Brassica'da Hipoksi Toleransını İncelemek için Bir Lahana Protoplast Sisteminin Geliştirilmesi

Özet

Bu protokol, verimli bir lahana mezofil protoplast sistemini tanımlar. Çeşitli oksijen eksikliği tedavileri test edildi ve sistem, Brassicaceae sebzelerinde taşkın toleransının genetik ve moleküler mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştıran, hipoksiye duyarlı genlerin yüksek bir aktivasyonunu gösterdi.

Özet

İklim değişikliği daha yoğun yağış getirdiğinden, önemli bir Brassicaceae sebzesi olan lahana, sel kaynaklı hipoksi stresi nedeniyle önemli verim kayıplarıyla karşı karşıyadır. Lahanalarda taşkın tolerans mekanizmalarını belirlemek için, lahanaların dönüşüm-inatçı doğasının üstesinden gelmek için genetik fonksiyonel çalışmalar için çok yönlü bir platforma ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, bir lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi ve buna karşılık gelen bir protoplast hipoksi indüksiyon protokolü geliştirilmiştir. Bu protokol, optimize edilmiş enzimatik koşullar kullanılarak %40'ı aşan bir transfeksiyon verimliliği ile lahana yapraklarından yüksek verim ve protoplast izolasyonu bütünlüğü elde etti. Tedavilerden önce potansiyel hipoksik etkiyi hafifletmek için, çözünmüş oksijen seviyelerini artırmak için W5 çözeltisi oksijen gazı ile köpürtüldü. EC-Oksiras, OksiFlor, sodyum sülfit ve bir oksijen emici paket dahil olmak üzere oksijen seviyelerini ayarlamak ve fizyolojik oksijen atma işlemleri için çeşitli kimyasallar test edildi. Çift lusiferaz deneyleri, anaerobik solunum yanıtı genleri BoADH1 ve BoSUS1L'nin promotörlerinin, hipoksi tedavilerinden sonra lahana protoplastlarında aktive edildiğini ve oksijen emici paket ile tedaviden sonra gözlenen en yüksek indüksiyon seviyesi olduğunu gösterdi. Özetle, hipoksi tedavisi ile birleştirilen lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi, verimli ve kullanışlı bir platform göstermektedir. Bu platform, lahanalarda hipoksi tepkileri ile ilişkili gen fonksiyonu ve moleküler mekanizmaların çalışmasını kolaylaştırabilir.

Giriş

Küresel iklim değişikliği, dünya çapında giderek daha kritik bir sorun olarak ortaya çıkan selleri daha da kötüleştirdi. Son yıllarda, sel olaylarının sıklığında artış eğilimi görülmüş ve bu da önemli mahsul kayıplarına neden olmuştur ^1,2. Önemli küresel öneme sahip bir sebze olan lahana (Brassica oleracea var. capitata L.), yoğun yağışların olumsuz etkilerine karşı hassastır ve aşırı hava olayları karşısında sürdürülebilir üretimi sağlamak için sele dayanıklı lahana çeşitlerinin geliştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, lahanada taşkın stresi ile ilişkili moleküler mekanizmaları anlamak, bu zorluğun üstesinden gelmek için çok önemlidir.

Batık koşullar altındaki bitkilerde gen düzenleme mekanizmalarını anlamak için, transgenik hatlar genetik fonksiyonel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, yüksek maliyetler, zaman yoğun dönüşüm ve alt kültür süreçlerinin yanı sıra birçok mahsul türünde düşük dönüşüm verimlilikleri ile kısıtlanmakta ve alternatif metodolojilerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Protoplast bazlı geçici ekspresyon sistemleri, bitki moleküler araştırmalarında çok yönlü ve verimli bir alternatif olarak yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu sistemler, promotör aktivitesi, çevresel ipuçlarına yanıt olarak sinyal yolları, protein-protein veya protein-DNA etkileşimleri ve hücre altı lokalizasyonu³ ile ilgili araştırmaları kolaylaştırır. Protoplast geçici ekspresyon sistemlerinin kurulması sadece model bitkilerde ^4,5 değil, aynı zamanda şeker kamışı⁶, karanfil⁷, Phalaenopsis orkideleri⁸ ve patlıcan⁹ gibi ekonomik açıdan önemli mahsullerde de rapor edilmiştir. Ayrıca, bu sistemler Camellia oleifera¹⁰ve Populus trichocarpa¹¹ dahil olmak üzere odunsu bitkilerde başarıyla uygulanmıştır. Bununla birlikte, batırma kaynaklı hipoksi stresi altında yapraklı sebzeleri incelemek için protoplast sistemlerinin uygulanmasına yönelik protokoller sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışmada, bir lahana protoplast geçici ekspresyon sistemi kullanarak yapraklı sebzelerde hipoksi tepkilerini incelemekle ilgilenenler için entegre bir protokol geliştirilmiştir.

Hücresel düzeyde batırma ile indüklenen hipoksi tepkisini gerçekleştirmek için, hipoksik ortamları simüle etmek için önceki çalışmalarda çeşitli oksijen temizleme metodolojileri kullanılmıştır. Bunlar arasında EC-Oxyrase, OxyFluor, sodyum sülfit ve oksijen tüketen torbaların kullanımı yer alır. EC-Oksirase tipik olarak insan hücre hatlarında¹² ve Arabidopsis protoplastlarında ¹³ anaerobik tedavi için kullanılır. OxyFluor'un canlı hücreli floresan görüntüleme sırasında reaktif oksijen türlerinin neden olduğu fotobleaching'i azaltmada etkili olduğu bulunmuştur^14,15. Sodyum sülfit, nematodların¹⁶ anaerobik tedavisinde ve daha yakın zamanda pirinç protoplastlarında, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deneyleri¹⁷ gibi tekniklerle birlikte kullanılmıştır. Esas olarak anaerobik bakteri kültürü¹⁸ için kullanılan oksijen emici paketler, anaerobik koşullar¹⁹ altında mısır protoplastlarında ZmPORB1 promotörlerinin aktivasyonunu indüklemede de etkinlik göstermiştir.

Bu çalışma, lahana protoplast izolasyonu ve geçici ekspresyonu için sağlam bir boru hattı oluşturmayı amaçlamaktadır. Daha sonra, çeşitli oksijen ayarlama tedavilerinin etkinliği, çift lusiferaz tahlilleri kullanılarak anaerobik yanıt genlerinin promotör aktivitesi değerlendirilerek değerlendirildi. Bu çalışmada geliştirilen protokolün, Brassica sistemlerinde batırma veya hipoksi stresi ile ilgili gelecekteki araştırmalar için değerli olması beklenmektedir.

Protokol

Bu çalışmada iki ticari lahana (B. oleracea var. capitata) çeşidi kullanılmıştır: 'Fuyudori' ve '228'. Protokol iş akışının grafiksel bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Lahana fidelerinin hazırlanması

1. Ticari bitki substratı kullanarak 'Fuyudori' ve '228' lahana tohumlarını, 48 oyuklu tapa tepsilerinden (D 49 cm x G 28 cm x Y 5 cm) oluşan yuvarlak kare şekilli deliklere (D 4,5 cm x Y 4,5 cm) ekin. Tohumları yetiştirme ortamının yaklaşık 1 cm derinliğine gömün.
2. Lahana fidelerini 22 °C'de 16/8 saat aydınlık-karanlık döngüsü ile bir yetiştirme odasında yetiştirin. Işık fazı sırasında 100 μmol ^m-2·^s-1 (beyaz floresan tüp) ışık yoğunluğunu koruyun.
3. 2-3 haftalık büyümeden sonra, daha fazla mezofil protoplast izolasyonu için 2 yapraklı aşamada lahana fideleri kullanın.
   NOT: Lahana fidelerinin önerilen boyutu, ikinci gerçek yaprağın tamamen genişlediği, ancak üçüncü gerçek yaprağın genişlemediği ve uzunluğunun 1 cm'den kısa olduğu 2 yapraklı bir aşamadır (Şekil 2A). Lahana fidelerinin gelişim aşamalarını senkronize etmek için, 'Fuyudori' tohumlarının farklı büyüme oranları nedeniyle '228' tohumlarından yaklaşık 2 gün önce ekilmesi gerekir. Bu ayarlama, istenen aşamada lahana bitkileri arasında homojen büyüme ve olgunluk sağlar.

2. Lahana protoplastları izolasyonu

1. Her protoplast izolasyonundan önce 12.5 mL enzim çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın.
   1. 55 ° C'de 10 mM MES (pH 5.7) ve 0.6 M mannitol içeren bir çözeltiyi önceden ısıtın. % 1.5 Selülaz R10 ve% 0.75 Makrozyme R10 ekledikten sonra çözeltiyi 55 ° C'de 10 dakika ısıtmaya devam edin.
   2. Enzim çözeltisi oda sıcaklığına (25 ° C) soğuduktan sonra, 10 mM_CaCl2 ve% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Filtre: Hazırlanan enzim çözeltisini 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak 9 cm'lik bir Petri kabına sterilize edin.
      NOT: Çözeltinin önceden ısıtılması enzim çözünürlüğünü arttırır ve proteazı inaktive eder. Sindirim etkileri, farklı selülaz enzim türlerine bağlı olarak değişir. Selülaz R10 ve Makrozim R10 kombinasyonu lahana protoplast izolasyonu için uygundur.
2. Yeni genişletilmiş ikinci gerçek yaprakları beş ila sekiz lahana fidesinden toplayın ve keskin bir tıraş bıçağı kullanarak 0,5-1,0 mm'lik şeritler halinde dilimleyin. Yaprak şeritlerini hemen taze hazırlanmış enzim çözeltisine aktarın.
   NOT: Lahanadan sağlıklı ve belirlenmiş yaprakların uygun aşamada seçilmesi çok önemlidir. 2 yapraklı aşamada lahana fidelerinden yeni genişletilen ikinci gerçek yapraklar, en yüksek protoplast izolasyon verimliliğini sağlar. Aşırı olgun bitkiler, kotiledonlar veya yaşlı yapraklar protoplast izolasyonu için önerilmez. Beş ila on iki iyi genleşmiş gerçek yaprak, 12.5 mL enzim çözeltisinde başarılı bir şekilde lahana protoplastları verebilir. Protoplast izolasyonu için gereken yaprak sayısı, ihtiyaç duyulan istenen protoplast miktarına bağlıdır. Tipik olarak, beş ila sekiz yapraktan elde edilen protoplastlar, sonraki deneysel prosedürler için yeterlidir.
3. Karanlıkta 30 dakika boyunca vakum sızmasından sonra (Şekil 2B), lahana yaprağı şeritlerini enzim çözeltisine (Şekil 2C) karanlıkta oda sıcaklığında 4-16 saat daha daldırın.
   NOT: Enzim sindirim süresi lahana çeşitleri arasında farklılık gösterebilir ve spesifik genotipe göre optimize edilmelidir. Örneğin, 'Fuyudori', 'Fuyudori'nin daha kalın yaprakları nedeniyle '228'e (4 saat) kıyasla daha uzun bir sindirim süresi (16 saat) gerektirir.
4. Protoplast içeren çözeltiyi, 2 mM MES (pH 5.7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl ve 5 mM glikozdan oluşan eşit hacimde W5 çözeltisi ile seyreltin (hazırlık için Tablo 1'e bakınız), enzimatik sindirimi durdurmak için.
5. Protoplast süspansiyonunu hafifçe döndürerek veya bir orbital çalkalayıcı kullanarak serbest bırakın. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe süzün.
   NOT: İzole edilmiş protoplastlar 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçebilirken, sindirilmemiş bitki artıkları süzgeç tarafından tutulur ve daha sonra süspansiyondan çıkarılır. Hücre süzgeçleri yıkandıktan sonra tekrar kullanılabilir ve %75 etanol içinde saklanabilir, ancak kullanmadan önce artık etanolü çıkarmak için hücre süzgeçlerini W5 çözeltisi ile tamamen durulamak gerekir.
6. Protoplast çözeltisini 150 x g ile 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletlenmiş protoplastları, yaklaşık 1 mL·^s-1 akış hızında konik borunun duvarı boyunca 10 mL W5 çözeltisi ekleyerek nazikçe yıkayın. Tüpü 150 x g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin ve enzim çözeltisinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için bu yıkama prosedürünü tekrarlayın.
7. Protoplastları W5 solüsyonunda tekrar süspanse edin ve 30 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Buz inkübasyonundan sonra, tüm süpernatan çıkarılana kadar süpernatanı bir seferde 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.
8. Protoplastları, 4 mM MES (pH 5.7), 0.4 M mannitol ve 15 mM_MgCl2'den oluşan buzla soğutulmuş bir MMG çözeltisinde yeniden süspanse edin (hazırlık için Tablo 1'e bakınız).
9. Protoplast konsantrasyonunu bir hemositometre ile ölçün ve MMG çözeltisi kullanarak nihai konsantrasyonu 4 x 10⁵ protoplast · ^mL-1 olarak ayarlayın.

3. Protoplast transfeksiyonu

1. Toplam 10 μL plazmid (5-10 μg) (Ek Dosya 1) hacmini 100 μL protoplast (4 x 10⁴ protoplast) ile karıştırın ve 10 dakika buz üzerine koyun.
   NOT: Transfeksiyon dereceli plazmid saflaştırması için, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir plazmit kiti kullanılır. Yaklaşık 4 x 10⁴ protoplastlar tipik olarak bir çift lusiferaz raportör testinde kullanılır. Daha büyük ölçekli deneyler için, transfeksiyon için daha yüksek miktarda protoplast mevcuttur. Spesifik olarak, 10 μg plazmit ile transfekte edilen yaklaşık 2 x^{10 5} protoplast, %30 ila %40 arasında değişen kanıtlanmış bir transfeksiyon verimliliği sergiler.
2. Protoplast çözeltisine% 40 Polietilen Glikol 4000 (PEG4000), 0.1 M CaCl₂ ve 0.2 M mannitol içeren eşit hacimde (110 μL) taze hazırlanmış PEG çözeltisi (hazırlık için Tablo 1'e bakınız) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
3. Protoplast karışımını oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu sonlandırmak için 440 μL W5 çözeltisi ekleyin.
4. Transfekte edilen protoplastları 150 x g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti 750 μL oksijenle zenginleştirilmiş W5 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş protoplastları% 1 BSA ile önceden kaplanmış 6 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
   NOT: Hücre inkübasyonu için kullanılan W5 çözeltisi, 5 dakika boyunca bir hava taşına bağlı bir oksijen konsantratörü (~%90 oksijen) kullanılarak oksijenle köpürtülmelidir (Şekil 2D). Bu oksijenasyon işlemini takiben, W5 çözeltisindeki nihai çözünmüş oksijen konsantrasyonu 7.84 mg· ^L-1 ± 0.05 mg· ^L-1 ila 29.18 mg · ^L-1 ± 0.43 mg· ^L-1, çözünmüş oksijen ölçer ile ölçüldüğü gibi. Transfekte edilmiş protoplastın yeniden süspansiyonu için W5 çözeltisinin hacmi, kullanılan doku hücre kültürü plakasının tipine bağlıdır. 12 oyuklu veya 24 oyuklu hücre kültürü plakaları için, oyuklardaki daha derin derinlik nedeniyle inkübasyon sırasında hipoksi stresini azaltmak için W5 çözeltisinin hacminin azaltılması tavsiye edilir. BSA kaplaması için, kültür plakasının her bir oyuğuna 1 mL %1 BSA çözeltisi verildi ve bu çözeltinin kuyucukları 10 saniye kaplamasına izin verildi. BSA çözeltisi daha sonra her bir kuyucuktan atıldı ve kuyucuklar daha sonra W5 çözeltisi ile yeniden dolduruldu. Bu prosedür, BSA kullanarak geçici bir yapışmayan yüzey oluşturmayı ve sonraki deneysel adımlar sırasında protoplastların kültür plakasının plastik yüzeyine yapışmasını etkili bir şekilde önlemeyi amaçladı.

4. Lahana protoplastlarında hipoksi tedavisi

1. Protoplast transfeksiyonundan hemen sonra kimyasal veya fiziksel olarak indüklenen hipoksi tedavileri yapın.
   NOT: Protoplast transfeksiyonundan hemen sonra hipoksi tedavisinin uygulanması önerilir. Protoplastların uzun süreli inkübasyonu, sonraki hipoksi yanıtını azaltabilir.
   1. Lahana protoplastlarında kimyasal olarak indüklenen hipoksi için, W5 protoplast çözeltisine OxyFluor, EC-Oxyrase ve sodyum sülfit ekleyin.
      NOT: W5'te 0.6 birim · ^mL-1 EC-oksiraz, 0.6 birim · ^mL-1 OxyFluor ve 1 g · ^mL-1 sodyum sülfit kullanılması, BoADH1 ve BoSUS1L promotörü indükleyebilen test edilmiş koşullardı (Şekil 3A) incelenen iki lahana çeşidinde protoplast bütünlüğüne düşük hasarla.
   2. Oksijen tüketen torba kaynaklı hipoksi için, hipoksik bir ortam oluşturmak için 3,5 L'lik anaerobik bir kavanoza iki oksijen emici paket yerleştirin.
2. Hipoksi ile muamele edilen protoplastları 4 ° C'de 2 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyerek hasat edin. Toplanan protoplastları sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve sonraki tahliller için -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.

5. Çift lusiferaz testi

1. Çift lusiferaz raportör tahlilini, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.
   1. Lahana protoplastlarını 50 μL 1x pasif lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve 10 saniye boyunca girdap yapın.
   2. Bozulmuş protoplastları buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve süpernatanı 10.000 x g'da 10 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjlemeden sonra toplayın.
   3. Mikroplakanın her bir oyuğuna 20 μL hücre lizatı ekleyin. Kuyucuklara 100 μL Lusiferaz tahlil reaktifi II dağıtın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak ateşböceği lusiferaz aktivitesini ölçün.
   4. Her bir oyuka ticari olarak temin edilebilen 100 μL tahlil reaktifi ekleyin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak Renilla lusiferaz aktivitesini ölçün.

Sonuçlar

Bu çalışma, lahana protoplastlarını kullanan geçici bir ifade sistemini başarıyla geliştirdi (iş akışı için Şekil 1'e bakın). Protoplastlar, selülaz/maerozim sindirimi ve koyu vakum infiltrasyonu kullanılarak ticari lahana çeşitleri 'Fuyudori' ve '228'den uygun büyüklükteki 2 ila 3 haftalık lahana gerçek yapraklarından (Şekil 2A) izole edildi (Şekil 2B,C). İnkübasyon sırasında batık protoplastların yaşadığı hipoksik koşulları hafifletmek için, W5 çözeltisi, bir oksijen makinesine bağlı bir hava taşı fıskiyesi kullanılarak oksijenlendirildi (Şekil 2D). Bu işlem, W5 çözeltisindeki çözünmüş oksijen konsantrasyonunu 7.84 mg· ^L-1 ± 0.05 mg· ^L-1 ila 29.18 mg · ^L-1 ± 0.43 mg · 5 dakikalık oksijen köpürmesinden sonra ^L-1. İzolasyon işlemini takiben, protoplastların verimi 'Fuyudori' için 1.04 x 10⁷ ve bir gece boyunca sindirim süresinden sonra '228' için 4.00 x 10⁶ protoplast·^g-1 taze ağırlık idi (Şekil 2E). Daha sonra, GFP, PEG aracılı transfeksiyon yönteminin dönüşüm verimliliğini değerlendirmek için bir raportör gen olarak kullanıldı, bu da lahanada protoplast transfeksiyon verimliliğinin her iki çeşitte de @'ın üzerinde olduğunu gösterdi (Şekil 2F), böylece bu sistemin uygulanabilirliğini doğruladı.

Ayrıca, lahana anaerobik solunum yanıtı genlerinin, BoADH1p::Luc ve BoSUS1Lp::Luc vektörlerinin (Şekil 3A) promotör yapıları, çeşitli tedavilerin hipoksik indüksiyon etkilerini değerlendirmek için raportör olarak lahana protoplastlarına dahil edildi. Bu geçici ekspresyon modeli sistemine çeşitli oksijen ayarlama işlemleri de uygulanmıştır. Sonuçlar, sodyum sülfit hariç tüm oksijen süpürücü tedavilerin, lahana protoplastlarında başarılı bir şekilde hipoksi tepkisi oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Spesifik olarak, BoADH1'in promotör aktivitesi, EC-Oksirase ve OxyFluor ile tedaviyi takiben kontrole kıyasla sırasıyla yaklaşık 2.6 kat ve 3.2 kat artmıştır ve özellikle oksijen emici paket tedavisi ile 7.0 kattan fazla artmıştır (Şekil 3B). Benzer şekilde, BoSUS1L promotör aktivitesi, EC-Oksirase ve OxyFluor tedavisi ile sırasıyla yaklaşık 1.7 kat ve 1.8 kat artarken, oksijen emici paket tedavisi 5.6 katın üzerinde önemli bir artışa neden oldu (Şekil 3B). Bu sonuçlar, oksijen emici paketinin, bu lahana protoplast deney sisteminde hipoksik bir ortam yaratmada üstün etkinlik gösterdiğini göstermektedir.

Şekil 1: Protoplast izolasyon iş akışının grafiksel gösterimi. Bu şekil, protoplastların lahana yaprağı dokusundan izole edilmesinde yer alan adım adım süreci göstermektedir. İş akışı, prosedürün net bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için görsel olarak tasvir edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Lahananın yaprak dokusundan protoplast izolasyonu. (A) Ticari lahana çeşitleri 'Fuyudori' ve '228'in önerilen büyüme aşamasında görünümü gösterilmiştir. 2 yapraklı aşamadaki lahanaların ikinci, tamamen genişlemiş gerçek yaprakları (ok ucu ile gösterilir) protoplast izolasyonu için seçilir. Ölçek çubuğu: 2 cm. (B) Lahana yaprağı şeritlerinin vakumlu sızma işlemi için bir vakum pompası ve desikatör kullanılır ve enzimatik sindirimden önce 30 dakikalık bir sızma gerçekleştirilir. (C) Enzimatik sindirim sırasında lahana yaprağı şeritlerinin durumu tasvir edilmiştir. Yaprak dokusunun tam sindirimi toplam 4-16 saat gerektirir. Ölçek çubuğu: 3 cm. (D) Fotoğraflar, W5 çözeltisindeki çözünmüş oksijen konsantrasyonunu artırmak için bir hava taşına bağlı bir oksijen konsantratörünün kullanımını göstermektedir. Ölçek çubuğu: 5 cm. (E) Hem 'Fuyudori' hem de '228' lahana çeşitlerinden gram taze ağırlık (FW) başına 4.00 x 10^6'dan fazla mezofil protoplastı elde edildi ve mikroskop altında gözlendi. Ölçek çubuğu: 200 μm. (F) Yapısal olarak ifade edilen bir GFP raportörü kullanılarak her iki lahana genotipinden protoplastların transfeksiyon verimliliğinin @'ın üzerinde olduğu gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Oksijen eksikliği olan koşullar altında lahana protoplastlarının hipoksi tepkisi. (A) Hipoksi yanıtı gen yapıları, BoADH1 ve BoSUS1L destekleyicileri, 'Fuyudori' lahana protoplastlarındaki hipoksi tepkisini değerlendirmek için raportör olarak kullanılır. (B) Toplam 5 μg raportör plazmit, 4 saat boyunca hipoksi tedavilerine maruz kalmadan önce oksijen kabarcıklı bir W5 çözeltisi içinde inkübe edilen 'Fuyudori' lahana protoplastlarına transfekte edilir. W5 çözeltisine EC-oksiraz (0.6 birim · ^mL-1), OxyFluor (0.6 birim · ^mL-1) ve sodyum sülfit (1 g · ^mL-1) eklenerek inkübasyon sırasında oksijen seviyeleri azaltılır. Oksijen emici paket işlemi, 3,5 L'lik anaerobik bir kavanoza iki oksijen emici torba yerleştirilerek gerçekleştirilir. "CK" grubu, herhangi bir hipoksi tedavisi olmayan kontrol grubunu temsil eder. Tedaviden sonra, protoplastlar ikili lusiferaz testi için hasat edilir. Her değer, n = 4 ile ± SD'nin ortalamasını temsil eder. Farklı harfler, LSD post-hoc testi ile tek yönlü bir ANOVA'ya dayalı olarak önemli farklılıkları (P < 0.05) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Enzim çözeltisi, W5 çözeltisi ve MMG çözeltisinin hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Protoplast transfeksiyonu için plazmid detayları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, iki ticari lahana çeşidinden protoplast izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yöntem sunar. Bu yöntemin etkinliği öncelikle iki kritik kalite kontrol parametresi ile değerlendirilir: canlı protoplastların verimi ve protoplast transfeksiyonunun verimliliği. Bu protokolün uygulanması, 4.00 x 10⁶ protoplast·^g-1· Her iki lahana çeşidinden mezofil dokusunun FW'si (Şekil 2E,F). Bu verim, patlıcan, karanfil, şeker kamışı ve Camellia oleifera dahil olmak üzere diğer türlerde bildirilenlerle karşılaştırılabilir, burada protoplast verimleri 2,5 x 10⁶ ila 1,4 x 10⁷ protoplast ·^g-1· FW 6,7,9,17. Bu sonuçlar, protokolün B. oleracea ile çeşitli genetik geçmişlerde potansiyel olarak uygulanabilirliğini göstermektedir.

Protokolün başarısı birkaç kritik faktöre bağlıdır. En önemlisi, sağlıklı lahana fidelerinden elde edilen belirtilen yaprakların uygun bir büyüme aşamasında kullanılmasıdır (Şekil 2A). Daha yaşlı veya sağlıksız bitkilerin kullanılması düşük kaliteli protoplastlara neden olabilir. Yaprak dokusunu dikkatlice 0,5-1,0 mm'lik şeritler halinde kesmek ve keskin olmayan bir bıçakla ezmekten kaçınmak da çok önemlidir. 4-16 saat arasında süren enzim sindirim süreci bir diğer kritik adımdır. 4 saatten kısa sindirim süreleri eksik sindirime neden olabilirken, 16 saati aşan sindirim süreleri hücresel stres riski taşır. Özellikle, 'Fuyudori' gibi daha kalın yapraklı genotipler, protoplast verimini en üst düzeye çıkarmak için uzun sindirim sürelerinden yararlanabilir. Buna karşılık, '228' tam sindirim için sadece 4 saat gerektiriyordu. Ek olarak, çok çeşitli sindirim süreleri, deneysel programlamada daha fazla esneklik sağlayabilir. Örneğin, 4 saatlik bir sindirim, protoplast izolasyonunun ve müteakip geçici testlerin tek bir gün içinde tamamlanmasına izin verir. Tersine, 16 saatlik bir sindirim, akşamları enzim sindiriminin başlatılmasına izin verir ve ertesi gün sonraki adımların tamamlanmasını sağlar, bu da bu protokolü uygularken rahatlığı artırabilir. Ayrıca, kırılganlıkları ve mekanik strese karşı duyarlılıkları nedeniyle protoplastların tüm protoplast izolasyon süreci boyunca nazikçe ele alınması çok önemlidir.

Taşkın stresini temsil eden anaerobik koşulları simüle etmek için bu protokol, hipoksik ortamlar oluşturmak için yaygın oksijen tutucu maddeler ve oksijen tüketen torbalar kullandı. Sistemin etkinliğini arttırmak için, W5 çözeltisini oksijenlendirmek için bir oksijen makinesi kullanılır (Şekil 2D), bu da tedavi öncesi inkübasyon süreleri boyunca lahana protoplastlarındaki arka plan hipoksik yanıt sinyallerini azaltmayı amaçlar. 5 dakikalık bir oksijenasyon işlemi, çözünmüş oksijen seviyesini 7.84 mg· ^L-1 ± 0.05 mg· ^L-1 ila 29.18 mg · ^L-1 ± 0.43 mg· ^L-1, hipoksik koşulların hafifletilmesinde belirgin bir etkiye işaret eder. Bu çalışmada kullanılan oksijen süpürücü yöntemler arasında, oksijen emici paketler, iki anaerobik yanıt çekirdek geninde en yüksek promotör aktivitesini indükleyerek üstün performans sergilemiştir (Şekil 3). Ayrıca, bu yöntem, oksijen tutucu ajanların her bir hücre kültürü plakasına ayrı ayrı uygulanmasının aksine, tek bir anaerobik kavanozda oksijen tüketen torbaların kullanılması yoluyla birden fazla numunenin aynı anda işlenmesine izin vererek, ölçeklenebilirlik gibi ek bir avantaj sunar. Özetle, oksijen emici paketler, hipoksik koşullar altında lahana protoplastlarının tepkisini değerlendirmek için uygun uygun ve etkili bir platform sağlar.

Bu protokol çeşitli avantajlar gösterse de, sınırlamalarını, özellikle lahana protoplastlarının nispeten mütevazı transfeksiyon verimliliğini kabul etmek önemlidir. Bu verimlilik, Arabidopsis⁵ için rapor edilen% 90'a ulaşmasa da, yine de promotör aktivitesi üzerine başarılı sonraki çalışmalar için yeterli olduğunu kanıtlamaktadır (Şekil 3), bu da bu sistemde fonksiyonel analiz için önemli bir potansiyele işaret etmektedir.

Lahananın önemli bir sebze mahsulü olarak küresel önemi göz önüne alındığında, bu protokolün hipoksi tedavileri ve genetik analiz teknikleri ile entegrasyonu, sel koşulları altında lahanadaki düzenleyici mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi edinme sözü vermektedir. Bu tür içgörüler, aşırı hava koşulları ve artan sel olayları karşısında kritik bir ihtiyacı ele alarak sele dayanıklı lahana çeşitlerinin geliştirilmesini potansiyel olarak hızlandırabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2- (N-morfolino) etansülfonik Asit (MES)	PhytoTech Labs	M825	Enzim çözeltisi hazırlama için
228 lahana tohumu	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japonya)
50 mL Konik Tüp	SPL Yaşam Bilimleri	50050	Enzim çözeltisi hazırlama için
6 oyuklu doku kültürü plakası	Alpha Plus	16106	Protoplast inkübasyonu için
70 μ m hücreli süzgeç	Sorfa	SCS701	Protoplast filtrasyonu için
9 cm Petri kabı	Alpha Plus	16001	Enzimatik sindirim için
Anaerobik kavanoz	HIMEDIA	Anaerobik Kavanoz 3,5 L	Hipoksi tedavisi için
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A7906	W5 çözeltisi hazırlama ve kültür plakası kaplaması için
Kalsiyum klorür	JTbaker	131301	W5 çözeltisi ve PEG çözeltisi hazırlama için
Selülaz R10	Yakult		Enzim çözeltisi hazırlama için
Desiccator	Tarsons	402030	Vakum sızması için
D-Glucose	Bioshop	GLU501	W5 çözeltisinin hazırlanması için
Çözünmüş oksijen ölçer	Thermo Scientific	Orion Star A223	Oksijen ölçümü için
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	Enzim çözeltisi, PEG çözeltisi ve MMG çözeltisi hazırlama için
Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi	Promega	E1960	Çift lusiferaz raportör testi için
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	Hipoksi tedavisi için
Fuyudori lahana tohumları	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japonya)
Yüksek Hızlı soğutmalı santrifüj	Hitachi	CR21GIII	Protoplast hasadı için
Makrozyme R10	Yakult		Enzim çözeltisi hazırlama için
Magnezyum klorür	Alfa Aesar	12315	MMG çözeltisi hazırlama için
Mikrosantrifüj	Hitachi	CT15RE	Protoplast hasadı için
Mikroplaka	Greiner	655075	Çift lusiferaz raportör tahlili için
Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar	SpectraMax Mini	Çift lusiferaz raportör testi
Millex 0.22 & mu; m şırınga filtresi	Merck	SLGP033RS	Enzim çözeltisi hazırlama için
Yağsız Vakum Pompası	Rocker	Vakum sızması için	Rocker 300
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	Hipoksi tedavisi için
Oksijen emici paketi	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	Hipoksi tedavisi için
Oksijen konsantratörü	SON DERECE MÜKEMMEL	AII-X	W5 çözeltisinde oksijen köpürmesi için
Bitki substratı	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substratı	Lahana fidelerinin hazırlanması için
Plazmid Midi Kiti	QIAGEN	12145	Transfeksiyon dereceli plazmit DNA'nın saflaştırılması için
Polietilen Glikol 4000	Fluka	81240	Protoplast transfeksiyonu için
Potasyum klorür	J.T.Baker	304001	W5 çözeltisinin hazırlanması için
Jrazor blade	Gillette		Lahana yaprağı şeritlerinin hazırlanması için
Sodyum klorür		Bioshop SOD002	W5 çözeltisinin hazırlanması için
Sodyum sülfit	Sigma-Aldrich	S0505	Hipoksi tedavisi için
Su Banyosu	Yihder	BU-240D	Enzim çözeltisi hazırlama için