Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Özet

Burada, yakınlık ligasyon testi (PLA) kullanarak onkogen kaynaklı transkripsiyon-replikasyon çatışmalarını (TRC'ler) tespit etmek için hassas ve spesifik bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, PCNA ve fosfo-CTD RNAPII'yi hedefleyen spesifik antikorlardan yararlanarak, RNA polimeraz II transkripsiyonu ve DNA replikasyon mekanizması arasındaki TRC prevalansının değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Hem DNA replikasyonu hem de RNA transkripsiyonu, genomik DNA'yı şablon olarak kullanır ve bu süreçlerin uzamsal ve zamansal olarak ayrılmasını gerektirir. Transkripsiyon-replikasyon çatışmaları (TRC'ler) olarak adlandırılan replikasyon ve transkripsiyon mekanizması arasındaki çatışmalar, kanser gelişiminde kritik bir faktör olan genom stabilitesi için önemli bir risk oluşturmaktadır. Bu çarpışmaları düzenleyen çeşitli faktörler tanımlanmış olsa da, doğrudan görselleştirme ve net yorumlama için sınırlı araçlar nedeniyle birincil nedenleri belirlemek zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, PCNA'ya özgü antikorlardan ve RNA polimeraz II'nin fosforile CTD'sinden yararlanan bir yakınlık ligasyon testi (PLA) kullanarak TRC'leri doğrudan görselleştiriyoruz. Bu yaklaşım, RNA polimeraz II'nin aracılık ettiği replikasyon ve transkripsiyon süreçleri arasında TRC'lerin hassas ölçümüne izin verir. Yöntem, bu antikorlara kovalent olarak konjuge edilmiş DNA primerleri yoluyla daha da geliştirilir, floresan problar kullanılarak PCR amplifikasyonu ile birleştirilir ve endojen TRC'leri tespit etmek için oldukça hassas ve spesifik bir araç sağlar. Floresan mikroskobu, kanserle ilişkili genom kararsızlık mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araç sunarak bu çatışmaların görselleştirilmesini sağlar. Bu teknik, doğrudan TRC görselleştirmesindeki boşluğu ele alarak, hücrelerde genom kararsızlığına neden olan altta yatan süreçlerin daha kapsamlı bir analizine ve anlaşılmasına olanak tanır.

Giriş

Genom, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere temel biyolojik süreçler için bir şablon görevi görür. Sağlıklı hücrelerde, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyon mekanizması tipik olarak işbirliği yapar ve uzamsal ve zamansal olarak ayrılır 1,2,3,4. Bununla birlikte, onkogen aşırı ekspresyonu gibi patolojik koşullar altında, bu uyumlu işbirliği bozulabilir.

Onkogenler genellikle yüksek transkripsiyon seviyelerine neden olur ve transkripsiyon ve replikasyon mekanizması aras....

Protokol

1. Lentivirüs üretimi ve hedef hücre hattına transdüksiyon

1. Lentivirus üretimi²⁴
   1. Yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM; tam ortam) 10 cm'lik plaka başına 3 ×^{10 6} hücreli tohum paketleme hücreleri. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 18-20 saat daha büyütün.
   2. İki adet 1.5 mL tüpte, sırasıyla 9.2 μg psPAX2, 2.8 μg pMD2.G içeren 500 μL Opti-MEM (indirgenmiş serum ortamı) içinde toplam 24 μg plazmit DNA'nın bir DNA karışımını hazırlayın.
      NOT: Endotoksinler transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde azalt....

Sonuçlar

γH2AX, DNA hasarı için bir biyobelirteç görevi görür. KRAS'ın (G12D) aşırı ekspresyonu, Western blot analizinde artmış γH2AX sinyali ile kanıtlandığı gibi, bu hücrelerde genomik stabiliteyi bozar (Şekil 2A). Ek olarak, vektör kontrollerine kıyasla KRAS (G12D) eksprese eden hücrelerde yoğunlaştırılmış S9.6 nokta lekesi sinyali (Şekil 2B), onkojenik KRAS ekspresyonunun DNA kırılması oluşumuna katkıda bulunabilecek anormal R-döngülerinin birikimine yol açtığını gös.......

Tartışma

RNAPII transkripsiyon makinesi, DNA replikasyon çatalının^{ilerlemesine 26,27} engel oluşturarak, özellikle kanser hücrelerinde^28,29 TRC'leri ve DNA hasarını teşvik edebilir. TRC'leri düzenleyen proteinlerin deşifre edilmesi ve ayrıntılı mekanizmaların anlaşılması, bu zararlı olayların nasıl meydana geldiğini anlamamıza yardımcı olabilir ve gelecekte yeni terapötik yaklaşıml.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Berraklık Western ECL Substrat	Bio-Rad	1705061
Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Yeşil	Sigma	DUO92014
BAYRAK antikoru	Millipore	F7425
gama H2AX antikoru	Hücre Sinyali	25955
Glikojen, moleküler biyoloji sınıfı	ThermoFisher	R0561
Resim J	NIH	https://imagej.net/ij/
nitroselüloz membranlar	Amersham	10600004
PCNA antikoru	Hücre Sinyali	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Ekle	12259
Proteinaz K, rekombinant, PCR sınıfı	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII antikoru	SCBT	sc-56767
S9.6 antikoru	Aktif motif	65683
UV çapraz bağlayıcılar	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000