Yöntem makalesi

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

931 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67508

⸱

2 Mayıs 2025

 ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Özet

Hematopoetik kök hücreler, uzun süreli kendini yenileme yeteneğine ve çeşitli olgun kan hücrelerine farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC'ler) kanserli mutasyonların birikmesi normal farklılaşmayı engelleyebilir, anormal proliferasyona neden olabilir ve sonuçta lösemogeneze yol açabilir. Kanserli mutasyonları tanımlamak ve / veya değerlendirmek için, HSPC'lerin anormal proliferatif yeteneği için gerekli olan bir model gen Trp53'ü araştırmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre ettik. Spesifik olarak, Cas9 farelerinden HSPC'ler için zenginleştirilmiş kemik iliği hücreleri hasat edildi ve daha sonra HSPC'lerde genetik değişiklikler sağlamak için bir veya birkaç aday geni hedefleyen tek kılavuzlu RNA'lar (sgRNA'lar) ile viral transfeksiyona tabi tutuldu. Daha sonra, transfekte edilmiş HSPC'lerin proliferatif kapasitesini araştırmak için bir CCK-8 testi yapıldı. sgRNA hedefleme verimliliği, Ayrışma testi ile Indels İzleme ile doğrulandı. Tanımlanan bu genler lösemogenezde çok önemli roller oynayabilir ve potansiyel terapötik hedefler olarak hizmet edebilir.

Giriş

Yaşam boyunca tüm kan hücresi soylarını üreten hematopoez, hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) adı verilen küçük bir popülasyon tarafından sürdürülür. HSC'ler kendilerini yenileyerek kendilerini korurlar ve tamamen farklılaşmış fonksiyonel kan hücrelerine yol açan çeşitli kararlı progenitörler üretirler 1,2,3. Bu süreç sıkı bir şekilde düzenlenmiştir. Bununla birlikte, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC'ler) kanserli mutasyonların birikmesi normal farklılaşmayı engeller, anormal proliferatif yetenek kazandırır ve sonuçta HSPC'leri lösemi başlatan hücrelere (LIC'ler) dönüştürür4,5,6,7. Lösemojenik mutasyonların tanımlanması ve doğrulanması, kanser araştırmaları için hala büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi geliştirilmiş ve Cas9 nükleaz ve tek kılavuzlu RNA'dan (sgRNA) oluşan verimli ve hassas bir gen düzenleme yöntemi haline gelmiştir8. sgRNA, Cas9-sgRNA kompleksini, Cas9 nükleazının çift iplikli kırılmaları indüklediği RNA-DNA tamamlayıcılığı yoluyla belirli bir genomik konuma yönlendirir. Kırık DNA, ya homoloji şablonlarının varlığında hassas homolojiye yönelik onarım ya da uyumsuzluğa eğilimli, homolog olmayan uç birleştirme yoluyla endojen gen düzenleme mekanizmalarına tabi tutulur, bu da küçük eklemelere veya delesyonlarayol açar 9. Şu anda, CRISPR / Cas9 sistemi, hedeflenen gen düzenleme ve transkripsiyonel düzenleme için güçlü bir araç haline gelmiştir10.

Burada, HSPC'lerde genetik değişiklikler yapmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullandık ve daha sonra tanıtılan mutasyonların HSPC'lerin anormal proliferasyonu için kritik olup olmadığını araştırmak için Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testini gerçekleştirdik. Spesifik olarak, HSPC'ler için zenginleştirilmiş kemik iliği hücreleri, Cas9 farelerinden toplandı ve ardından aday genleri hedefleyen sgRNA'lar ile viral transfeksiyon yapıldı. Daha sonra, mutasyonların transfekte edilmiş HSPC'lere artmış bir proliferatif yetenek kazandırıp kazandırmadığını belirlemek için CCK-8 testi yapıldı. Son olarak, CRISPR/Cas9 tarafından tanıtılan mutasyonlar, Ayrışma Yoluyla Indellerin İzlenmesi (TIDE)11 veya hedeflenen derin dizi12 ile doğrulandı. Bu protokol, kanserli mutasyonları ve lösemi için potansiyel terapötik hedefleri değerlendirmek için güçlü bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol kapsamında yapılan tüm hayvan deneyleri, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Aday genleri hedef alan sgRNA plazmitlerinin yapımı (4 - 5 gün)

  1. Çevrimiçi sgRNA tasarım araçlarını kullanarak hedefleme sgRNA'sını tasarlayın. Hedef genomik DNA dizisini çevrimiçi bir sgRNA tasarım aracına (örneğin, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) girin. Uygun sgRNA hedeflerini seçin ve gerekli oligonükleotidleri sipariş edin.
  2. sgRNA oligo eklerini hazırlayın. Her sgRNA (adım 1.1) için tasarlanan oligoların üst ve alt ipliklerini 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. sgRNA oligolarını fosforile etmek ve tavlamak için karışımları Tablo 1'e göre hazırlayın. Aşağıdaki termodöngü parametrelerini kullanın: 30 dakika boyunca 37 °C; 5 dakika boyunca 95 °C; 5 °C'de 25 °C'ye kadar rampa min-1.
  3. 1:200'lük bir seyreltik oran elde etmek için 199 μL oda sıcaklığında ddH2O'ya 1 μL fosforile edilmiş ve tavlanmış oligo ekleyin.
  4. Vektör plazmidini doğrusallaştırın.
    1. Referans verilen omurga vektörünü kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), restriksiyon enzimi Esp3I (BsmBI) kullanarak vektör plazmidini sindirin. Reaksiyonları Tablo 1'e göre ayarlayın ve 55 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Aynı tüpe 0,5 μL Karides Alkalin Fosfataz (rSAP) ekleyin ve doğrusal plazmitin otomatik konjugasyon olasılığını azaltmak için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    3. Başarılı doğrusallaştırma olup olmadığını kontrol edin. Elektroforez için doğrusallaştırılmış plazmitleri ve kesilmemiş plazmitleri %0.8-1 (a/h) agaroz jeli üzerine yükleyin.
    4. Doğrusallaştırılmış plazmiti bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın, 20 μL ddH2O içinde elüte edin ve DNA konsantrasyonunu ölçün.
  5. Tablo 1'e göre her bir sgRNA için ligasyon reaksiyonlarını ayarlayarak sgRNA oligolarını vektör plazmidine klonlayın. 16 °C'de 4 saat inkübe edin.
  6. Dönüşüm için, 1.5. adımdan itibaren 10 μL ürünü 50 μL buz gibi yetkin Stbl3 hücrelerine ekleyin, karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, 42 °C'de 90 saniye boyunca ısı şoku verin ve ardından hemen 2 dakika boyunca buza geri koyun. Aynı tüpe 200 μL antibiyotik içermeyen LB ortamı ekleyin, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 220 rpm'de çalkalayın ve ardından 100 μg / mL ampisilin içeren bir LB plakasına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  7. Ertesi gün, koloni büyümesi için plakaları inceleyin. Her plakadan 6-8 koloni seçin ve koloni PCR kullanarak sgRNA'nın doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin. Pozitif kolonileri seçin ve tek tek kolonileri steril bir pipet ucu kullanarak 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamına aşılayın. Kültürü gece boyunca 37 °C'de inkübe edin ve çalkalayın.
  8. Bir mini plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak plazmit DNA'yı kültürlerden izole edin. 6-nt kılavuz dizisinin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için U20 promotöründen sıralayın.

2. Lentiviral paketleme (2 - 3 gün)

  1. 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h) penisilin-streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş DMEM ortamında kültür HEK 293T hücreleri.
  2. Eski ortamı Petri kabından aspire ederek HEK293T hücrelerini geçirin ve kabı 3 mL PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın. 10 cm'lik bir tabağa 1 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 1 dakika inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için tabağa 3 mL ılık DMEM ortamı ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 800 × g'da döndürün. Süpernatanı atın, hücreleri 5 mL ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri gerektiği gibi yeni kaplara yerleştirin.
    NOT: Lentivirüs üretimi için 10'dan az geçişli HEK 293T hücreleri kullanın.
  3. Transfeksiyondan on altı ila 24 saat önce, HEK293T hücreleri, tabak başına 2-4 × 106 hücre yoğunluğunda 10 cm'lik tabaklara tohumlayın. Kullanılan DMEM'in antibiyotik içermediğinden emin olun.
  4. Transfeksiyon gününde hücrelerin% 70-80 oranında birleştiğinden emin olun. 10 cm'lik tabak başına 10-15 μg plazmiti dönüştürün ve plazmitin molar oranını PEI'ye 1: 3 tutun. Karışım 1 ve Karışım 2'yi Tablo 2'ye göre transfeksiyon için hazırlayın.
  5. Karışım 2'yi 5 dakika bekletin. Karışım 2'yi Karışım 1'e ekleyin (ekleme sırasını tersine çevirmemeye dikkat edin), iyice karıştırın ve ardından 15-20 dakika bekletin.
  6. Kompleksi (adım 2.5) hücrelere ekleyin, karıştırmak için tabağı hafifçe çalkalayın ve 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Altı ila 8 saat sonra, ortamı DMEM ortamıyla (% 10 FBS içeren) değiştirin.
  7. Lentiviral transfeksiyonun başlamasından iki gün sonra, lentivirüs süpernatantlarını bulaşıklardan toplayın. 4.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve 0,45 μm'lik bir mikrofiltrasyon membranından süzün. Lentivirüsü dağıtın ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Toplanan lentivirüs gerektiği gibi konsantre edilebilir. Tekrarlanan donma ve çözülme nedeniyle viral titreleri azaltmaktan kaçının.

3. Kemik iliği hücre ekstraksiyonu ve kültürü (12 - 13 gün)

NOT: Tüm fare hatları saf bir C57BL / 6 genetik arka planında tutulmuştur. LSL-Cas9 fareleri (T002249), LSL-Cas9/+ oluşturmak için Mx1-Cre fareleri13 ile çaprazlandı; Mx1-Cre/+ fareler. Burada, Mx1-Cre / + 'dan kemik iliği hücrelerini topladık; LSL-Cas9/+ fareler ve yavruları.

  1. Cre rekombinaz ekspresyonunu indüklemek için, farelere (8-12 haftalık) intraperitoneal olarak 150 μL Poliinosinik-polisitidlik (1.5 mg / mL) 1. ve 3. günde enjekte edin. 6. günde, farelere intraperitoneal olarak 5-florourasil (5-FU, 150 mg / kg) enjekte edin.
    NOT: Mx1-Cre transgenik fareler, indüklenebilir Mx1 promotörü13'ün kontrolü altında Cre rekombinazı eksprese etmek üzere tasarlanmıştır. Poliinosinik-polisitidilin intraperitoneal enjeksiyonu, Mx1 promotörünü etkili bir şekilde aktive edebilir ve Cre rekombinaz ekspresyonunu14 indükleyebilir. 5-FU enjeksiyonu, kemik iliğindeki çoğalan hücreleri tüketmek için kullanılır, böylece HSC'lerin hücre döngüsüne girmesini indükler ve göreceli bir HSPCbolluğu ile sonuçlanır 15. 5-FU tedavisinden sonra fare başına yaklaşık 2-4 × 106 kemik iliği hücresi toplanabilir.
  2. 11. günde, fareleri CO2 boğulması ile kurban edin. Farelerin uyluk kemiğini ve tibiasını alın, kemik iliği boşluğunu 1 mL steril şırınga kullanarak% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve Gavrilescu ve ark.16 tarafından tarif edildiği gibi kemik iliği hücrelerini toplayın.
    NOT: Kemik iliği hücrelerinin toplanması sırasında steriliteyi korumak için tibia ve fibula farelerden çıkarılır çıkarılmaz kemikleri laminer bir akış başlığına aktarın.
  3. Kemik iliği hücrelerini tek hücrelere dağıtmak için yukarı ve aşağı (30-50x) pipetleyin, ardından hücre karışımını 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve iyice karıştırmak için girdap yapın.
  4. 40 μL eritrosit lizis tamponuna 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve eritrositlerin parçalanmasını sağlamak için 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun. 50 μL tripan mavisi çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve canlı hücreleri sayın.
  5. Hücreleri 800 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
  6. Hücreleri, Tablo 3'te tarif edildiği gibi kemik iliği ön stimülasyon ortamında 1-2 × 106 hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik tabaklarda, 10 mL / tabakta tohumlayın ve 24 saat inkübe edin.

4. Kemik iliği hücrelerinin lentiviral transfeksiyonu (2-3 gün)

  1. Ertesi gün, önceden uyarılmış plakalardan hücreleri toplayın. Plakayı% 2 FBS içeren 5 -10 mL PBS ile kuvvetlice durulayın. Adım 3.4'te açıklandığı gibi tripan mavisi ekleyerek canlı hücreleri sayın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Virüs spinfection solüsyonunu Tablo 4'te anlatıldığı gibi hazırlayın.
  3. Süpernatanı atın ve hücreleri taze hazırlanmış spinfection solüsyonunda (∼106 hücre / mL) yeniden süspanse edin. Askıya alınmış hücreleri, oyuk başına 4 mL olmak üzere 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 6 oyuklu plakayı parafilm ile kapatın ve plakayı 32 ° C'de 90 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjleyin.
  4. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir pipetle nazikçe yeniden süspanse edin (ancak ortamı değiştirmeyin), ardından plakayı bir inkübatörde 4-6 saat inkübe edin.
  5. İlk transfeksiyon için, her bir oyuktan (~ 3 mL) mümkün olduğunca fazla süpernatan ortamı dikkatlice aspire edin ve eşit hacimde kemik iliği ön stimülasyon ortamı ekleyin. İşlem sırasında bazı hücreler yanlışlıkla aspire edilirse, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri az miktarda ön stimülasyon ortamı ile yeniden süspanse edin ve ardından tekrar kuyuya ekleyin.
  6. İkincil transfeksiyon için, ertesi gün, her bir oyuktan 2-3 mL ortam çıkarın ve Tablo 4'te tarif edildiği gibi uygun miktarlarda HEPES ve polibren ile birlikte eşit hacimde taze çözülmüş retroviral stok çözeltisi ekleyin. Plakayı 1.500 × g'da 90 dakika, 37 °C'de santrifüjleyin.
  7. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin ve plakayı inkübatörde 4-6 saat inkübe etmeye devam edin.
  8. Ortamı adım 4.5'teki gibi değiştirin. 24 saat kuluçkaya yatırın.

5. İn vitro CCK-8 testi yapın (3-4 gün)

  1. Kemik iliği hücrelerini toplamak için kuyuları kuvvetlice durulayın. Maksimum hücre sayısını elde etmek için plakayı% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın. Hücreleri 70 μm'lik bir elekten süzün ve adım 3.4'te açıklandığı gibi tripan mavisi ile canlı hücreleri sayın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
  3. % 10 FBS ve% 10 FBS ve mIL-3, mIL-6 (10 ng / mL), mSCF (100 ng / mL) içeren DMEM ile hücreleri 1 × 105 hücre / mL'ye yeniden süspanse edin. ~ 0.5-1 × 106 hücre alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve genomik DNA ekstraksiyonu için hücre peletini -80 ° C'de saklayın.
  4. Hücreleri, oyuk başına 1 × 104 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara ekleyin. Her grup için altı çoğaltma kuyusu yapın. Hücrelerin ekildiği kuyucukların etrafındaki bir kuyu çemberine 100 μL steril PBS ekleyin. 0, 24, 48 ve 72 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Ortamı, ilgili zaman noktasında 96 oyuklu plakadan dikkatlice aspire edin. Kuyucuklara 1/10 hacim CCK-8 içeren 110 μL ortam ekleyin. Boş bir grup ayarlayın (yalnızca orta ve CCK-8, hücre yok). Kuluçka makinesinde 1 saat inkübe edin.
  6. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak 450 nm absorbans değerini okuyun.
  7. Deneysel verileri analiz etmek için istatistiksel yazılım kullanın ve deneysel verileri ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak ifade edin. Bağımsız örneklemler t-testini kullanarak iki grup arasındaki farkları analiz edin, P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bir farkı gösterir.

6. Gen düzenleme doğrulaması (5 - 7 gün)

  1. Üreticinin tavsiyelerine göre bir genomik DNA saflaştırma kiti kullanarak genomik DNA'yı (adım 5.3) çıkarın.
  2. sgRNA kesim bölgesi etrafında ortalanmış 200 ila 500 bp bölgesini büyüten tasarım primerleri (Tablo 5).
  3. Sanger dizilimi için, karışımı PCR için Tablo 6'daki gibi hazırlayın. Hedef gen fragmanlarını bir termosikler kullanarak aşağıdaki gibi çoğaltın: 5 dakika için 95 °C, 40 döngü (30 saniye için 95 °C, 30 saniye için 58 °C, 9 saniye için 72 °C), 10 dakika için 72 °C, 4 °C ∞.
    NOT: Gen düzenleme, yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak da doğrulanabilir ve PCR ürününün NGS için bir saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılması gerekir.
  4. TIDE web sitesinde (http://tide.nki.nl) Sanger sıralama sonuçlarını analiz edin. Hem deney hem de kontrol gruplarından gelen sgRNA dizisini ve dizileme sonuçlarını bu çevrimiçi araca girerek sgRNA'nın düzenleme verimliliğini hesaplayın.
    NOT: CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17 kullanarak NGS sonuçlarını analiz edin. Bir referans dizisi ve bir sgRNA dizisi ile birlikte derin bir dizileme deneyinden fastq veya fastq.gz biçiminde eşleştirilmiş uçlu okumaları (iki dosya) veya tek uçlu okumaları (tek dosya) girin. Yazılım, hedeflenen mutajenezi değerlendirecek ve ölçecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Trp53 nakavtının fare HSPC'lerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisi
Burada, bu protokolü göstermek için örnek olarak Trp53 knockout kullandık. Trp53 nakavtının fare HSPC'lerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisini araştırmak için, 5-FU tedavisinden sonra HSPC'ler için zenginleştirilmiş Cas9 eksprese eden kemik iliği hücrelerine Trp53 sgRNA'yı sokmak için lentiviral transfeksiyon kullandık. Eşzamanlı olarak, ilgisiz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CRISPR/Cas9 teknolojisi, kullanıcı dostu doğası ve yüksek verimliliği nedeniyle biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve gen fonksiyonu taraması18, hastalık modellemesi19, immünoterapi20 ve canlı hücre etiketleme ve görüntüleme21 gibi uygulamaları kolaylaştırmaktadır. Son çalışmalar, lösemi 22,23,24 dahil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırmayı tamamlamak için ortak hizmetlerini kullandığı için Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın Genç Bilim İnsanları Fonu (No. 31701280'dan J. Zhang'a) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μ m mikrofiltrasyon membranıSartoriu16533K-1
1.5 mL EP tüpLABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm çanakCorning430167
15 mL TüpLABLEADLXG1500
1 mL steril şırınga
2x Doğru Taq Master Mix (boya artı)KoloniPCR için Doğru Biyoloji AG11010
50 mL TüpLABLEADLXG5000
5-FluorourasilSigmaF6627-1
6 oyuklu plakaCorning3516
70 & mikro; m hücreli elekFalcon®352350
96 kuyulu plakalarCorning3599
ACK Lizis TamponuLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpisilinSolarbioA8180
Thermofisheriçin Uygulamalı Biyosistemler Termal Döngüleyiciler
SantrifüjeppendorfSantrifüj 5810R
CO2 İnkübatörTermo BİLİMSEL
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı-5ZYMOD4014
Dneasy Kan & Tissure KitiQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Fetal Sığır SerumuExCellFSP500
GraphPad Prizma 9.3
HEK-293TATCC; Virginia, ABD
HEPE'lerSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963omurga vektörü
LSL-Cas9 farelerModel Hayvan
Araştırma Merkezi
NANJING ÜNİVERSİTESİ 
mikroplaka absorbans spektrofotometresiBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100xSolarbioP1400
pMD2.G plazmidAddgene12259
polibrenBeyotimeC0351
Poliinosinik-polisitidlik asit sodyum tuzuSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR Arıtma Kiti ve nbsp;Qiagen28104
RekombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RekombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RekombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Düzenli agarozBIOWESTBY-R0100
Karides Alkalin Fosfataz (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Mikro SpektrofotometreMOLEKÜLER CIHAZLAR
Stbl3 Yetkili hücrelerBioMedBC108-01 
T4 Polinükleotid KinazNEBM0201L
T4-LigazTakara2011B
TIANprep Hızlı Mini Plazmid KitiTIANGENDP105-03
Tripan Mavisi çözeltisiLABLEADC0040-100ml
Tripsin-EDTAGibco25200072
TriptonOKSOİDLP0042
WEHI-CMNanjing Fuksai Biyoteknoloji &
MAYA ÖZÜOXOIDLP0021
PCR Hücre Sayma Kiti-8 Bimake B34304T002249CBP50079

Kaynaklar

  1. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  4. Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml. Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).
  5. Chopra, M., Bohlander, S. K. The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).
  6. Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all. Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).
  7. González-García, S., et al. IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763-763 (2003).
  10. Wang, S. -W., et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 21 (1), (2022).
  11. Zhao, C., et al. HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control. Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).
  12. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  13. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  14. Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell. 62 (1), 51-61 (1990).
  15. Randall, T. D., Weissman, I. L. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).
  16. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).
  17. Pinello, L., et al. Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso. Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).
  18. Cai, P., et al. A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis. Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).
  19. Ng, S. R., et al. CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).
  20. Crowther, M. D., et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1. Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).
  21. Ma, H., et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).
  22. Szlachta, K., et al. CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response. Nat Commun. 9 (1), 4275(2018).
  23. Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions. Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).
  24. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).
  25. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hematopoetik K k H crelerGen NakavtH cre Say m KitiAnormal ProliferasyonL kemogenezKemik li i zolasyonuTrp53 NakavtTIDE Analizi

İlgili makaleler