Yöntem makalesi

Serebral Kan Akışı Düzenlemesini İn Vivo Çalışmak için Eşleştirilmiş Sarnıç Magna Nanoenjeksiyon ve Lazer Benek Kontrast Görüntüleme Testi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

8 Temmuz 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

Bu makalede

Özet

Serebral kan akışının düzenlenmesini in vivo olarak incelemek için, geleneksel farmakolojik yöntemler invazivdir ve genellikle kafatasına, duraya ve leptomeninglere zarar verir. Bu çalışmada, nanoenjektör kılavuzluğunda intrasisternal magna (ICM) enjeksiyonunu lazer benek kontrast görüntüleme ile birleştiren, kafatasının ve leptomeninglerin bütünlüğünü koruyan minimal invaziv bir teknik geliştirdik.

Özet

Serebral kan akışı (CBF) düzenlemesi, bilişsel işlevlerin sürdürülmesi için çok önemlidir, ancak altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu düzenlemede yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin araştırılması, serebral kan akış dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlarken beyin omurilik sıvısına (BOS) hassas ilaç verilmesine izin veren farmakolojik bir yaklaşım gerektirir. Bu yazıda, nanoenjektör bazlı intrasisternal magna (ICM) enjeksiyonu ile lazer benek kontrast görüntülemeyi birleştirerek in vivo serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için bir yöntem sunuyoruz.

Nanolitre enjektör bazlı ICM enjeksiyon tekniği, nL/dk ile μL/dk arasında dinamik bir aralıkta hassas ilaç dağıtımına izin verir. Deneylerimizde, bu yaklaşım enjeksiyon hacmini geleneksel 5-10 μL'den sadece 1.5 μL'ye önemli ölçüde düşürdü ve böylece normal kafa içi basıncını korudu. Lazer benek kontrast görüntüleme ile birleştirildiğinde, ICM enjeksiyonları öncesinde, sırasında ve sonrasında serebral kan akışı (CBF) dinamiklerini gerçek zamanlı olarak izleyebildik.

Bu yöntemi kullanarak, üç farklı vazodilatörün ICM enjeksiyonuna yanıt olarak CBF değişikliklerini değerlendirdik: (S)-3,5-Dihidroksifenilglisin (DHPG), asetilkolin ve adenosin. Her üç vazodilatör de bazal CBF'yi arttırırken, CBF dinamikleri üzerinde farklı etkileri oldu. Örneğin, adenozinin etkisi geçiciydi, oysa DHPG ve asetilkolin uzun süreli etkiler üretti. Eşsiz avantajları ile bu yöntem, in vivo olarak kemirgen CBF regülasyonunu incelemek için araç kutusuna değerli bir katkı sağlar.

Giriş

Serebral kan akışı (CBF), normalbilişsel işlevlerin sürdürülmesi için gerekli olan metabolik atıkları uzaklaştırırken beyne sürekli oksijen ve besin kaynağı sağlar. Homeostatik koşullar altında, CBF, otoregülasyon 3,4,5 olarak bilinen bir süreç olan perfüzyon basıncındaki dalgalanmalara rağmen nispeten stabil kalır. Otoregülasyona ek olarak, lokal CBF, nörovasküler eşleşme6,7 olarak adlandırılan bir fenomen olan yakındaki nöronal aktiviteye yanıt olarak dinamik olarak ayarlanabilir. Hem otoregülasyon hem de nörovasküler eşleşme, topluca nörovasküler ünite hücreleri olarak bilinen bir grup hücre (endotel hücreleri, duvar hücreleri, astrositler, fibroblastlar ve nöronlar) tarafından düzenlenir 4,7. Bununla birlikte, bu farklı hücre tiplerinin CBF'yi modüle etmek için koordine ettiği hücresel ve moleküler mekanizmalar hala büyük ölçüde bilinmemektedir.

CBF regülasyonunu araştırma yöntemleri genellikle in vitro ve in vivo modellere ayrılır. İn vitro çalışmalar, genellikle akut beyin dilimleri kullanılarak, nöronların ve glial hücrelerin bireysel kan damarlarının genişlemesini veya daralmasını nasıl düzenlediğini incelemek için tipik olarak elektrofizyolojik veya farmakolojik tekniklerle birleştirilir 8,9,10. İn vitro modellerin birincil sınırlaması, in vivo koşulları, özellikle fizyolojik kan basıncının olmaması durumunda çoğalmamalarıdır. CBF düzenlemesini incelemek için in vivo modeller, makro ölçekten mikro ölçekli yaklaşımlara kadar uzanır. Pozitron emisyon tomografisi (PET) ve fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) gibi makro ölçekli teknikler noninvazivdir ancak düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir 11,12,13,14.

CBF'yi in vivo incelemek için birincil mikro ölçekli yöntem, yüksek mekansal-zamansal çözünürlüksağlayan iki fotonlu görüntülemedir 9,15,16,17,18. Bununla birlikte, bu teknik kafatasının ve dura materyalin çıkarılmasını gerektirir ve farmakolojik manipülasyon ile birleştirildiğinde daha da invaziv hale gelir, potansiyel olarak kanamaya neden olur, beyin dokusuna zarar verir ve kafa içi basıncı değiştirir19. Bu nedenle, CBF'yi in vivo olarak manipüle etmek ve izlemek için belirli kriterleri karşılayan bir yönteme sahip olmak çok önemlidir: noninvaziv olmalı (kafatasının, leptomeninglerin ve damarların bütünlüğünü korumalı), yüksek mekansal-zamansal çözünürlük sağlamalı ve CBF'nin hassas farmakolojik manipülasyonuna izin vermelidir. Bu yazıda, nanolitre enjektör tabanlı intrasisternal magna (ICM) enjeksiyonu ile lazer benek kontrast görüntülemeyi birleştiren ve tüm bu gereksinimleri karşılayan yeni bir yöntem sunuyoruz.

CBF regülasyonunu incelemek için geleneksel farmakolojik yaklaşımlar genellikle lokal ilaç dağıtımı için beyin dokusunu açığa çıkarmak için kafatasının ve meninkslerin çıkarılmasını içerir. Buna karşılık, ICM enjeksiyonu, ilaçları doğrudan beyin omurilik sıvısına (BOS) uygulayarak bu hasarı önler, bu da onların BOS'un doğal akışını takip etmelerine ve böylece fizyolojik koşulları daha iyi taklit etmelerine olanak tanır. ICM enjeksiyonu ile ilgili bir zorluk, genellikle farelerde 5 μL veya daha fazla olmak üzere büyük hacimlerde sıvı gerektirmesidir20. Yetişkin farelerde toplam BOS hacminin yaklaşık 36 μL olduğu göz önüne alındığında, 5 μL enjekte etmek kafa içi basıncı artırabilir ve CBF dinamiklerini değiştirebilir. Cam pipetler kullanan nanoenjektör sistemimiz, enjeksiyon bölgesinde BOS sızıntısına neden olmadan hacim ve hız üzerinde hassas kontrol ile sıvı sağlar.

Çalışmamızda üretan ve alfa-kloraloz, serebral kan akışının daha stabil bir fizyolojik temelini sağladıkları ve nörovasküler eşleşmeyi (NVC) izofluran veya ketamin / ksilazin (KX) gibi yaygın olarak kullanılan alternatiflerden daha iyi korudukları için kullanılmıştır. Bu sistemi kullanarak, (S) -3,5-Dihidroksifenilglisin (DHPG), asetilkolin ve adenosin olmak üzere üç farklı vazodilatörü test ettik ve CBF dinamiklerinin in vivo olarak hassas bir şekilde manipüle edilmesine ve izlenmesine izin verdiğini doğruladık.

Protokol

Bu protokol, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'na bağlı kalmıştır. Deneyler için 10-14 haftalık altı erkek C57BL / 6 faresi kullanıldı. Cerrahi prosedürler Şekil 1A'da özetlenmiştir.

1. Ameliyat hazırlığı

  1. Stereotaksik çerçeveye bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ameliyattan önce 37 °C ~ 20 dakikaya ısıtın. Anestezi için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde taze üretan (750 mg / kg) ve kloraloz (50 mg / kg) hazırlayın.
    NOT: PBS'de alfa-kloraloz çözeltisinin hazırlanması için, çözeltiyi 40 ° C'lik bir su banyosunda ısıttık ve tamamen eriyene kadar her 10-15 dakikada bir vorteksledik. Hem üretan hem de alfa-kloraloz çözeltileri, kullanımdan önce 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanılarak filtrelendi.
  2. Ameliyattan önce makas, forseps, mikro iğne tutucular, kanama durdurucular, pamuklu çubuklar, silecekler ve dikişler dahil olmak üzere gerekli tüm cerrahi aletleri toplayın. Aletleri otoklavlayarak sterilize edin (60 dakika boyunca 15 psi'de 121 °C).
  3. Cam kılcal borular hazırlayın (dış çap 1,14 mm, iç çap 0,53 mm, 88,9 mm uzunluk). Enjeksiyon için cam pipetler oluşturmak için bir cam çektirme kullanın21. Tercih edilen pipet direnci yaklaşık 80 - 100 MΩ'dur. Cam pipetleri sterilize edin ve temiz bir kapta saklayın.
  4. Uygun enjeksiyon hacmine (25 nL - 4.5 μL) ve hıza (6 nL/s - 644 nL/s) sahip bir nanoenjektör hazırlayın.
  5. Yapay beyin omurilik sıvısında (aCSF) aşağıdaki vazodilatör solüsyonları hazırlayın: (S) 5 mM'de -3,5-dihidroksifenilglisin (DHPG), 0.5 mM'de asetilkolin ve 10 mM'de adenosin.
  6. Ameliyat sırasında ağrının giderilmesi için meloksikam (4.0 mg / kg) hazırlayın. Yeterli analjezi sağlamak için ameliyattan yaklaşık 30 dakika önce farelere deri altından meloksikam uygulayın.

2. Cerrahi prosedür

  1. Altı C57BL / 6 erkek fareyi (10-14 haftalık) tartın ve intraperitoneal üretan (750 mg / kg) ve kloraloz (50 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezi yapın. Anesteziyi sürdürmek için fareleri% 1 izofluran içeren bir anestezi odasına yerleştirin. Bu işlem yaklaşık olarak 40 dk ile 1 saat arasında sürmektedir.
    NOT: İzofluran, anestezitizasyonun indüksiyonunu hızlandırabilir.
  2. Fareleri anestezi odasından dikkatlice çıkarın ve ayak parmağı kıstırma refleksinin olmadığını doğrulayarak anestezi derinliğini değerlendirin. Pamuklu bir bez kullanarak, kürkü çıkarmak için kafatasının üstüne ve boynun arkasına tüy dökücü krem sürün.
  3. Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün ve işlem boyunca gerektiği gibi tekrar uygulayın. Deney sırasında düzenli olarak izleyin ve gerektiğinde ek merhem uygulayın.
  4. Fareyi stereotaksik çerçeve içinde yüzüstü bir yönde konumlandırın ve 1 ila 2 L/dk akış hızında medikal hava ile yeterli havalandırma sağlayın. Düzgün sabitleme için fareyi kulak çubuklarıyla sabitleyin, ardından vücutla 120°'lik bir açı oluşturmak için başınızı hafifçe aşağı doğru eğin, böylece cisterna magna'yı açığa çıkarın.
    NOT: İzofluran, idame aşamasında değil, yalnızca anestezi indüksiyonu için kullanılır.
  5. Yeterli cilt sterilizasyonunu sağlamak için en az üç alternatif %70 alkol ve cerrahi ovma (ör., klorheksidin veya povidon-iyot) kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin.
  6. Cerrahi mikroskop altında oksipital tepeyi bulun. Üstteki cildi cımbızla kaldırın ve 1 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Pamuklu çubuklarla herhangi bir kanamayı kontrol edin.
  7. Boyun kaslarını açığa çıkarın ve forseps kullanarak orta hat boyunca dikkatlice kesin ve ayırın. Kasları nazikçe geri çekmek ve cisterna magna'nın dış sınırını oluşturan dura mater'i ortaya çıkarmak için her iki elinizde birer tane olmak üzere iki kavisli forseps kullanın.
  8. Cisterna magna'nın en iyi şekilde maruz kalması için vücutla 150°'lik bir açı oluşturmak için baş pozisyonunu aşağı doğru eğerek ayarlayın.
  9. Sagital sütür boyunca hem lambda hem de bregma noktalarını kapsayan 5 mm'lik bir kesi yapın. İki kavisli forseps kullanarak cildi nazikçe kenara çekin ve kafatasının yüzeyini tuzlu suyla temizleyin. Açıkta kalan kafatasında saç kalmadığından emin olun.
  10. Temizledikten sonra, bölgedeki nemi korumak için pamuklu çubuklar kullanarak açıkta kalan kafatasına ~ 1 mm kalınlığında bir ultrason jeli tabakası uygulayın. Ultrason jeli hava kabarcıkları içerebileceğinden, görüntülemeden önce tüm hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olun.
  11. Fareyi lazer benekli kontrast görüntüleme sisteminin merceğinin altına yerleştirin. Sistemi ve beraberindeki yazılımı açın. Fare beyninin görüntüleme alanı içinde ortalandığından emin olun, ardından görüntüleme için doğru odağı elde etmek için Otomatik Odaklama işlevini kullanın. Gerekirse, cımbız kullanarak görüntüleme alanında kalan tüyleri veya hava kabarcıklarını nazikçe çıkarın.

3. Nanoenjeksiyon kurulumu

  1. Pompayı stereotaksik manipülatör koluna sabitleyin ve kabloyu kontrolöre bağlayın. Denetleyiciyi açın ve hedef pompayı seçin. Kontrol panelinde, DIRECTION öğesini INFUSE olarak ayarlayın. Hızı dakikada 2μl'ye ve hacmi 4,5 μl'ye ayarlayın.
    NOT: Nanoenjeksiyon sistemi iki ana bileşenden oluşur: enjeksiyon pompası ve kontrolör. Her kontrolör aynı anda iki pompayı çalıştırabilir. ICM enjeksiyonu için sadece bir pompa kullanıyoruz.
  2. INFUSE tamamlandıktan sonra, kaptan bir cam pipet çıkarın ve 34 G MicroFil esnek iğne veya benzer türde bir iğne kullanarak renksiz, kokusuz mineral yağ ile doldurun. Cam pipetin tamamının yağ ile doldurulduğundan emin olun.
  3. Pompanın pensetini sökün, cam pipeti yerleştirin ve ardından penseti sıkın. Cam pipetin içinde hava kabarcığı olmadığından emin olun.
  4. PARA ÇEKME için kontrol panelindeki YÖNLENDİRME'yi değiştirin. Hızı 2 μ L/dk'ya ve ses seviyesini 4,5 μ L'ye ayarlayın.
  5. Pipeti hazırlanan çözeltiye nazikçe sokmak ve istenen hacmi geri çekmek için stereotaksik kolu hareket ettirin.

4. Cisterna magna'ya vazodilatörlerin enjeksiyonu ve CBF'nin izlenmesi

  1. Pompanın stereotaksik manipülatör koluna güvenli bir şekilde sabitlendiğinden emin olun. Stereotaksik manipülatör kolunun açısını ön-arka düzlemde 45°'ye ayarlayın.
  2. Diseksiyon mikroskobu altında kavisli cımbız kullanarak, cisterna magna'yı dikkatlice ortaya çıkarın. Kanı çıkarmak için alanı tuzlu suyla temizleyin. Cam pipeti cisterna magna'nın dura materinin yakınına yerleştirmek için stereotaksik mikromanipülatörü kullanın.
  3. Cam pipet duraya dokunduğunda, beyincik veya medullaya herhangi bir penetrasyondan kaçınarak cisterna magna'nın merkezine geçmek için hafifçe manevra yapın. Cımbızı bırakmadan önce cam pipetin ucunun 1-2 mm derinliğe kadar yerleştirildiğinden emin olun.
    NOT: Cam pipetin cisterna magna'ya nüfuz etme derinliğini izlemek için dijital stereotaksik bir çerçeve gereklidir.
  4. Kontrol panelindeki YÖN'ü DEMİLMEK OLARAK değiştirin. Enjeksiyon hızını 300 nL/dk'ya ve hacmi 1,5 μL'ye ayarlayın.
  5. Lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) yazılımını başlatın ve kan damarlarının en net görüntüsünü elde etmek için odağı ayarlayın. Görüş alanında saç veya hava kabarcığı olmadığından emin olun.
  6. LSCI kontrol panelinde görüntüleme aralığını 5 s'ye ayarlayın. Taban çizgisi CBF'yi yaklaşık 10 dakika boyunca kaydedin ve taban çizgisinin sabit kalmasını sağlayın. Taban çizgisinde dalgalanmalar varsa, kararlılık elde edilene kadar daha uzun süre kayda devam edin.
  7. 10 dakikalık kararlı temel kayıttan sonra, nanoenjeksiyonu başlatın ve LSCI kayıt sisteminde enjeksiyon başlangıç zamanını not edin. Enjeksiyon tamamlandığında, bitiş zamanını işaretleyin ve 20 dakika veya daha uzun bir süre daha kayda devam edin. Deneyi tamamladıktan sonra, fareleri PBS ile transkardiyak perfüzyon yapın ve histolojik analiz için beyin dokularını toplayın.

Sonuçlar

Ameliyatı tamamladıktan sonra, fareyi dijital bir okuma ile stereotaksik bir çerçeveye sabitledik (Şekil 1A,B). Serebral kan akımı (CBF) ölçümü için, insizyonu takiben kafatasının üzerindeki cildi dikkatlice ayırdık ve kafatası yüzeyindeki nemi korumak için şeffaf bir ultrason jeli uyguladık (Şekil 1C). İntrasisternal magna (ICM) enjeksiyonunu kolaylaştırmak için, cisterna magna'yı ortaya çıkarmak için oksipital krest etrafındaki boyun kaslarını inceledik. Bundan sonra, hedef çözeltiyi cam pipet ile geri çektik ve cam pipeti cisterna magna'nın zarlarına 1-2 mm derinliğe kadar nüfuz etmesi için yönlendirmek için mikromanipülatörü kullandık (Şekil 1D,E). Stereotaksik kol, yerleştirmeye yardımcı olmak için 45° C'lik bir açıyla eğildi.

Daha sonra, üç farklı vazodilatörüne yanıt olarak CBF dinamik değişikliklerini inceledik: (S)-3,5-dihidroksifenilglisin (DHPG), asetilkolin ve adenosin 22,23,24,25. Başlangıçta, 5 dakika boyunca 300 nL / dk hızında her bir vazodilatörün 1.5 μL'sini enjekte etmeden önce 10 dakikalık bir taban çizgisi kaydettik. Enjeksiyondan sonra 20 dakikalık ek bir veri kaydettik. Sonuçlarımız, her üç vazodilatörün de farklı dinamiklere sahip olmasına rağmen CBF'yi arttırdığını gösterdi. DHPG, CBF'de keskin bir artışa neden oldu, ardından enjeksiyondan sonra kademeli bir düşüş izledi (Şekil 2A, B). Buna karşılık, asetilkolin, kayıt periyodu boyunca CBF'de kademeli bir artışa neden oldu (Şekil 2C, D). Adenozin ayrıca CBF'de geçici bir artış üretti, bu da enjeksiyondan yaklaşık 15-20 dakika sonra başlangıç seviyesine geri döndü (Şekil 2E, F).

figure-results-1
Şekil 1: Ameliyat prosedürlerinin özeti. (A) Nanoenjeksiyon + LSCI modeli için adım adım ana cerrahi prosedürler. (B) Kombine nanoenjeksiyon + LSCI sistemini gösteren şemalar. Nanoenjektör, stereotaksik kol üzerine stabil bir şekilde sabitlenir ve kol, cisterna magna'daki atlanto-oksipital membranın penetrasyonunu kolaylaştırmak için 45o kadar eğilir. (C) LSCI sistemi altında fare kafatasının yukarıdan aşağıya görünümü. Kafatası ultrason jeli ile kaplıdır. (D) Sarnıç magnasına nüfuz eden cam pipeti gösteren arkadan görünüm. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için cam pipet Evans mavisi ile dolduruldu. Penetrasyon mesafesinin tam olarak ölçülebilmesi için bu deney için dijital stereotaksik çerçeveyi kullanın. (E) Sarnıç magnasında cam pipet ucunun yerini gösteren şemalar. Sarnıç magna enjeksiyonunu kolaylaştırmak için farenin kafası 30o kadar eğildi. Kısaltma: LCSI = lazer benek kontrast görüntüleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Vazodilatörlerin nanoenjeksiyonundan sonra artan serebral kan akışı. (A) DHPG enjeksiyonundan önce ve sonra serebral kan akışı değişikliklerini gösteren temsili görüntüler. Kan hızı renk kodludur. Mavi düşük hızı, kırmızı ise yüksek hızı temsil eder. (B) DHPG enjeksiyonu için zaman penceresini gösteren kırmızı bir çizgi ile işaretlenmiş bölgedeki gerçek zamanlı kan akışı. (C) ACh enjeksiyonundan önce ve sonra serebral kan akışı değişikliklerini gösteren temsili görüntüler. Kan hızı renk kodludur. Mavi ve kırmızı, sırasıyla düşük ve yüksek hızları gösterir. (D) ACh enjeksiyonu için zaman penceresini gösteren kırmızı çizgi ile işaretlenmiş bölgedeki gerçek zamanlı kan akışı. (E) Adenozin enjeksiyonundan önce ve sonra serebral kan akışı değişikliklerini gösteren temsili görüntüler. Kan hızı renk kodludur. Mavi ve kırmızı, sırasıyla düşük ve yüksek hızları gösterir. (F) Adenozin enjeksiyonu için zaman penceresini gösteren kırmızı çizgi ile işaretlenmiş bölgedeki gerçek zamanlı kan akışı. Kısaltmalar: DHPG = (S)-3,5-Dihidroksifenilglisin; ACh = asetilkolin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Serebral kan akımı (CBF) regülasyonunu araştırmak için in vivo olarak hassas sarnıç magna nanoenjeksiyonu lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) ile birleştirerek yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, CBF'nin gerçek zamanlı izlenmesini sağlarken serebral vasküler reaktivitenin değerlendirilmesini kolaylaştırırken, beyin omurilik sıvısına (BOS) doğru ilaç verilmesine izin verir.

Farmakolojik manipülasyon ve ilaç verme teknikleri, CBF ve serebral vasküler reaktiviteyi in vivo olarak incelemek için kritik öneme sahiptir. Vazodilatörlerin veya daraltıcıların kullanımı gibi ilaç uygulaması için geleneksel yöntemler genellikle kafatasının çıkarılmasını gerektirir, bu da leptomeninglere ve hatta beyin parankimine zarar verebilir 9,10,18. Bu invaziv teknikler, özellikle vasküler hasara ve kanamaya neden olarak beyin mikro çevresini bozabilir ve böylece gerçek fizyolojik koşulları taklit edemez. Buna karşılık, yöntemimiz dört önemli avantaj sunmaktadır.

İlk olarak, ilaç uygulaması için yaklaşımımız noninvazivdir ve fizyolojik koşulları korur. İkincisi, klasik ICM enjeksiyon yöntemleri tipik olarak şırıngalara veya kanüllere dayanır, bu da uçların büyük boyutu nedeniyle ilaçların veya izlerin sızmasına ve BOS'a yol açabilir. Bu geleneksel yöntemler genellikle büyük miktarlarda ilaç veya eser gerektirir - genellikle 5 μL veya daha fazla, bu da kafa içi basıncını değiştirebilir. Buna karşılık, nanoenjektör güdümlü ICM enjeksiyonumuz yalnızca 1,5 μL veya daha az küçük bir hacim gerektirir. Ek olarak, enjeksiyon hızı 1 nL/sn ile 100 nL/sn arasında geniş bir aralıkta hassas bir şekilde kontrol edilebilir. Tipik olarak 5 nL/s (300 nL/dk) hız kullanırız, çünkü bu oran kafa içi basıncını etkilemez. Üçüncüsü, beyin parankimine pipet güdümlü ilaç enjeksiyonlarından veya kortikal yüzeye ilaç perfüzyonundan farklı olarak, sarnıç magna enjeksiyonu bazlı ilaç dağıtımımız, fizyolojik koşulları yakından taklit ederek BOS'un doğal akışını takip eder. Son olarak, yöntemimiz kafatasının ve meninkslerin bütünlüğünü koruduğundan, aynı fare grubu üzerinde farklı zaman noktalarında ölçümler yapabiliriz, bu da boylamsal karşılaştırmalara izin verir - diğer ilaç uygulama yöntemleriyle mümkün olmayan bir şey. Sağkalım çalışmaları ve boylamsal karşılaştırmalar için, uygun cilt hazırlığı, steril alet ve malzemelerin kullanımı ve kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uyum dahil olmak üzere katı aseptik teknikler izlenmelidir. Yara iyileşmesi için iki haftalık bir iyileşme sürecine izin verilmelidir.

Anestezi yöntemi CBF'yi önemli ölçüde etkileyebilir. Örneğin, ketamin-ksilazin anestezisi CBF'yi başlangıç seviyelerinin %50'nin üzerinde yükseltebilirken, izofluran bazal CBF seviyesini iki katına çıkarabilir. Deneylerimizde, sahada yaygın olarak kullanılan CBF'nin fizyolojik seviyelerinin korunmasına yardımcı olan kardiyovasküler sistem üzerindeki minimal etkileri nedeniyle üretan ve kloralozu tercih ettik26,27. Ek olarak, tekrarlanan kan gazı ölçümünün non-invaziv olması için intraarteriyel kanülasyonu atladık, ancak bu tür prosedürler yöntemimiz26 ile birleştirilebilir.

Yaklaşımımız iki sistemi entegre eder: nanoenjeksiyon tabanlı ICM enjeksiyon sistemi28 ve lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI) sistemi29. Prosedürü başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için deneyciler her iki sistemde de eğitilmelidir. LSCI sistemi, farenin kafasının üzerindeki tüm alanı kapladığından, kolun 45o kadar eğilmesi yalnızca ICM enjeksiyonunu kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda iki sistem arasında uyumluluk sağlar. Bu kurulum, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir.

Nanoenjektör kılavuzlu ICM enjeksiyonunu kullanmaya yeni başlayanlar için, bir elinizle kasları cımbızla ayırma koordinasyonunda ustalaşırken, diğer elinizle cam pipeti yönlendirmek için mikromanipülatörü hareket ettirirken kapsamlı bir uygulama gereklidir. İşlem sırasında optimum görselleştirme için iyi bir lazer ışığı ve mafsallı kol stereo mikroskobu gereklidir.

Bu yöntemi kullanarak, DHPG, asetilkolin ve adenosin gibi klasik vazodilatörlerin CBF'yi nasıl etkilediğini değerlendirdik. Beklendiği gibi, her üç vazodilatör de CBF'yi arttırdı; Ancak, farklı dinamikleri ortaya çıkardılar. DHPG, CBF'de keskin bir artışa neden olurken, bunu yavaş bir bozunma izledi, asetilkolin ise kademeli bir artışa neden oldu. Buna karşılık, adenozin CBF'de sadece geçici bir artış üretti.

Bu yöntem aynı zamanda sıçan modellerine de uygulanabilir olmalıdır. Bununla birlikte, sıçan kafatası kalınlığının yaklaşık 0,5-1 mm olduğu göz önüne alındığında, lazer benek kontrast görüntüleme için inceltilmesi gerekecektir. Ek olarak, mevcut yöntem kafaya sabitlenmiş uyanık fareler için uyarlanabilirken, deneyler sırasında hayvanların hareketini en aza indirmek için kapsamlı bir eğitim gerektirir. Yöntemimizi göstermek için sınırlı sayıda fare kullandık; Bu nedenle, çalışmamız istatistiksel olarak sınırlıdır ve bulgularımızdan geniş sonuçlar çıkarırken dikkatli olunmalıdır.

Tutarlı ve güvenilir CBF ölçümleri için, deneycilerin vücut ısısı, kan basıncı ve CO2 seviyeleri gibi diğer fizyolojik parametrelerin kapsamlı fizyolojik değerlendirmede kritik bir rol oynadığını ve gelecekteki çalışmalarda dikkatlice düşünülmesi gerektiğini kabul etmeleri önemlidir. Özetle, farelerde CBF regülasyonunu incelemek için yeni bir in vivo yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım kesin ve minimal invazivdir, bu da onu ilaca bağlı CBF dinamiklerini araştırmak için çok uygun hale getirir.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibeleri tarafından desteklenmiştir (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(RS)-3,5-DihidroksifenilglisinTocrisKedisi. No. 0342
Asetilkolin klorürSigmaA6625-25G
AdenozinSigmaA9251-25G
Alkollü Çubuk% 70 İzopropil AlkolVitrex Medical A/S520213
AmScope SM-8T Serisi Mafsallı Kol Zoom Stereo MikroskopAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Şeffaf Ultrason İletim JeliAquasonicGelPLI 03-50
Dijital Fare Stereotaksik AletlerÇalmak51730D
Etil alkolSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 AydınlatıcıDolan-Jenner endüstrileriDC950H
Cam değiştirme 1.14 MMDünya Hassas Aletler504949
Kimtech Science Hassas Mendiller Doku SilecekleriKimberly Clark Professional5511
Lazer Benek Kontrast Görüntüleyicimoor aletleriMOORFLPI-2
Lasik Göz Mızrağı (Vaka Başına 100) hospeqBV40815
MICROFIL ESNEK İĞNEDünya Hassas AletlerMF34G-5
Mineral yağSigmaM5904
Fare ısıtma yastığıFisher scientific50-195-4000
Nair Kakao Yağı Saç Çıkarıcı LosyonAmazonASIN ‏ : ‎
NANOLITRE 2020 ENJEKTÖRDünya Hassas AletleriNANOLITER2020
P-2000 mikropipet çektirmeSutter AletiP-2000
Puritan® Swablar, Pamuk Kafa, Ahşap Şaft,Puritan Medical806-WC
Steril Oküler KayganlaştırıcıMedi-Vet11897
ÜretanSigmaU2500
Vetbond doku yapıştırıcısıDünya Hassas AletleriVETBOND&alfa;
-KloralozSigma23120
B000GCW5CS

Kaynaklar

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Cisterna Magna EnjeksiyonuLazer Spekel GörüntülemeNörovasküler KenetlenmeMikroglial RegülasyonVazodilatör EnjeksiyonuIn Vivo AnalizStereotaksik CerrahiKemirgen Beyin Görüntülemeİntrasisternal Enjeksiyon
Serebral Kan Akışı Düzenlemesini İn Vivo Çalışmak için Eşleştirilmiş Sarnıç Magna Nanoenjeksiyon ve Lazer Benek Kontrast Görüntüleme Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.