HeLa Hücreleri Kullanılarak Anti-MDA5 Otoantikorlarının Tespiti ve Işık Mikroskobu ile İmmünositokimya

Yaygın olarak miyozit olarak adlandırılan idiyopatik inflamatuar miyopatiler (IIM), kronik kas inflamasyonu, değişken klinik belirtiler ve çeşitli terapötik sonuçlarla karakterize heterojen bir otoimmün bozukluk grubudur. Yaygın semptomlar arasında kas güçsüzlüğü, dayanıklılığın azalması ve miyalji^{bulunur 1}. IIM'nin birincil alt tipleri polimiyozit (PM) ve dermatomiyozit (DM) içerirken, klinik olarak amyopatik dermatomiyozit (KADM), DM'de görülenlere benzer, ancak minimal kas tutulumu olan veya hiç olmayan karakteristik deri döküntüleri ile ayırt edilir. PM, DM ve CADM'de önemli bir komplikasyon, hastaların yaklaşık %40'ını etkileyen ve artmış mortalite ile ilişkili olan interstisyel akciğer hastalığıdır (İAH)².

IIM'de İAH'nin klinik seyri ve prognozu büyük farklılıklar gösterir. DM ve CADM (DM-/CADM-ILD) ile ilişkili İAH, PM ile ilişkili İAH'ye kıyasla tedaviye daha dirençli olma eğilimindedir ve daha kötü bir prognoz taşır. Bunlar arasında, üç ay içinde hızla ilerleyen akut veya subakut İAH³, yavaş ilerleyen veya stabil kalan kronik İAH için %87'ye kıyasla, bildirilen beş yıllık sağkalım oranı sadece %52 ile özellikle şiddetlidir. Akut/subakut İAH'nın bir alt tipi olan hızlı progresif İAH (RP-ILD), hızlı başlayan nefes darlığı ve göğüs görüntülemesinde görülebilen yaygın alveoler hasar ile karakterizedir. RP-İAH, kötü prognoza sahip, hayatı tehdit eden bir durumdur ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için erken tanı ve hızlı müdahaleye acil ihtiyaç duyulduğunun altını çizmektedir ^4,5,6.

Miyozite özgü otoantikorlar (MSA'lar), miyozit ile ilişkili İAH'de kritik biyobelirteçler olarak ortaya çıkmıştır ve anti-MDA5 otoantikorları özellikle önemli bir rol oynamaktadır. Bu otoantikorlar PM-/DM-/CADM-ILD'li hastalarda sıklıkla saptanır ve RP-ILD ^7,8,9 için önemli prognostik göstergeler olarak hizmet eder. MDA5 (melanom farklılaşmasıyla ilişkili gen 5), viral ve mitokondriyal çift sarmallı RNA'yı saptayan ve interferon aracılı bağışıklık tepkilerini başlatan interferon ile indüklenebilir bir gen tarafından kodlanan bir sitozolik model tanıma reseptörüdür¹⁰. Kesin patojenik mekanizmalar belirsizliğini korusa da, anti-MDA5 otoantikorlarının MDA5 fonksiyonunu bozduğuna ve dolayısıyla otoimmün patogeneze katkıda bulunduğuna inanılmaktadır.

Anti-MDA5 otoantikorlarının zamanında tespiti, RP-ILD'nin erken tanımlanması ve yönetimi için esastır. Geleneksel olarak, ³⁵S-metiyonin etiketli K562 hücre özütü kullanılarak radyoetiketli immünopresipitasyon (IP), anti-MDA5 otoantikorlarını saptamak için altın standart olarak kabul edilmiştir¹¹. Ancak bu yöntem, yüksek maliyeti, özel ekipmana ve eğitimli personele bağımlılığı, katı radyoaktif atık imha düzenlemeleri ve radyoaktif etiketli reaktiflerin sınırlı raf ömrü nedeniyle rutin klinik kullanım için pratik değildir. Klinik uygulamada, leke tahlilleri genellikle alternatif olarak kullanılır; bununla birlikte, anti-MDA5 otoantikorları ^12,13 için yüksek bir yanlış pozitif oranı ile ilişkilidirler^ve bu da tanısal doğruluk konusunda endişeleri artırmaktadır. Sonuç olarak, pozitif sonuçları doğrulamak ve tanısal güveni artırmak için güvenilir, radyoaktif olmayan doğrulayıcı bir teste acil ihtiyaç vardır.

Bu boşluğu gidermek için, anti-MDA5 otoantikorları için tamamlayıcı bir doğrulayıcı test olarak immünositokimyanın (ICC) kullanılmasını öneriyoruz. Bu yaklaşım, HeLa hücrelerinin bir MDA5 yapısıyla transfekte edilmesini, hücrelerin hasta plazması ile inkübe edilmesini ve ışık mikroskobu altında görselleştirme için bir kromojenik substrat ile birleştirilmiş enzim konjuge ikincil antikorlar (örneğin, yaban turpu peroksidaz) kullanılarak bağlı anti-MDA5 otoantikorlarının saptanmasını içerir. ICC, hücresel bölmeler içindeki anti-MDA5 otoantikorlarını görselleştirmek için radyoaktif olmayan, oldukça hassas ve standartlaştırılmış bir platform sağlar. ICC'yi leke testi ile entegre ederek, bu yöntem yanlış pozitif oranlarını azaltmayı, tanısal doğruluğu artırmayı ve nihayetinde hastalar için klinik yönetimi ve sonuçları iyileştirmeyi amaçlar.

Bu çalışmanın amacı, anti-MDA5 otoantikorlarının tespiti için sağlam, radyoaktif olmayan bir protokol oluşturmak, mevcut tespit yöntemlerinin sınırlamalarını ele almak ve klinisyenlere PM, DM ve KADM hastalarında RP-ILD'nin erken tanısı için pratik ve güvenilir bir araç sunmaktır. Ekteki video anlatımında, yaşamı tehdit eden bu seyir halk arasında 'hızlı ölüm' olarak tanımlanıyor; bilimsel olarak hızlı ilerleyen İAH'ye (RP-İAH) karşılık gelir. Bu çalışma, mevcut kanıtlara dayanmaktadır ve klinik uygulamada prognostik değerlendirmeyi ve terapötik karar vermeyi önemli ölçüde iyileştirme potansiyeline sahiptir.

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. HeLa hücrelerini, nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antikotik içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı ile koruyun.
2. Hücreleri 2-3 günde bir veya hücreler %90-%100 birleşmeye ulaştığında geçirin.
3. Hücrelerin yaklaşık %90 birleşmeye ulaşmasını sağlamak için transfeksiyondan 24 saat önce 24 oyuklu bir plakanın (1.9 cm²/kuyu) her bir oyuğuna 7 ×^{10 4} HeLa hücresi tohumlayın.
4. 500 ng plazmit (pENTER-MDA5) ve 1.5 μL transfeksiyon reaktifinin her biri 25 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin.
5. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifine (1:1 oranında) seyreltilmiş DNA ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dakika inkübe edin.
6. Karışımı bir gün önce tohumlanan hücrelere ekleyin ve DNA-lipid kompleksini hemen karıştırmak için çalkalayın. Hücrelerin %80-%90 oranında birleştiğini doğrulayın.
7. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde 24 saat inkübe edin ve ICC yapmaya devam edin.
   NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir vektör (pEnter-MDA5) kullandık; daha fazla bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir. Transfeksiyon etkinliği ~% 50'dir.
   Hedef proteinin transfeksiyonunun ve ekspresyonunun başarısı, hücrelerin floresan protein eksprese eden bir plazmit ile transfekte edilmesi ve hedef proteinin ekspresyonunu görselleştirmek için bir Western blot yapılmasıyla belirlenebilir.

2. Hücre fiksasyonu

1. İnkübasyondan sonra, kalan ortamı çıkarmak için hücreleri 2x PBS ile yıkayın.
   NOT: Yıkama, plakayı bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak gerçekleştirilebilir.
2. Hücreleri PBS'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
   DİKKAT: Paraformaldehit zehirlidir. Uygun kullanım yönergelerini kullanın.
3. Fiksatif reaktifi aspire edin ve hücreleri 2 kez yıkamak için PBS kullanın.

3. Hücre geçirgenliği

1. Triton X-100 reaktifi (PBS'de %0,3) ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
2. 10 dakika sonra temizleme maddesini atın.
3. Hücreleri bir kez yıkamak için PBS ekleyin.

4. Hücre engelleme

1. PBS'de (1x) %10 fetal sığır serumu ile blokaj yapın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
2. Bloke edici reaktifi çıkarın, ardından hücreleri bir kez yıkamak için PBS ekleyin.

5. Hastanın antikorunun hibridizasyonu

1. Seyreltilmiş hasta plazmasını hücrelere ekleyin. Kullanmadan önce hasta örneğini (PBS'de 1:5.000 seyreltme) PBS'de seyrelttiğinizden emin olun.
   NOT: Sinyali geliştirmek veya arka planı gerektiği gibi azaltmak için seyreltmeyi ayarlayın. Tarafsız sonuçlar elde etmek için, testleri yapan personelin hangi örneklerin hastalara, hangilerinin sağlıklı bireylere ait olduğu konusunda hiçbir bilgisi yoktu.
2. Numuneyi 4 °C'de 12-16 saat (gece boyunca) inkübe edin.
3. İnkübasyon süresinin ardından hasta örneğini çıkarın ve hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın.

6. İkincil antikorun hibridizasyonu

1. Hücreleri seyreltilmiş Yaban Turpu Peroksidaz konjuge Keçi Anti-İnsan IgG (PBS'de 1:250 seyreltme) ile muamele edin ve hücreleri oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
2. Bir saat sonra ikincil antikorları atın.
3. PBS 3x ile durulayın.

7. Hücre boyama

1. Hücreleri yıkadıktan sonra, hücreleri 300 μL DAB çalışma solüsyonu/kuyusu ile boyayın.
   NOT: Bu çözelti, DAB kromojen konsantresi ve DAB seyrelticinin üreticinin talimatlarına göre karıştırılmasıyla hazırlanmıştır.
2. Hücreleri 5 dakika boyadıktan sonra boyayı çıkarın, deiyonize damıtılmış su ile durulayın ve 5 dakika çalkalayın.

8. Hücre karşı boyama

1. Hücre çekirdeğini seyreltilmiş hematoksilin ile boyayın.
   NOT: Hematoksilen Solungaç II'yi 10 kat seyreltmede kullanıyoruz ve boyama işlemi için 5 dakika bekliyoruz.
2. 5 dakika sonra hematoksilini atın, ardından 2 x 5 dakika deiyonize damıtılmış su ile yıkayın.

9. Gözlem

1. Optik mikroskop kullanarak boyama sonuçlarını gözlemleyin.
   NOT: Gerçek bir pozitif, MDA5'i eksprese eden HeLa hücrelerinin içinde güçlü kahverengi lekelenme gösterir; bu, hastanın örneğindeki anti-MDA5 otoantikorlarını doğrular. Negatif bir sonuç, kahverengi lekelenme olmayan HeLa hücrelerini gösterir, bu da anti-MDA5 otoantikorlarının olmadığını gösterir. Yanlış pozitif bir sonuç, MDA5 ekspresyonundan bağımsız olarak tüm hücrelerde geniş kahverengi boyama gösterir. Diğer otoimmün durumlarda görülen bu spesifik olmayan boyama, yanlış tanıyı önlemek için gerçek bir pozitiften ayırt edilmelidir.

Testleri yürüten personel, değerlendirme sürecindeki olası yanlılığı en aza indirmek için, numunelerin alındığı belirli hastalar da dahil olmak üzere numunelerin kimliklerine kör edildi. Bununla birlikte, sağlıklı kontrol numuneleri körlemeye tabi tutulmazken, sürekli olarak açık ve kesin sonuçlar verdiler.

Şekil 1A , pENTER-MDA5 yapısı ile transfekte edilmiş HeLa hücrelerinde MDA5'in başarılı ekspresyonunu göstermektedir. Transfeksiyon etkinliğini doğrulamak için ICC, ticari bir anti-MDA5 antikoru kullanılarak gerçekleştirildi. Transfekte edilen hücrelerin yaklaşık P'sinde güçlü kahverengi sitoplazmik boyama gözlendi, bu da güçlü MDA5 protein ekspresyonunu gösterir. Buna karşılık, aynı koşullar altında işlenen transfekte edilmemiş hücreler, antikorun özgüllüğünü ve endojen MDA5 ekspresyonunun yokluğunu doğrulayan sitoplazmik boyama göstermedi.

ICC protokolünü takiben, radyoetiketli immünopresipitasyon ile doğrulanan anti-MDA5 pozitif hastalardan alınan temsili örnekler, MDA5 eksprese eden HeLa hücrelerinde berrak kahverengi sitoplazmik boyama gösterirken, transfekte edilmemiş hücreler boyanmadan kaldı (Şekil 1B). Bu boyama modeli, hasta plazmasında anti-MDA5 otoantikorlarının varlığını gösterir ve 35S-metiyonin etiketli K562 hücre ekstraktı kullanılarak belirlenen altın standart tespiti ile uyumludur.

Hasta özellikleri, klinik tanıları, anti-MDA5 antikor durumunu ve sınıflandırmayı üç gruba ayıran EkTablo S1'de özetlenmiştir: anti-MDA5 pozitif, yanlış pozitif ve sağlıklı kontrol. Antikor durumuna ek olarak, Ek Tablo S1 artık her kohort için yaş, cinsiyet ve altta yatan tanı dahil olmak üzere hasta demografisini de özetlemektedir. Antikor reaktivitesi, artan antikor seviyelerini yansıtacak şekilde bant yoğunluğuna göre yarı kantitatif olarak zayıf (1+), orta (2+) veya güçlü (3+) olarak derecelendirildi. Bu, mevcut çalışmanın birincil metodolojik odağını korurken, ICC sonuçlarını yorumlamak için klinik bağlam sağlar. Çalışma kohortu, doğrulanmış anti-MDA5 otoantikorları olan 10 hastayı (pozitif grup), ticari leke testi ile yanlış pozitif sonuçlar veren otoimmün hastalıkları olan beş hastayı (yanlış pozitif grup) ve 10 sağlıklı bireyi (sağlıklı kontrol grubu) içeriyordu. Her numune, pozitif ve negatif kontrollerle birlikte test edildi ve radyoetiketli immünopresipitasyon kullanılarak bağımsız olarak doğrulandı. Net ve kesin boyama sonuçları olan numuneler için tek bir ICC çalışması yeterli görüldü. Boyamanın belirsiz veya sınırda olduğu durumlarda, doğru yorumlamayı sağlamak için seri seyreltmeler ve tekrarlanan ICC tahlilleri dahil olmak üzere daha ileri testler yapıldı. Bu yaklaşım, ICC tabanlı tespit yönteminin performansının doğrulanmasında hem metodolojik titizlik hem de kaynak verimliliği sağladı.

Yanlış pozitif sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu örneklerde idiyopatik inflamatuar miyopatiler (IIM) dışında otoimmün hastalıkları olan hastalardan alınan plazma kullanıldı. Şekil 1'den farklı olarak, kahverengi sitoplazmik boyama, MDA5 ekspresyon durumundan bağımsız olarak tüm hücrelerde yaygın olarak gözlendi. Bu boyama paterni, spesifik olmayan bağlanmayı gösterir ve diğer otoimmün rahatsızlıkları olan hastalardan alınan örneklerde yanlış pozitif potansiyelini vurgular. Negatif sonuçlar, sağlıklı bireylerden alınan plazmanın test edildiği Şekil 3'te sunulmuştur. Transfekte edilmiş veya transfekte edilmemiş HeLa hücrelerinde neredeyse hiç kahverengi sitoplazmik boyama gözlenmedi, bu da bu örneklerde anti-MDA5 otoantikorlarının olmadığını gösteriyor.

Şekil 1: ICC kullanılarak MDA5 ekspresyonunun doğrulanması ve anti-MDA5 otoantikorlarının saptanması. (A) MDA5 eksprese eden bir plazmit ile transfekte edilen HeLa hücreleri, ticari bir anti-MDA5 antikoru kullanılarak boyandı. Güçlü MDA5 protein ekspresyonunu gösteren güçlü kahverengi sitoplazmik boyama gözlendi. Buna karşılık, aynı koşullar altında işlenen transfekte edilmemiş hücreler, hem antikor özgüllüğünü hem de endojen MDA5 ekspresyonunun yokluğunu doğrulayan hiçbir boyama sergilemedi. (B) MDA5 ile transfekte edilmiş HeLa hücreleri, radyoetiketli immünopresipitasyon ile anti-MDA5 pozitif olduğu doğrulanan hastalardan alınan plazma ile inkübe edildi. Hasta örneğinde anti-MDA5 otoantikorlarının varlığını gösteren berrak sitoplazmik kahverengi boyanma gözlendi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: ICC = immünositokimya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: IIM dışındaki otoimmün hastalıkları olan hastalardan alınan plazma kullanılarak yanlış pozitif sinyallerin tespiti. Hem transfekte edilmiş hem de transfekte edilmemiş hücrelerde yaygın kahverengi sitoplazmik boyama gözlendi, bu da spesifik olmayan antikor bağlanmasını düşündürdü. Bu sonuçlar, anti-MDA5 pozitif IIM hastalarıyla ilgisi olmayan otoimmün hastalıkları olan hastalardan alınan plazma kullanıldığında hat leke deneylerinde yanlış pozitif tespit potansiyelini göstermektedir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: IIM = idiyopatik inflamatuar miyopatiler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sağlıklı kontrol bireylerinden alınan plazma ile negatif boyama sonuçları. MDA5 ile transfekte edilen ve sağlıklı bireylerden alınan plazma ile inkübe edilen HeLa hücreleri, çok az kahverengi sitoplazmik boyama gösterdi veya hiç göstermedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Hasta özellikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edecek hiçbir çıkarları yoktur.

Bu makalenin bazı bölümleri OpenAI'nin GPT-4'ünün yardımıyla oluşturulmuştur. Yazarlar, doğruluk ve özgünlüğü sağlamak için içeriği gözden geçirmiş ve düzenlemiştir.