Yöntem makalesi

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 Ocak 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan genomundaki fonksiyonel dizilerin kapsamı, biyolojide çok önemli ancak tartışılan bir konudur. Her ne kadar yüksek verimli ters genetik ekranlar bunu araştırmada ilerleme kaydetmiş olsa da, kapsamlarını genellikle bilinen genomik elementlerle sınırlarlar ve spesifik olmayan etkiler ortaya çıkarabilirler. Bu, genom işlevselliğinin daha derin ve tarafsız bir şekilde anlaşılmasını sağlayan yeni fonksiyonel genomik araçlara olan acil ihtiyacın altını çizmektedir. Bu protokol, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tanımlamak için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Ekleme Tabanlı Ekranı (InSET) tanıtır. InSET, yan dizileri tespit etmek ve ölçmek için kullanılan yeni nesil dizileme ile genom çapında lentiviral entegrasyon bölgelerinin yakalanmasını kolaylaştırır. InSET'in tasarımı, fenotipik ekranlardaki entegrasyon bölgesi bolluk varyasyonlarının büyük ölçekte analiz edilmesini sağlayarak, onu ileri genetik ve fonksiyonel genomik unsurları tanımlamak için sağlam bir araç haline getirir. InSET'in önemli bir yararı, önceki açıklamalardan bağımsız olarak, hem protein kodlayan hem de kodlamayan RNA'ların yeni fonksiyonel ekzonları dahil olmak üzere daha önce tanımlanmamış genomik elementleri ortaya çıkarma kapasitesidir. Genel olarak, InSET, birçok genomik elementin fonksiyonel karakterizasyonu beklediği insan genomu ve transkriptomunun karmaşık karmaşıklığını incelemede önemli bir değere sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel genomik, genomik bölgelerin önemli bir kısmı hala fonksiyonel karakterizasyondan yoksun olduğundan, genom sonrası çağda bile çok önemli ve zorlu bir alan olmaya devam etmektedir. Bu zorlukların önemli bir nedeni, hem protein kodlayan hem de kodlamayan bölgelerde yaygın transkripsiyon ve evrensel alternatif birleştirme ile karakterize edilen insan genomu ve transkriptomunun karmaşık doğasında yatmaktadır1,2,3,4,5. Bu karmaşıklık, RNA hedefli zenginleştirme çalışmaları aracılığıyla kapsamlı bir şekilde vurgulanmıştır6,7,8,9. İnsan genomunun iyi açıklamalı bölümlerine ek olarak, çok sayıda yeni genomik öğenin eşlenmemiş ve işlevsel olarak açıklamasız kaldığı giderek daha fazla kabul görmektedir11<<sup class="xref">12

.

Son yıllarda, RNA interferansı (RNAi) ve CRISPR/Cas sistemleri gibi ters genetik araçlarda ilerlemeler görülmüştür13,14,15,16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, bu yöntemlerin, kısa firkete RNA'larının (shRNA'lar) veya tek kılavuz RNA'ların (sgRNA'lar) karmaşık kitaplıklarının oluşturulmasıyla ilişkili spesifik olmayan etkiler ve yüksek maliyetler dahil olmak üzere dikkate değer dezavantajları vardır22,23,24,25. Ek olarak, bu yöntemler ağırlıklı olarak açıklamalı genomik öğelere odaklanır. Buna karşılık, ileri genetik, yeni, açıklanmamış fonksiyonel genomik unsurları tanımlama avantajına sahiptir. İnsan genomunun ve transkriptomunun karmaşıklığının yanı sıra çok sayıda yeni genomik element göz önüne alındığında, ileri genetiğin bu yeteneği büyük önem taşımaktadır.

İleri genetik hücre kütüphaneleri sıklıkla rastgele retroviral entegrasyon yoluyla oluşturulur, bu da genom çapında entegrasyon bölgelerinin verimli bir şekilde tespit edilmesini ileri genetik tahlil için çok önemli hale getirir. Bu entegrasyon bölgelerini tespit etmek tipik olarak genom yürüyüş araçlarını içerir26. Bu araçlarda önemli ilerlemeler olsa da, çok azı yeni nesil dizileme (NGS) uygulamaları için optimize edilmiştir ve daha sonra insersiyonel mutajenez çalışmalarında uygulanmaktadır. Hücre hatlarındaki insersiyonel mutajenez, entegrasyon sitelerini tespit etmek için genellikle ters PCR (I-PCR) veya doğrusal amplifikasyon aracılı PCR (LAM-PCR) gibi yöntemler kullanır<>sup class="xref"27,28,29. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle kısıtlama enzimi sindirimi veya ligasyon adımları gerektirir, bu da verimliliği azaltabilir ve sonuçlarda önyargılara neden olabilir.

İleri genetik ekranlarında genom çapında entegrasyon bölgelerinin verimli bir şekilde algılanmasını geliştirmek için, burada Fonksiyonel Elementler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekran (InSET) yöntemi adı verilen bir yöntem tanıtıldı. InSET, genom yürüyüşünü NGS ile entegre ederek, lentivirüs tabanlı insersiyonel mutajenez kütüphanelerinde lentivirüs entegrasyon bölgelerinin yüksek verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Mevcut methods27,28,29 ile karşılaştırıldığında, InSET nispeten basit ve basittir, kısıtlama enzimi sindirimini veya ligasyon adımlarını ortadan kaldırarak daha rahat ve erişilebilir hale getirir. Ayrıca, memeli hücrelerindeki mevcut ileri genetik ekranı çok az sayıda haploid veya haploide yakın hücre dizisiyle sınırlı olsa da27,28,29,30,31, InSET'in anöploid hücre hatlarında çalıştığı kanıtlanmıştır32.

Bu çalışma, InSET yönteminin uygulanması için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Ek olarak, inseksiyonel mutajenez çalışmalarında InSET'in uygulamasını gösterir. InSET, insan hücre dizilerinde hem protein kodlayan hem de kodlamayan RNA'ları kapsayan, genomik elementler içindeki yeni ekzonları tanımlamak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, InSET yöntemine şematik bir genel bakış sağlar. Optimum kapsama alanı için, 1 μg genomik DNA'dan beş paralel kitaplık hazırlayın, ardından bunları yeni nesil dizileme için bir araya getirin. Bu prosedür önceki testlerde sürekli olarak başarıyla tamamlanmıştır, ancak kullanıcılar kendi takdirlerine bağlı olarak duraklama noktaları ekleyebilirler. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Genomdaki lentivirüs entegrasyon bölgelerinin yakalanması

  1. 1x Taq Tamponu, 2.5 U Taq DNA Polimeraz, 4 μL dNTP Karışımı (her biri 2.5 mM) ve 0.3 μM biyotinile primer 3->LTR_prime içeren 50 μL'lik bir reaksiyonda doğrusal bir PCR şablonu olarak önceki bir çalışmada açıklandığı gibi<, lentivirüs bazlı insersiyonel mutajenez hücre kütüphanesinden (1 μg) izole edilen Genomik DNA'yı kullanın (1 μg), bir PCR tüpünde 1>Tablo 1) (Tablo 1) NOT: 3 LTR_prime primer, lentivirüs dizisinin LTR bölgesine tavlanır. 5' LTR'ye tavlanırsa, amplifiye edilmiş fragman, yan genomik diziyi içerir. 3' LTR'ye tavlanırsa, amplifiye edilmiş fragman, konakçı genomuna hizalanamayan ve bu nedenle, aşağı akış dizileme veri analizi sırasında filtrelenecek olan dahili bir lentivirüs dizisi içerir. Bu astar, bir eklemesel mutajenez hücre kütüphanesi oluşturmak için kullanılan diğer vektör türlerine uyum sağlamak için de değiştirilebilir.
  2. Standart bir PCR termocycler'da 50 döngü doğrusal PCR gerçekleştirin, başlangıçta 2.5 U Taq DNA Polimeraz ekleyin ve 25 döngüden hemen sonra tekrar ekleyin. PCR koşulları aşağıdaki gibidir: 5 dakika boyunca 94 °C; 30 sn için 94 °C, 30 sn için 55 °C ve 30 sn için 72 °C'de 50 döngü; 5 dk.
    için 72 °C NOT: Uzun süreli reaksiyonlar sırasında Taq DNA Polimerazın aktivitesini korumak için, enzimin reaksiyonun hem başında hem de orta noktasında eklenmesi önerilir.
  3. PCR ürünlerini yeni, temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  4. PCR ürünlerini 10 μL biotin-streptavidin manyetik boncuk ile iyice karıştırın.
  5. Karışımı oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin, metal bir banyoda 400 rpm'de çalkalayın.
    NOT: Her 15 dakikada bir pipetle iyice karıştırmak için tüpü çıkarın.
  6. Boncukları toplamak için manyetik bir stand kullanın, ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  7. Boncukları 300 μL Bağlama/Yıkama Tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, %0.1 Tween-20) ile 6 kez yıkayın ve süpernatanı atın.
  8. 300 μL (65 °C) DNase / RNaz içermeyen damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve süpernatanı atın.
  9. İkinci iplik sentezi için, boncukları 1x Klenow Fragman Tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (her biri 2.5 mM) ve 6.25 μM P5_N6 primer içeren 24 μL'lik bir reaksiyon hacminde yeniden süspanse edin (Tablo 1) bir PCR tüpünde.
    NOT: 100 μM'lik bir P5_N6 astar stok çözeltisi hazırlayın. P5_N6 astar, 5' ucunda sabit bir P5 adaptör dizisinden ve 3' ucunda rastgele bir heksamer dizisinden oluşur. Rastgele heksamer, çok çeşitli hedef dizilere bağlanabilir, bu da onu doğrusal PCR yoluyla üretilen çeşitli DNA fragmanlarının amplifiye edilmesi için uygun hale getirir.
  10. Karışımı bir PCR termocycler'da 15 °C'de 20 dakika önceden inkübe edin.
  11. 2 u Klenow fragmanı (büyük fragman E.coli DNA polimeraz) ekleyin.
  12. Karışımları aşağıdaki koşullarda bir PCR termosiklerde inkübe edin: 0,5 °C/dk'da 15 °C'den 25 °C'ye yavaşça rampa ve ardından 30 dk inkübasyon; daha sonra 0,5 °C/dk'da 37 °C'ye yavaşça rampa yapın ve ardından 1 saat inkübasyon yapın.
  13. PCR ürünlerini yeni, temiz 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  14. Boncukları yakalamak için manyetik bir stand kullanın, ardından süpernatanı atın.
  15. Boncukları 300 μL 4 °C DNase/RNaz içermeyen damıtılmış su ile nazikçe yıkayın. Boncukları toplayın ve süpernatanı atın.

2. İç içe PCR ile NGS kütüphanesi oluşturulması

  1. 1x Taq Tamponu, 1.25 U Taq DNA Polimeraz, 0.5 μM primer P5 (Tablo 1), 2 μL dNTP Karışımı (her biri 2.5 mM) ve 0.5 μM primer 3-LTR_Nest (Tablo 1) içeren 25 μL'lik bir PCR reaksiyon hacminde boncukları adım 1.15'ten yeniden süspanse edin.
  2. Aşağıdaki koşullar altında bir PCR termodöngüleyicide PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 94 °C; 30 saniye boyunca 94 °C'lik 20 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C; 72 dakika boyunca 7 °C.
  3. 1x Taq Tamponu, 2.5 U Taq DNA Polimeraz, 4 μL dNTP Karışımı (her biri 2.5 mM), 0.4 μM primer Illumina_P5 (Tablo 1) ve 0.4 μM primer Illumina_P7-3LTR (Tablo 1) içeren 50 μL hacimde bir sonraki PCR turu için şablon olarak adım 2.2'deki 5 μL PCR ürününü kullanın.
  4. Aşağıdaki koşullar altında bir PCR termodöngüleyicide PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 94 °C; 30 saniye boyunca 94 °C'lik 15 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C; 72 dakika boyunca 72 °C.
  5. PCR ürünlerini temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir ve numuneler -20 °C'de saklanabilir.
  6. PCR ürünlerini 1,2 kat hacim DNA temiz boncuk kullanarak saflaştırın ve nihai hacmi 21 μL.
    'ye getirin NOT: Paralel olarak hazırlanan 5 kitaplığın her birinden 10 μL PCR ürünü alın, bunları bir araya getirin ve 21 μL'lik bir nihai hacme kadar saflaştırın. PCR ürünleri için saflaştırma protokolü, DNA temiz boncuklar için üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Boncukları 2-8 °C arasında oda sıcaklığına 30 dakika dengeleyin.
    2. Boncukları ters çevirerek veya girdaplayarak iyice karıştırın.
    3. Boncukların 1,2 katını temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne pipetleyin.
    4. PCR ürünlerini boncuklara ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
    5. DNA'nın boncuklara bağlanmasını sağlamak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    6. Numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaştığında (yaklaşık 5 dakika) süpernatanı çıkarın.
    7. Boncukları yıkamak için 200 μL %80 etanol ekleyin, oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve süpernatantı çıkarın.
      NOT: %80 etanol taze olarak hazırlanmalıdır.
    8. Adım 2.6.7'yi bir kez tekrarlayın.
    9. Boncukları oda sıcaklığında, kapak açıkken yaklaşık 5 dakika havayla kurutun.
    10. Tüpü manyetik standdan çıkarın, 22 μL DNase/RNaz içermeyen damıtılmış su ekleyin, 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika
      11. bekletin.
    11. Çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 2 dakika) tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin, ardından 21 μL süpernatanı temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir ve numuneler -20 °C'de saklanabilir.
  7. Piyasada bulunan dsDNA floresan tespit kiti ile Florometreyi kullanarak konsantrasyonu ölçmek için 1 μL saflaştırılmış PCR ürünü kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Konsantrasyon ölçüm protokolü, dsDNA tespit kiti için üreticinin talimatlarını takip eder.
    1. Reaktif ve Tamponu (kitte verilir) 1:200 oranında karıştırarak Çalışma Çözeltisi hazırlığını hazırlayın.
    2. Her biri 190 μL Çalışma Çözeltisi ile 10 μL Standart # 1 ve 10 μL Standart # 2'yi (kitte verilir) karıştırarak tahlil standartlarını hazırlayın. Karışımı 2-3 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.
    3. 1 μL saflaştırılmış PCR ürünlerini 190 μL Çalışma Çözeltisi ile karıştırarak tahlil örneğini hazırlayın. Karışımı 2-3 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.
    4. Tahlil standartlarını ve tahlil numunelerini oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun.
    5. Florometreyi açın.
    6. Ana menüden dsDNA Yüksek Hassasiyet programını seçin.
    7. Kalibrasyon için Standart #1'i makineye yerleştirin, ilk standardı ölçmek için Standardı oku düğmesine basın, ardından Standart #2'yi yerleştirin ve ikinci standardı ölçmek için Standart oku düğmesine basın.
    8. Numune ölçümü için, numune ölçüm sayfasına gitmek için Numuneleri çalıştır düğmesine basın. Tahlil örneğini içeren her bir tüpü yerleştirin ve konsantrasyonu elde etmek için Tüpü oku düğmesine basın.
      NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir ve numuneler -20 °C'de saklanabilir.
  8. 30 giga tabanlı (GB) ölçekte eşleştirilmiş uçlu 150 bp (PE150) stratejisini kullanarak Illumina platformlarında NGS gerçekleştirin.
    NOT: Bu adım genellikle sıralama şirketlerine dış kaynaklıdır.

3. Veri analizi

NOT: Bu bölümde insan hücre hatlarındaki analiz örnek olarak kullanılmıştır.

  1. Lentivirus entegrasyon sitelerinin haritalandırılması
    1. %50'den fazla düşük kaliteli baz (Phred skoru <20), 15'ten fazla 'N' baz veya 150'den kısa bazlarla sıralama okumalarını fastp tool33 kullanarak filtreleyin (bkz.
    2. Yalnızca "GCCTTGTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      LTR etiketiyle başlayan okuma 2 ile eşleştirilmiş uç okumaları seçin ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      NOT: Bu dizi, insersiyonel mutajenez hücre kitaplığını oluşturmak için kullanılan vektörün sırasına bağlıdır.
    3. LTR etiket sırasını adım 3.1.2'den seçilen okumalardan kırpın.
    4. Varsayılan ayarlarla BWA-MEM 34 (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak kırpılan okumaları GRCh37/hg19'a hizalayın.
    5. Yalnızca hem okuma 1'in hem de okuma 2'nin, BAYRAK 147 ve BAYRAK 163 ile gösterilen doğru konfigürasyon ve aralıkla genoma benzersiz bir şekilde eşlendiği okuma çiftlerini koruyun.
    6. Yerleştirme konumunu, kırpılan okuma 2'nin ilk hizalanmış tabanı olarak tanımlayın.
    7. Her benzersiz ekleme sitesindeki okuma sayılarını, her örnekteki benzersiz şekilde hizalanmış okumaların toplam sayısına normalleştirin.
  2. Hücresel uygunluğu etkileyen insersiyonların tanımlanması (IACF'ler)
    NOT: İstatistiksel analizde, önemli ölçüde zenginleştirilmiş veya tükenmiş pozisyonları belirlemek için hem kontrol hem de muamele edilmiş numunelerin üç biyolojik kopyası arasında ikili karşılaştırmalar yapılması tavsiye edilir. Yukarıda bahsedilen kopya sayısı minimumdur. Sonuçların güvenilirliğini ve doğruluğunu sağlamak için pratik olarak mümkün olduğunca çok sayıda kopya kullanılması önerilir.
    1. Her konumun normalleştirilmiş okuma sayılarını10 değer günlüğe kaydetmek için dönüştürün.
    2. Sıfır okuma ile konumların günlük10 değerlerini -5 olarak ayarlayın.
    3. Günlük10 değerleri üzerinde iki taraflı eşleştirilmiş Öğrenci t-testi gerçekleştirin.
    4. R ortamında Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak çoklu karşılaştırmalar için p değerlerini ayarlayın.
    5. Yanlış Keşif Oranı (FDR) eşiği %25 olan pozisyonları IACF olarak seçin.
  3. Hücresel uygunluğu etkileyen kümelerin tanımlanması (CACF'ler)
    NOT: Bu analiz için kontrol ve muamele edilmiş numunelerin üç biyolojik kopyası önerilmiştir.
    1. FDR eşiği %1 olan SICER35 (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak kontrol ve işlenmiş numuneler arasındaki önemli ölçüde zenginleştirilmiş veya tükenmiş yerleştirme kümelerini tanımlayın. SICER analizi için komut "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      NOT: Yukarıdaki komutta yer alan parametrelerin anlamları şu şekildedir: ["InputDir"] ["tedavi edilmiş örnek yerleştirme siteleri yatak dosyası"] ["kontrol örneği yerleştirme siteleri yatak dosyası"] ["OutputDir"] ["türler"] ["artıklık eşiği"] ["pencere boyutu (bp)"] ["parça boyutu"] ["etkili genom fraksiyonu"] ["boşluk boyutu (bp)"] ["E-değeri"].
    2. BEDTools suite36'nın "kesişme" işleviyle en az iki biyolojik kopya tarafından paylaşılan küme bölgelerini elde edin (Malzeme Tablosuna bakın) ve bu küme bölgelerini CACF'ler olarak belirtin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle sıralama sağlayıcısı tarafından gerçekleştirilen bir NGS kütüphanesinin kalite kontrol değerlendirmesi, sıralamadan önce standart kalite kontrolü görevi görür. Kütüphane kalitesinin etkisini göstermek için iki örnek karşılaştırılmıştır. S2-20-15 olarak etiketlenen yüksek kaliteli kitaplık, iki ardışık amplifikasyon adımından oluşan standart iç içe PCR protokolü kullanılarak hazırlandı: ilki 20 döngü, ardından ikincisi 15 döngü. Buna karşılık, s1-30 olarak etiketlenen düşük kaliteli kitaplık, Illumina adaptörle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İleri genetik analizinde, genom yürüyüşü, eklemeli mutajenez hücre kitaplıklarındaki entegrasyon bölgelerinin profilini çıkarmak için gereklidir. I-PCR ve LAM-PCR gibi klasik genom yürüme yöntemleri genellikle kısıtlama enzimi sindirimi ve ligasyonu gerektirir, bu da kütüphane karmaşıklığını azaltabilir ve enzim bölgesi bağımlılığı nedeniyle önyargılara neden olabilir 27,28,29. InSET yöntemi, kısıtlama, sindirim ve ligasyon adım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DX, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000441), Çin'in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2023J01130), Huaqiao Üniversitesi Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları (ZQN-924) ve Huaqiao Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonları (18BS205) tarafından desteklenmektedir. PK, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32170619), Ulusal Doğa Bilimleri'nden Uluslararası Kıdemli Bilim İnsanları Araştırma Fonu tarafından desteklenmektedir. Çin Bilim Vakfı (32150710525) ve Çin'in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2020J02006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260GBağlama/Yıkama Tamponu yapmak için
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025Bağlama/Yıkama Tamponu yapmak için
10&0 kez; Klenow Parça Tamponu Takara2140A
10 kez; Taq TamponuTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Bağlama/Yıkama Tamponu yapmak için
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
BEDToolsYazılımı, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMYazılımı, v0.7.12
dNTP KarışımıTakara40302.5 mM her biri
Equalbit dsDNA HS Test KitiVazymeEQ111-02
fastpYazılımı
HiSeq X OnIlluminaSY-412-1001Illumina platformu, Novogene Corporation'a (Pekin) dış kaynaklıdırKlenow
FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850Illumina platformu, Novogene Corporation'a (Pekin) dış kaynaklıdırQubit
3.0 FlorometreThermoFisher ScientificQ33216
SICERYazılımı, v1.1
Taq DNA PolimerazTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Bağlama/Yıkama Tamponu Yapmak İçin
Ultra Saf Damıtılmış Suİnvitrojen10977015
VAHTS DNA TemizBoncuklar VazymeN411-01

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).
  3. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  4. Kapranov, P., et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA. BMC Biol. 8, 149(2010).
  5. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  6. Kapranov, P., et al. Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays. Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).
  7. Denoeud, F., et al. Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions. Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).
  8. Mercer, T. R., et al. Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).
  9. Deveson, I. W., et al. Universal alternative splicing of non-coding exons. Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).
  10. Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques. Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).
  11. Amaral, P., et al. The status of the human gene catalogue. Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).
  12. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  13. Bassik, M. C., et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  14. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  15. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  16. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells. Science. 355, 6320(2017).
  17. Bester, A. C., et al. An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance. Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).
  18. Liu, Y., et al. Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites. Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).
  19. Xu, D., et al. A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response. Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).
  20. Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth. Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).
  21. Recinos, Y., et al. CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements. Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).
  22. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  23. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).
  24. Stojic, L., et al. Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis. Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).
  25. Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward. Genome Biol. 21 (1), 93(2020).
  26. Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. Genome walking in eukaryotes. FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).
  27. Carette, J. E., et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).
  28. Carette, J. E., et al. Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing. Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).
  29. Burckstummer, T., et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).
  30. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  31. Cao, J. Y., et al. A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity. Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).
  32. Xu, D., et al. Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts. BMC Biol. 21 (1), 271(2023).
  33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  34. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:1303.3997. , (2013).
  35. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  36. Quinlan, A. R., Hall, I. M. Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  37. Pule, M. A., et al. Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences. Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).
  38. Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection. Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).
  39. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).
  40. Ambrosi, A., et al. Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors. PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lentivirus Integration SitesInsertional MutagenesisFunctional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

İlgili makaleler