Hedefleyen Mühendislik Kimerik Antijen Reseptörü-Doğal Öldürücü Hücreler

DOI:

10.3791/67424

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar patojenlerini hedef alan kimerik antijen reseptörü-doğal öldürücü (CAR-NK) hücreleri üretmek için bir transfeksiyon protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Antijene özgü aktivasyonu değerlendirmek için, tasarlanmış hücreleri Aspergillus fumigatus germ tüpleri ile birlikte kültürledik ve IFN-γ sekresyonunu ölçtük.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) bazlı hücre tedavileri, hematolojik malignitelerin tedavisinde etkileyici etkinlik göstermiştir. Son zamanlarda, bu tedaviler bulaşıcı hastalıklar için geliştirilmektedir, ancak mantar enfeksiyonlarını hedef alan çalışmalar azdır. Optimal hedefleri belirlemek ve hücresel ürünleri optimize etmek için, kimerik antijen reseptörü-doğal öldürücü (CAR-NK) hücreleri tasarlamak için bir yöntem geliştirdik ve mantarlar tarafından stimülasyona tepkilerini değerlendirdik. Bu makale, viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar hedeflerine göre uyarlanmış CAR-NK hücreleri üretmek için basit ve sağlam bir yöntemi açıklamaktadır. NK-92 hücreleri, plazmid kodlu bir CAR transpozonu ile birlikte mini daire DNA (MC) olarak vektörize edilmiş hiperaktif transpozaz SB100X ile transfekte edilir. Transfeksiyon etkinliği 1 hafta sonra akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirilir. Fonksiyonel testten önce, transgeni eksprese eden hücreler, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir ve 1 hafta daha kültürlenir. Antijene özgü aktivasyonu değerlendirmek için, tasarlanmış hücreler en az 6 saat boyunca Aspergillus fumigatus germ tüpleri ile birlikte kültürlenir. Daha sonra, salgılanan interferon-gama (IFN-γ) konsantrasyonu, enzime bağlı bir immünosorbent testi kullanılarak ölçülür.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) her yerde bulunan bir mantardır ve ortalama bir insan günlük olarak 100 ila 1.000 conidia solumaktadır1. Kemoterapi gören veya lösemiden muzdarip olanlar gibi edinilmiş veya konjenital immün yetmezlikleri olan hastalarda, A. fumigatus ciddi invaziv apsergilloza neden olabilir. Her yıl dünya çapında 200.000'den fazla insan aspergilloza yakalanmaktadır. Azol türevleri ile korunma ve tedavi için antimikotik kullanımına rağmen, mortalite oranı %30 ile %95 arasında kalmaktadır2,3. Ek olarak, tedavinin önemli yan etkileri vardır ve A. fumigatus kültürlerinin %7'si zaten azole dirençlidir4.

Kimerik antijen reseptörü (CAR) ile tasarlanmış T hücreleri ile tedavi, malign hastalıkların tedavisinde klinik başarı göstermiştir ve invaziv aspergilloz 5,6,7,8 gibi bulaşıcı hastalıklarla mücadelede umut verici klinik öncesi sonuçlar elde etmiştir. A. fumigatus hyphae'nin hücre duvarındaki bir proteini hedef alan daha önce tarif edilen Af-CAR-T hücreleri, klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar göstermiştir6.

Graft versus host hastalığı, sitokin salınım sendromu ve nörotoksisite riskinin azalması, CAR-NK hücrelerini akut enfeksiyonlar için "kullanıma hazır" bir tedavi olarak CAR-T hücrelerine değerli bir alternatif haline getirir9. Ek olarak, NK hücrelerinin antifungal bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. A. fumigatus ile uyarıldığında, NK hücreleri IFN-ɣ gibi sitokinler ve CCL-3 ve CCL-4 gibi kemokinler salgılar ve sitotoksik granüller salgılar10,11.

NK-92 hücre hattı, genetik mühendisliği için popüler bir NK hücresi kaynağıdır ve nispeten basit kültür koşullarında hızlı çoğalma ve genişleme avantajı sunar12. Birkaç klinik öncesi çalışma, hem hematolojik hem de katı tümörlerin tedavisinde CAR ile dönüştürülmüş NK-92 hücrelerinin terapötik potansiyelini göstermiştir. Güvenliklerini, etkinliklerini ve "kullanıma hazır" hücresel tedavi olarak potansiyel kullanımlarını araştırmak için çok sayıda klinik çalışma devam etmektedir13.

NK hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği ve stabil transgen ekspresyonu elde etmek zordur. Viral yöntemler yüksek verimlilik vaat ederken, sonraki onkogenez ile birlikte yerleştirme mutasyonları riski taşırlar 9,14. En yeni nesil Uyuyan Güzel (SB) transpozon vektörleri, viral ve geçici viral olmayan gen verme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelerek, kararlı gen transferi için güvenli, güçlü ve ekonomik olarak uygulanabilir bir sistem sunar15.

Bu nedenle, bu protokol, yaşamı tehdit eden invaziv aspergillozlu hastalar için potansiyel olarak "kullanıma hazır" bir terapötik seçenek olarak hizmet edebilecek Af-CAR-NK-92 hücrelerinin üretilmesi için yeni bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Bu yaklaşımın etkinliği, A. fumigatus hyphae ile stimülasyon üzerine IFN-ɣ üretiminin artmasıyla örneklenmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm deneyler steril koşullar altında yapılmalıdır. Bu protokolde iki koşul gösteriyoruz: (I) Kontrol görevi görecek DNA'sız sahte transfeksiyon ve (II) daha önce açıklanan Af-CAR6 kullanılarak CAR transfeksiyonu. Af-CAR plazmidi, bir transfeksiyon markörü olarak kullanılacak olan CAR'ın aşağı akışında kesilmiş bir epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFRt) dizisi içerir (Ek Şekil S1). Her koşul için 4 × 106 NK-92 hücresi gereklidir.

1. NK-92 hücrelerinin kültürlenmesi

  1. Transfeksiyondan bir veya iki gün önce, aşağıdaki bileşime sahip taze hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 75 (h / h) alfa-MEM Ortamı (nükleositlerle) +% 12.5 (h / h) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) +% 12.5 (h / h) ısıyla inaktive edilmiş at serumu + 2 mM L-glutamin.
  2. 5 × 105 5 hücre / mL hücre yoğunluğunda en az10 7 NK-92 hücresini yeniden askıya alın.
  3. 150 UI / mL'lik bir konsantrasyonda hücre süspansiyonuna IL-2 ekleyin.
  4. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
    NOT: IL-2, 5 ng/mL'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılabilir.

2. Viral olmayan transfeksiyon

  1. Mikroskop altında hücrelerin kalitesini kontrol edin. Hücre kümelerinin askıya alınması ve net bir arka plan, sağlıklı bir hücre kültürünü gösterir.
  2. 6 oyuklu bir plakada, her koşul için oyuk başına 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Antibiyotikler, transfeksiyondan sonra hücre canlılığını azaltabilir. Ortamı antibiyotiksiz tutun.
  3. Hücreleri sayın ve kullanarak hücre canlılığını kontrol edin (örneğin, Tripan Mavisi boyama).
  4. 8 × 106 NK-92 hücresini 15 mL konik tabanlı bir tüpe aktarın. 200 × g'da 5 dakika boyunca 3 hızlanma ve yavaşlama ile santrifüjleyin. Aşağıdaki tüm santrifüj adımları için bu programı kullanın.
  5. Santrifüjleme sırasında iki adet 1.5 mL reaksiyon tüpü hazırlayın. Af-CAR için DNA'yı (8 μg Plazmid-DNA ve 4 μg SB100X Mini Daire, Tablo 1) tüplerden birine pipetleyin. İkincisini Mock kontrolü olması için DNA'sız tutun.
  6. Santrifüj hazır olduğunda, süpernatanı nazikçe atın ve hücreleri içeren tüpü 15 mL'ye kadar önceden ısıtılmış Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile doldurun.
  7. Santrifüj (aşama 2.4).
  8. Santrifüjleme sırasında, her tüpe 3 mL elektrolitik tampon ekleyerek her koşul için bir transfeksiyon sistemi tüpü hazırlayın. İlk tüpü pipet istasyonuna yerleştirin.
  9. Santrifüj hazır olduğunda, süpernatanı nazikçe atın ve hücre peletini 200 μL yeniden süspansiyon tamponunda (100 μL / 4 × 106 hücre) yeniden süspanse edin.
    NOT: Hücreleri 15-30 dakikadan fazla yeniden süspansiyon tamponunda bırakmaktan kaçının, çünkü bu hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini düşürür.
  10. İki reaksiyon tüpünün her birine 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Yavaşça karıştırın.
    NOT: Hava kabarcıkları hücre ölümüne yol açan ark oluşumuna neden olduğundan, pipetleme sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
  11. İlk reaksiyon tüpünden gelen DNA hücresi karışımını transfeksiyon sistemi pipeti ile pipetleyin ve pipeti pipet istasyonuna yerleştirilen tüpe dikey olarak yerleştirin.
    NOT: Ucun düzgün şekilde oturduğundan emin olun.
  12. İlk darbeyi 1.650 V'a ve darbe süresini 20 ms'ye ayarlayın ve Başlat'a basın.
  13. Tamamlandıktan sonra, ikinci darbeyi 500 V'a ve darbe süresini 100 ms'ye ayarlayın. Başlat'a basın.
  14. Tamamlandıktan sonra, pipeti pipet istasyonundan yavaşça çıkarın ve hücreleri hemen 2 mL önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı içeren hazırlanmış kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın (bkz. adım 2.2). Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı yavaşça dairesel olarak hareket ettirin.
  15. Sahte numune için, DNA'sız reaksiyon tüpünden 100 μL hücre süspansiyonu alın (bkz. adım 2.9) ve yeni bir tüp ve yeni bir pipet ucu kullanarak aynı prosedürü adım 2.11'den adım 2.14'e kadar tekrarlayın.
  16. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  17. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, 150 UI / mL'lik bir son konsantrasyonda IL-2 ekleyin.

3. Akış sitometrisi kullanarak transfeksiyon verimliliğinin kontrol edilmesi

  1. Hücreleri her iki günde bir 1 hafta yetiştirdikten ve böldükten sonra, her koşuldan 1-5 × 105 hücreyi polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe alın.
  2. 1 mL tampon ekleyerek hücreleri yıkayın (PBS +% 0.5 (h / h) FBS + 2 mM EDTA); Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
  3. Hücre peletini 50 μL tamponda yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri tespit etmek için 1 μL 7-AAD ekleyin.
  4. Transfekte edilmiş hücreleri boyamak için 5 μL anti-tEGFR-Alexa fluor 647 antikoru ekleyin.
  5. 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  6. Hücreleri yıkayın (bkz. adım 3.2).
  7. Hücre peletini 200 μL tampon içinde yeniden süspanse edin.
  8. Numuneleri bir akış sitometresinde ölçün.
    NOT: Transfeksiyon verimliliği tatmin edici değilse, transgen eksprese eden hücrelerin zenginleştirilmesine devam edin.

4. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) ile transgen eksprese eden hücrelerin zenginleştirilmesi

NOT: En iyi sonuçlar için protokolü 8-10 × 106 hücre ile başlatın. Tüm santrifüjleme adımları 4 °C'de gerçekleştirilir.

  1. Arabelleği adım 3.2'de açıklandığı gibi hazırlayın. Hücreleri 1-2 × 106/100 μL konsantrasyonda 15 mL'lik konik bir alt tüpte tampon ile seyreltin.
  2. 1-2 × 106 hücre başına 1 μL anti-EGFRt-biyotin ekleyin ve eşit dağılmış bir çözelti sağlamak için tüpü hafifçe döndürün.
  3. 4 ° C'de 25 dakika inkübe edin, ardından tüpü 10 mL'ye kadar tamponla doldurun.
  4. Merkezkaç. Süpernatanı atın.
  5. 8 μL/1 × 106 hücreli soğuk tampon ekleyin.
  6. 1 × 106 hücre başına 2 μL anti-biyotin manyetik boncuk ekleyin.
  7. 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  8. 10 mL'ye kadar tampon ile doldurarak yıkayın.
  9. Merkezkaç. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL tamponda yeniden süspanse edin.
  10. MACS mıknatısına bir LS sütunu yerleştirin ve 3 mL tampon ile yıkayın.
  11. Tampon sütundan tamamen geçer geçmez, hücre süspansiyonunu ekleyin.
  12. Her biri 3 mL tampon ile sütunu 3x yıkayın.
  13. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik temiz bir konik alt boruya yerleştirin.
  14. Sütuna 5 mL tampon ekleyin. Pistonu kullanarak EGFR pozitif hücreleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın.
  15. Hücreleri birkaç gün kültürleyin; Ardından, akış sitometrisi ile verimliliği kontrol edin.

5. Fonksiyonel test

NOT: Yaklaşan deney için aşağıdaki ortamı hazırlayın ve kullanın: RPMI + %20 FBS.

  1. 1. Gün - Aspergillus fumigatus conidia'nın tohumlanması
    1. Ortamda 2.5 × 105 conidium / mL konsantrasyonda bir A. fumigatus conidia süspansiyonu hazırlayın.
    2. 96 oyuklu bir kültür plakasında, oyuk başına 100 μL conidia süspansiyonu pipetleyin ve 25 ° C'de 16 saat inkübe edin.
      NOT: Kuluçka döneminden sonra conidia filizlenecektir (Şekil 1).
  2. 2. Gün - CAR NK-92 hücreleri ile ko-kültür
    1. Mock ve Af-CAR NK-92 hücrelerini ortamla 2 kez yıkayın.
    2. Kuyucuk başına 100 μL ortama 5 × 104 hücre ekleyerek 2: 1'lik bir efektör-hedef oranında mantar ile ko-kültür (Şekil 2).
    3. Pozitif kontrol için, 100 μL ortamda oyuk başına 1 ng PMA ve 100 ng iyonomisin ekleyin. Ortamdaki hücreleri yalnızca negatif kontrol olarak kullanın.
    4. Plakayı 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörde en az 6 saat inkübe edin.
    5. Plakayı 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    6. Her kuyudan 100 μL hasat edin; Tabana dokunmaktan kaçının. Süpernatanları reaksiyon tüplerine aktarın.
      NOT: Yetişen mantarın değil, yalnızca süpernatantın pipetlendiğinden emin olun. Şüpheniz varsa, başka bir santrifüjleme adımı ekleyin.
    7. Üreticinin talimatlarına göre IFN-ɣ ELISA gerçekleştirin veya s'de saklayınamples kullanana kadar -80 °C'de.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfeksiyon, geri kazanım, zenginleştirme ve genişletme dahil olmak üzere Af-CAR NK-92 hücrelerinin üretilmesi sürecinin tamamı yaklaşık 14 gün sürer. Transfeksiyondan sonra, hücreler kültürlenir ve her iki günde bir bölünür. Transfeksiyondan iki gün sonraki ilk bölünme sırasında hücre canlılığı azalabilir. Tipik olarak, hücreler transfeksiyondan 4 gün sonra iyileşir ve 48 saatlik bir ikiye katlama süresiyle çoğalmaya başlar.

Geri kazanımı takiben, transfeksiyon verimlilikleri ölçülür ve -20'ye ulaşması beklenir ( Şekil 3'te

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlanan protokol, viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar patojenlerini hedef alan CAR-NK hücreleri oluşturmak için basit ve güvenilir bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha ileri analizler için gerekli miktarları elde etmek için hücrelerin genişlemesini sağlayan büyük transgenlerin kararlı ve kalıcı olarak yerleştirilmesine izin verir14,16.

Hücre sayısı ve canlılığı, nabız gücü ve süresi ile DNA kalitesi ve miktarı17 dahil olmak üzere birkaç temel faktör transfeksiyonun başarısını etkileyebilir. Başlamadan önce hücrelerin sağlığını değerlendirmek ve en az %90'lık bir canlılık sağlamak çok önemlidir. Yüksek bir nabız kuvvetinin, bir hücre popülasyonunun transfeksiyon verimliliğini artırabileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda hücre canlılığında önemli bir azalmaya neden olabilir. Fazla hücre ve sınırlı miktarda veya kalitede DNA'ya sahip durumlarda, plazmiti başarılı bir şekilde alan hücre sayısı yetersiz olabilir17. Bununla birlikte, yüksek DNA konsantrasyonlarının toksik olduğu ve hücre canlılığını azalttığı gösterilmiştir18.

Önceki çalışmalar daha yüksek transfeksiyon verimlilikleri elde etmiş, ancak yalnızca geçici protein ekspresyonunaodaklanmıştır 17. Buna karşılık, protokolümüz stabil transgen eklenmesini sağlar. Düşük transfeksiyon verimliliklerini ele almak için, pozitif transfekte edilmiş hücrelerin zenginleştirilmesini uyguladık ve yaklaşık %95 CAR eksprese eden hücreler elde ettik. Ancak bu, üretim süresini ~ 1 haftaya çıkardı. Daha kısa üretim süreleri isteniyorsa, transpozon DNA'sı, transfeksiyon verimliliğini artırabilen ve zenginleştirme adımı19'a olan ihtiyacı ortadan kaldırabilen bir mini daire olarak teslim edilebilir. Bununla birlikte, hücre iyileşmesine ve çoğalmasına izin vermek için üretim süresi <1 haftaya düşürülemez.

İnvaziv aspergillozun akut doğası göz önüne alındığında, "kullanıma hazır" hücresel tedaviler faydalı olacaktır. Hastalardan hücrelerin izole edilmesi ve birincil hücrelerin genişletilmesi ile ilgili zorluklar ve maliyetler, NK-92'nin CAR-NK hücre üretimi20 için uygun bir hücre hattı olarak popülaritesini artırmıştır. NK-92 hücreleri genellikle sağlamdır ve IL-2 varlığında hızla çoğalır, bu da nispeten kısa bir sürede büyük hücre miktarlarının elde edilmesini kolaylaştırır. Bu avantajların ışığında, NK-92 hücrelerini gen mühendisliği yapmak için bir protokol geliştirdik ve bu da CAR-NK hücresel ürünlerini yüksek saflıkta güvenli bir şekilde transfekte etmenin ve hazırlamanın mümkün olduğunu gösterdi. Bu protokol birincil CAR-NK hücrelerini hazırlamak için uyarlanabilirken, çeşitli modifikasyonlar dikkate alınmalıdır. Bunlar, darbelerin sayısını ve yoğunluğunu, kullanılan DNA miktarını optimize etmeyi ve uygun bir genişletme protokolü oluşturmayı içerir. Protokolde yapılacak herhangi bir değişiklik, etkinliği sağlamak için kapsamlı bir araştırma gerektirecektir. Bununla birlikte, protokolümüz gelecekteki deneylerde birincil NK hücreleri için uyarlanabilecek temel bir şablon sağlar.

Özetle, stabil Af-CAR-NK hücreleri üretmek için bu yenilikçi transfeksiyon protokolü, diğer hastalıkları hedeflemek için kullanılabilecek verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Ek olarak, çeşitli antijenleri hedefleyen yeni CAR'ları taramak için uygun maliyetli bir yöntem olarak kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.: Kısmen endüstriye lisanslı, CAR teknolojisi ile ilgili patent başvuruları ve verilen patentler konusunda mucit. Kurucu ortak ve hisse sahibi T-CURX GmbH, Würzburg. Konuşmacı onur listesi: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Araştırma desteği: BMS. M. B., bu çalışmayla ilgisi olmayan ilaç şirketi "Eli Lilly and company"den seyahat desteği aldığını bildirdi. Diğer yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proje için finansman ve destek Wilhelm Sander Stiftung, 2020.017.1 projesi MH ve JL tarafından sağlandı; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Ortak Araştırma Merkezi/Transregio 124 Patojenik mantarlar ve insan konakçıları: Etkileşim ağları-FungiNet; proje A8'den M.H. ve H.E.'ye).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ML konik tabanlı borularGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERIL
50 ML konik tabanlı borularGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLTAR, STERIL
6 ve 96 Kuyucuklu hücre kültürü plakasıCorning Inc. Yaşam Bilimleri83-3736 / 83-3474TC ile işlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları, Düz dipler, Optimal hücre bağlanması için işlenmiş, Gama ışınlaması ile sterilize edilmiş, Pirojenik olmayan
7-AAD (7-Aminoaktinomisin D)BD Biosciences,akış sitometrik tahlillerinde cansız hücrelerin dışlanması için kullanıma hazır nükleik asit boyası
Alexa Fluor 647 anti-insan EGFR Antikoru Biolegend352918Klon AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637Monoklonal fare anti-biyotinine konjuge UltraPure MicroBeads antikorlar
Aspergillus fumigatusATCC46645
Biyosfer Filtre Uçları (20 ve 100 μ L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Sigma-AldrichD8537  Modifiye, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun, endotoksin, test edilmiş
ELISA MAX Deluxe Set İnsan IFN-&gama;Moleküler
0.5  H2O, DNase, RNase, NICKase ve proteazda M, hiçbiri tespit edilmedi, 0.2 & mu; m filtrelenmiş.
FACS temizBD Biosciences340345
FACS Akış Kılıfı SıvısıBD Biosciences342003
FACS Durulama ÇözeltisiBD Bioscience340346
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF7524steril filtreli, hücre kültürü için uygun, kullanımdan önce ısı inaktive edilmiş
Gibco, MEM ve alfa;, nükleositlerThermofisher Bilimsel22571020Fenol Kırmızısı, Ribonükleozitler, Deoksiribonükleozitler, Sodyum Bikarbonat
At serumuThermo Fisher Scientific16050122Steril filtreli, kullanımdan önce ısı inaktive edilmiş
İnsan IL-2 IS, araştırma sınıfıMiltenyi Biotec130-097-742Araştırma sınıfı. ED50 ≤ 0.3 ng/mL, &ge aktivitesine karşılık gelir; 3 & kez; 106< / sup> IU / mg.
conglobatus'tan iyonomisinSigma-AldrichI0634-1MG, sitokin sekresyonu için pozitif kontrol olarak kullanılır 
Hücre kültürü içinL-GlutaminSigma-AldrichW368401
MACS LS SütunuMiltenyi Biotec130-042-401& nbsp; Kolonlar ve pistonlar, steril paketlenmiş
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Yeniden Süspansiyon Tamponu R, Elektrolitik Tampon E2, 100 & mu; L Neon Uçlar, Neon Elektroporasyon Tüpleri
Phorbol-12-myristat-13-asetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGsitokin sekresyonu için pozitif kontrol olarak kullanılır 
Akış sitometrisi Reaksiyon tüpü için kullanılan5 mLBD BioscienceS-452400
, 1.5 MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, şeffaf, kapak takılı, enjekte edilmiş derecelendirme ile. Kullanmadan önce sterilize edilmiştir.
RPMI 1640 Orta, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Fenol Kırmızısı, HEPES, Steril filtreli
TipOne 1000 & mu; L XL Dereceli Filtre UcuStarLabS1122-1730
Ekipman< / güçlü >
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2< / sub> İnkübatör C60 ve nbsp;Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX mikroplaka yıkayıcı Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
Neon Transfeksiyon SistemiInvitrojen
Pipetleri Eppendorf
Quadro MACS Ayırıcı Miltenyi Biyotec
559925 biyoloji için Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu çözeltisi (EDTA) Sigma-Aldrich E7889 430104 Biolegend, Streptomyces

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CAR NK H creleriNK 92 H creleriManyetik Aktive H cre Ayr t rmaAspergillus FumigatusViral Olmayan Gen Transferinterferon Gama Salg sAk Sitometrik AnalizEnzim Ba l mm nosorbent Deneylemi

İlgili makaleler