Yöntem makalesi

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleks immünofloresan (mIF), tek bir bölümde birden fazla protein biyobelirteçini görselleştirerek doku örneklerinin ayrıntılı, uzamsal olarak çözülmüş analizine izin veren gelişmiş bir tekniktir. Bununla birlikte, çoğu mIF teknolojisi, çoğullama sırasında hassasiyet ve verim arasında önemli ödünleşimlerle karşı karşıya kalır ve bu da birden fazla doku kesitinde düşük bolluktaki biyobelirteçleri sağlam bir şekilde tespit etmek için kritik bir sınırlama oluşturur. mIF için yeni bir yaklaşım, paralel bir tek moleküllü amplifikasyon mekanizması ile amplifiye edilen antikorlara bağlı benzersiz DNA barkodları kullanır. Bu yöntem, yüksek çoğullama yetenekleri ve yüksek verimli tam slayt görüntüleme sağlarken, klinik dereceli immünohistokimya (IHC) ile yüksek oranda karşılaştırılabilir boyama kalitesi sağlar. Bu tahlil, doku üzerinde DNA barkodlu antikorlardan oluşan bir kokteylin amplifiye edilmesini ve ardından döngü başına dört floresan etiketli oligonükleotidi görselleştirmek için sıralı tespit adımları turlarını içerir. Böylece bu işlem, doku örneği başına sekiz veya daha fazla biyobelirteçin tespit edilmesini sağlar. Bu yöntemdeki temel adımlar arasında otomatik doku hazırlama, DNA barkodları ile konjuge edilmiş primer antikorların uygulanması, sinyal amplifikasyonu ve yinelemeli algılama, görüntüleme ve sinyal çıkarma döngüleri yer alır. Görüntü alımını, yapay zeka ile geliştirilmiş bir uzamsal görüntü veri bilimi platformu kullanılarak görüntü kaydı ve tek hücreli analiz takip eder. Bu çalışma için protokol, bademcik, melanom, kolon ve lenf nodu çekirdeklerini üç kopya halinde içeren formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) çok dokulu mikro dizilere (TMA'lar) uygulandı. Gelişmiş mIF teknolojileri, tümör yanıtı, tümör mikro çevresi ve bağışıklık ortamı hakkında daha fazla bilgi sağlar. Duyarlılık, çoğullama yetenekleri ve görüntüleme verimi arasındaki doğal ödünleşimlerin üstesinden gelerek, araştırmacılar artık zorlu moleküler imzaların ve terapötik yanıtların biyobelirteçlerinin heterojenliğini anlamayı hedefleyebilirler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek oranda çoğullanmış immünofloresan (mIF), tek bir doku kesiti 1,2 içinde birden fazla protein biyobelirtecinin aynı anda görselleştirilmesini sağlayarak doku analizi alanında devrim yaratan gelişmiş bir tekniktir. Bu yetenek, birden fazla uzamsal ölçekte doku mikro ortamı içindeki karmaşık morfolojilere sahip hücre tipleri arasındaki etkileşimleri anlamak için genellikle çok önemli olan benzersiz bir ayrıntı düzeyi ve uzamsal çözünürlük sağlar3. Teknik, tümör biyobelirteçlerini, protein ilaç hedeflerini, lokal bağışıklık ve kontrol noktası durumunu, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri ve hatta doku içindeki ilaç metabolizması ile ilgili hücre altı kolokalizasyon modellerini birlikte lokalize etmek için kullanılabileceği onkoloji araştırmalarında özellikle değerlidir 4,5,6.

Potansiyeline rağmen, çoğu mIF teknolojisi, özellikle çoğullama yetenekleriyle hassasiyet ve verimi dengelemede hala önemli zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sınırlama özellikle HER2 ve PD-L1gibi çok düşük ekspresyon gösterebilen klinik biyobelirteçlerin saptanması için kritiktir 7,8,9. Bunun neden olduğunu görmek için, mIF'in diğer modalitelerini anlamak önemlidir. Bu geleneksel yöntemler, daha sofistike mIF platformlarının yolunu açmıştır, ancak kendi avantajları ve sınırlamaları ile birlikte gelirler.

Doğrudan immünofloresan (DIF), doğrudan floroforlara veya floroforları10 alabilen bir oligonükleotite konjuge antikorları kullanır. Bu yöntemin çoğullanması kolaydır, ancak daha düşük hassasiyet ve doku arka planından veya boyama artefaktlarından gelen sinyali çözme zorluğundan muzdariptir.

Dolaylı immünofloresan (IIF), birincil antikora bağlanan ikincil bir antikor kullanır. Bu, birincil tabanlı DIF'ye kıyasla sinyali artırdı. Geliştirilmiş akış hücresi tasarımlarıyla birleştirildiğinde, sıralı IIF, bir testte 40'a kadar biyobelirteç tespit edebilir 2,11. Bununla birlikte, bunlar, immünohistokimya (IHC) tekniklerinde bulunanlar gibi, sinyal amplifikasyonu için enzim bazlı stratejilere kıyasla hala göreceli bir duyarlılık eksikliğinden muzdariptir.

Enzim katalizine dayalı immünofloresan en sık kromojenik (DAB) veya floresan boya birikimi için yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanan IHC yöntemlerinde görülür (ör., tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA)). Bu testler aynı katalitik enzime dayandığından, tespit duyarlılıkları benzerdir, bu da çok spektral TSA bazlı mIF testlerini klinik uygulamalar için uygun hale getirir 2,12. DNA tabanlı sinyal amplifikasyonunun avantajı, mükemmel sinyal amplifikasyonu ve modülerliği korurken mümkün olan yüksek derecede çoğullamadır. Buna karşılık, HRP tabanlı yöntemler daha az modülerdir ve optimize edilmesi zordur, ek panel geliştirme ve test döngüleri gerektirir.

DNA barkodlu antikor immünofloresan
Burada gösterilen mIF testi, DNA barkodlu antikorları aynı anda amplifiye etmek için bir DNA polimeraz kullanır, ardından görüntüleme turu başına dört floresan oligonükleotid kullanılarak raportör prob boyama ve boyama döngüleri yapılır (Şekil 1).

figure-introduction-1
Şekil 1: Multipleks immünofloresan test protokolünün grafiksel gösterimi. Barkodla konjuge antikorlar tek bir adımda eklenir ve barkodlar aynı anda amplifiye edilir. Her döngüde dört floresan probdan oluşan gruplar eklenir ve bu da dört işaretleyicinin aynı anda görselleştirilmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu tek turlu antikor ilavesi ve tek aşamalı amplifikasyon, test protokolünü büyük ölçüde basitleştirir. Proses, klinik çalışmalarda kullanılan çok sayıda numunede slayttan slayta ve partiden partiye tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan otomatik yüksek verimli boyama ve tarama sistemleri ile kolaylaştırılır13.

Bu teknolojinin başlıca avantajlarından biri, kapsamlı çoğullamaya izin verirken yüksek hassasiyeti koruma yeteneğidir2. İş akışı aynı zamanda görüntüleme veriminin yüksek kalmasını sağlar, böylece klinik çalışmalar için yüksek oranda çoğullanmış mIF teknolojilerinin (örneğin, > 8 biyobelirteç) en önemli sınırlamalarından birini ele alır. Bu, hastalar arasında düşük bolluktaki ilaç hedeflerindeki (örneğin, düşük HER2) ince değişikliklerin terapötik yanıta kritik bilgiler sağlayabileceği klinik araştırmalarda özellikle önemlidir.

Bu temel özelliklere ek olarak, bu test aynı zamanda panel yapılandırılabilirliği, yüksek verimli tam slayt görüntüleme yetenekleri ve hücre altı süreçleri ve bölmeleri ve ayrıca makrofajlar ve dendritik hücrelerle ilişkili hücresel çıkıntıları araştırmak için gerekli optik çözünürlüğü de sağlar. Karmaşık hücresel fenotipleri birden fazla uzamsal ölçekte araştırma yeteneği, optik görüntülemenin görüntüleme kütle sitometrisi (IMC) tabanlı yöntemlere karşı kritik bir avantajıdır2.

Bu çalışmada, bir otomatik boyama ve tam slayt tarayıcı kullanılarak 8 katlı bir mIF testi için bir protokol sunulmaktadır. Bu test, sekiz birincil antikordan oluşan bir panel içerir: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 ve pan-Sitokeratin14. Bu belirteç paneli, tümör dokusunun immünoprofilinin çıkarılmasına ve tümör veya stroma ortamında bulunan hücrelerin tanımlanmasına izin verecektir. Bu protokol, ilk boyama ve prob değişim turları için otomatik bir slayt boyayıcı kullanır ve boyama ve görüntüleme 2 gün içinde tamamlanabilir. Bir mIF tahlilinin doğrulanması ve elde edilen görüntülerin analizinin yapılması yöntemleri de gösterilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler kurumsal insan araştırmaları etik kurul yönergelerine uygun olmalıdır. Bu protokolde kullanılan tüm doku kesitleri eksternal bir doku sağlayıcısından alındı.

1. Doku örneği hazırlama

  1. mIF testi kullanılarak boyanacak FFPE doku bloğunu seçin. FFPE doku slaytları kullanılıyorsa, numunelerin 3-5 μm kalınlığında olduğundan, pozitif yüklü cam slaytlara monte edildiğinden ve nihai sonuçları olumsuz etkileyebilecek kırışıklık veya diğer yırtıklar içermediğinden emin olun.
    NOT: En iyi sonuçlar için, 2 aydan daha uzun bir süre önce kesilmiş doku örneklerini boyamaktan kaçının. Ek olarak, 10 yıldan uzun süredir saklanan veya görsel olarak kuru görünen bloklardan kaçının.
  2. FFPE doku blokları ile çalışıyorsanız, gerekli sayıda doku slaytını 4 μm kalınlığında kesmek için bir mikrotom kullanın ve slaytları pozitif yüklü bir cam slayt üzerine monte edin. En tutarlı sonuçları elde etmek için, tüm slaytları aynı yönde monte edin. Dokunun kırışıklık ve yırtık içermediğinden emin olun.
  3. Numuneler hemen lekelenmeyecekse, 2 aya kadar nitrojen altında bir sürgülü kutuda saklayın.

2. İlk kurulum için yardımcı reaktiflerin ve birincil antikorun kaydı

  1. Otomatik boyama yazılımı içinde, ekranın üst kısmındaki Reaktif Kurulumu Sekmesine gidin. Yeni reaktifler eklemek için Ekle'ye tıklayın.
  2. Boyama ve değişim tahlilleri, Tablo 1'de bulunan bilgileri takiben dokuz reaktif kabı kullanacaktır. Bunları, örneğin, kısaltılmış adı ISPWsh1 olan Wash Buffer adlı ilk reaktif için kullanmak için aşağıdaki adımları izleyin. Türü Yardımcı olarak seçin ve hem *BWash hem de DI'nin Uyumlu Yığınlar altında listelendiğini kontrol edin. Kaydetmeden önce Tercih Edilen kutusunu işaretleyin.
  3. Tablo 1'de bulunan adları ve kısaltılmış adları kullanarak kalan yardımcı reaktifler için bu işlemi tekrarlayın.
    1. Amplifikasyon Çözeltisi reaktifi (ULTAmp1), Bond Wash ile uyumlu değildir. Bunun için reaktif kurulum penceresinde, lütfen *BWash'i seçin ve bu reaktifi Uyumlu reaktifler listesinden ve mevcut reaktif bölümüne taşımak için << düğmesine tıklayın. Amplifikasyon çözeltisi reaktifi için uyumlu bir reaktif olarak Bond Wash'ın çıkarılmaması, testin boyama performansının önemli ölçüde azalmasına neden olabilir.
  4. Tüm reaktif kapları kaydedildikten sonra, ilk çalıştırmaya başlamadan önce bir Araştırma Tespit Kiti oluşturun. Algılama kiti için 30 mL'lik bir titrasyon kabı gerekir.
  5. 30 mL titrasyon kabını algılama kitine ekleyin. İkisinin ayrılmasını önlemek için titrasyon kabını çubuğa bantlayın.
  6. Algılama kitinin sol tarafındaki barkodu tarayın. Sonraki açılır pencerede, algılama kitini adlandırın (ör. InSituPlex Kit). Son kullanma tarihini kayıt tarihinden itibaren 10 yıl olarak ayarlayın.
    NOT: Burada ayarlanan son kullanma tarihi, reaktif üzerinde listelenen tarih değil, titrasyon kabındaki reaktifin son kullanma tarihidir. Son kullanma tarihini çok ileri bir tarihe ayarlamak, kitin gereksiz yere süresinin dolmamasını sağlar.
  7. Kitin ilk reaktif konumu için, açılır menüden reaktif olarak Yıkama Tamponu'nu seçin.
  8. Bu reaktif konumu için Barkod Alanına tıklayın ve bu kabı Yıkama Tamponu olarak kaydetmek ve reaktif kabını algılama çubuğuna bağlamak için bantlanmış 30 mL titrasyon kabının barkodunu tarayın.
  9. Titrasyon kabı kite bağlandıktan sonra, kaydetmek ve açılır pencereden çıkmak için Ekle düğmesine tıklayın.
  10. Titrasyon kabını 30 mL 1x Bond Yıkama ile doldurun ve boyama çalışmaları arasında 4 °C'de buzdolabında saklayın.

Tablo 1: Kurulum için yardımcı reaktifler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. İlk protokol kurulumu

  1. Tüm reaktif kaplarının başarılı bir şekilde kaydedilmesinin ardından, otomatik boyayıcı yazılım ekranının üst kısmındaki Protokol Kurulumu Sekmesine gidin.
  2. Ekranın sağ üst köşesindeki Logo'ya tıklayarak şu anda hangi yazılım sürümünün çalıştığını onaylayın. Ortaya çıkan açılır pencere, Yazılım bilgileri başlığı altında şu anda yüklü olan Yazılım sürümünü görüntüler.
  3. Yazılım Sürüm 7.0 veya üzeri ise, boyama protokolünün önceden yüklenmiş bir şablonu olacaktır. Ekranın alt kısmında, Tercih Edilen Durum seçiminin Tümü olarak ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin. Şablon protokolünü *ISP Boyama Testi olarak adlandırın. Yazılımın önceki sürümleri için protokol Tablo 2'de bulunabilir.
  4. *ISP Boyama Testi'ne sağ tıklayın ve protokolü kopyalayın. Ortaya çıkan açılır pencerede, Boyama Testi 1 protokolünü kısaltılmış adla (ISP_IHC1) yeniden adlandırın
  5. Tercih edilen Algılama sistemi altında, adım 2.6'daki ilk reaktif kurulumu sırasında oluşturulan sistemi seçin.

Tablo 2: Multipleks immünofloresan boyama protokolü protokolü. *MARKER, antikor çözeltisine karşılık gelir ve Yıkama Tamponu, BOND Yıkama çözeltisine karşılık gelir. Diğer tüm yardımcı reaktifler, uygun şekilde adlandırılmış kit bileşenlerine sahiptir. Bu protokol, yazılım sürümü 7.0 ve üzeri, BXD 39 ve üzeri ile uyumludur. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Reaktif kurulumu

  1. Antikor konjugatları, amplifikasyon enzimi, değişim başlatıcı ve değişim nötrleştiricisi dışındaki tüm kit reaktiflerini oda sıcaklığında çözün. Kit bileşenlerinin geri kalanını kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  2. Henüz yapmadıysanız, adım 2.3'te tanımlanan reaktiflerin her biri için yeni bir titrasyon kabı kaydedin. Her birine yeni bir titrasyon yuvası yerleştirin.
  3. Adım 2.6'da kaydedilen Araştırma Tespit Sistemini alın ve ilgili yıkama tamponu kabının 1x Bond yıkama solüsyonu ile 30 mL'ye kadar doldurulduğundan emin olun. Her reaktif için titrasyon kaplarını sisteme yerleştirin.
  4. Ab Seyrelticiyi ilgili kapta hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (150 μL x slayt sayısı) ve sağlandığı gibi antikor seyrelticiden oluşur. Çözüldükten sonra karıştırmak için tamponu girdaplayın.
  5. Antikor boyama solüsyonunu antikor boyama solüsyonu 1 kabında hazırlayın. Sağlanan antikor seyrelticisine tüm antikorları 1:100 seyreltmede ekleyin. Gerekli hacim 350 + (150 μL x slayt sayısı). Antikor stoklarını veya tam antikor boyama solüsyonunu girdaplamayın, sadece pipetleme ile karıştırın.
  6. Ön amplifikasyon karışımını ön amplifikasyon karışım kabında hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (150 μL x slayt sayısı) ve sağlandığı gibi ön amplifikasyon karışımından oluşur. Çözüldükten sonra bu çözeltiyi girdaplayın.
  7. Amplifikasyon solüsyonunu amplifikasyon solüsyonu kabında hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (150 μL x slayt sayısı) olup, amplifikasyon tamponunda 1:10 oranında seyreltilmiş amplifikasyon enziminden oluşur. Amplifikasyon enzimini veya tamamlanmış amplifikasyon solüsyonunu girdaplamayın, sadece pipetleyerek karıştırın.
  8. Nükleer karşı lekeyi bir nükleer karşı leke kabında hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (300 μL x slayt sayısı) olup, ultra saf suda 1:100 oranında seyreltilmiş sağlanan nükleer karşı leke çözeltisinden oluşur. Girdap yaparak karıştırın.
  9. Floresan prob kabında ilk görüntüleme turuna karşılık gelen floresan prob karışımını hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (450 μL x slayt sayısı), floresan problardan oluşan 1 çözelti prob tamponu içinde 1:20 oranında seyreltilmiştir. Çözüldükten sonra bileşenleri ve son tam karışımı girdaplayın.
  10. Tüm reaktifler hazırlandıktan ve karşılık gelen kaplarına yerleştirildikten sonra, reaktif hacminin ölçülmesine izin vermek için tam reaktif çubuğunu yazılıma yerleştirin.

5. Kurulumu çalıştırın

  1. Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, yazılımın üst kısmındaki Slayt kurulumu sekmesine gidin ve Yeni Çalışma düğmesini seçin. Çalışma Kimliğini, çalışma adını ve çalışma yorumlarını istediğiniz gibi ekleyin. Örnek olarak Şekil 2'ye bakın.
  2. Dağıtım hacmi altında, hazırlama protokolü olarak 150 μL ve *Dewax 4 adımını seçin. Açılır menüde *Dewax 4 steps görünmüyorsa, Protocol Setup (Protokol Kurulumu) menüsünde bu protokolü bulun ve Preferred (Tercih Edilen ) kutusunu işaretleyin. Tamam'a basın.
  3. Etüt oluşturulduktan sonra, slayt kurulum ekranının sağ tarafındaki Slayt Ekle düğmesini seçin. Slayt Açıklamaları'nın altında, slaydı benzersiz bir şekilde adlandırın.
  4. Bu ekrandaki ek alanlar için, Doku Tipi'ni Dokuyu Test Et olarak ayarlayın ve Boyama modu sol açılır menüde Tek ve sağ açılır menüde Rutin olacak şekilde dağıtım hacmini 150 μL olarak ayarlayın. İşlem altında, işaretleyici Antikor Boyama Çözeltisi olacak şekilde IHC'yi seçin.
  5. Slayt ekle penceresinin protokol bölümünde, boyama için Boyama Deneyi 1'i , hazırlık olarak * Dewax 4 adımını ve HIER olarak ER20 ile *HIER 2 dakika'yı seçin. Enzim protokolü kalacaktır *----. Bu işlem tamamlandıktan sonra Slayt Ekle'yi tıklayın. Örnek olarak Şekil 2'ye bakın.
  6. Etütte çalıştırılacak slayt sayısı için bu işlemi gerektiği kadar yineleyin ve eklenen her slayt için Slayt Yorumları alanının daha sonra benzersiz bir şekilde tanımlanabilmesi için güncelleştirildiğinden emin olun. Tüm slaytlar eklendikten sonra, Slayt Ekle penceresini kapatın ve tüm etiketleri, karşılık gelen doku bölümlerine yapıştırarak yazdırın.
  7. Her slaytı tepsiye yükleyin ve tepsiyi yazılıma yüklemeden önce her bölümün üzerine kapak döşemeleri yerleştirin. Reaktifler ve slaytlar eklendikten sonra, yazılımın sağ tarafındaki İlgili otomatik boyayıcıyı seçin. Bu seçildikten sonra, toplu reaktifler ve reaktif hazırlama sırasında eklenenler de dahil olmak üzere yazılımdaki tüm reaktifler için üç slayt tepsisinin tümü ve bilgiler görünür olacaktır.
  8. Toplu reaktif kaplarının dolu olduğundan ve atık kaplarının çalışmayı tamamlamak için yeterli hacme sahip olduğundan emin olun, ardından çalıştırmayı başlatmak için Oynat düğmesine basın.
  9. Her çalıştırmanın tamamlanması yaklaşık 5 saat 15 dakika sürer. Durma süresini not edin ve protokol tamamlandıktan hemen sonra slaytların otomatik boyayıcıdan çıkarıldığından emin olun.

figure-protocol-1
Şekil 2: Yazılım istemleri. (A) Autostainer yazılımında, çoğullanmış immünofloresan (mIF) boyama protokolü için doğru ayarları gösteren yeni çalışma istemi. (B) Yazılıma, mIF boyama protokolü için doğru ayarları gösteren Slayt istemi ekleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Görüntüleme

  1. Boyama protokolü tamamlandıktan sonra, montaj ortamındaki lekeli slaytları ve lamel çıkarın. Lamel yerine sıkıca yapışana kadar (tipik olarak 1 saat veya daha fazla, duraklama noktası) montaj ortamının karanlıkta kürlenmesine izin verin.
  2. Test için uygun filtrelere sahip bir floresan mikroskobu veya tam slayt tarayıcıda görüntü slaytları. Bu tahlilde kullanılan boyalar tipik olarak DAPI, FITC, TRITC, Cy5 ve Cy7 filtreleriyle uyumludur.
  3. Görüntüler, Şekil 3A'dakilere benzer şekilde görünecektir. Görsel olarak dokunun tüm alanlarının düzgün bir şekilde odaklandığından ve sinyallerin uygun bir yoğunluk seviyesinde (aşırı/az pozlanmış değil) göründüğünden emin olun. Gerekirse, slaytları farklı pozlama ayarlarıyla yeniden görüntüleyin.
  4. Görüntülemeden sonra, ek bir görüntüleme turu gerekiyorsa, lameller kendi kendine düşene kadar slaytları 1x PBS'de bekletin. (duraklama noktası)

7. Exchange protokolünün ilk kurulumu

  1. Yazılım sürüm 7.0 veya üzeri ise, otomatik boyama protokolünün önceden yüklenmiş bir şablonu olacaktır. Ekranın alt kısmında, Tercih Edilen Durum seçiminin Tümü olarak ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin. Şablon protokolü *ISP Signal Exchg olarak adlandırılacaktır. Yazılımın önceki sürümleri için protokol Tablo 3'te bulunabilir.
  2. *ISP Signal Exchg'e sağ tıklayın ve protokolü kopyalayın. Ortaya çıkan açılır pencerede, protokolü Exchange Protokolü 1 kısaltılmış adıyla ISPEXCH1 olarak yeniden adlandırın. Devam etmeden önce Tercih Edilen kutusunun işaretli olduğundan emin olun ve Adım 2.6'da belirtilenle aynı kit adını atayın.

Tablo 3: Multipleks immünofloresan sinyal değişim protokolü protokolü. Yıkama Tamponu, BOND Yıkama çözeltisine karşılık gelir. Diğer tüm yardımcı reaktifler, uygun şekilde adlandırılmış kit bileşenlerine sahiptir. Bu protokol, yazılım sürümü 7.0 ve üzeri, BXD 39 ve üzeri ile uyumludur. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

8. Exchange protokolünün kurulumu ve çalıştırılması

  1. Değişim tamponunu oda sıcaklığında çözdürün. Değişim nötrleştiricisini ve değişim başlatıcısını kullanana kadar -20 °C'de tutun. Değişim protokolünü gerçekleştirmek için iki reaktif titrasyon kabı ve algılama kiti gereklidir.
  2. Değişim çözeltisini ilgili kapta hazırlayın. Gerekli hacim 350 + (450 μL x slayt sayısı) ve değişim tamponunda 1:500 oranında seyreltilmiş bir değişim başlatıcısından oluşur. Değişim enzimini veya tamamlanmış değişim çözeltisini girdap haline getirmeyin, sadece pipetleme ile karıştırın.
  3. İkinci floresan probları hazırlayın, floresan problar 2 kabında karıştırın. Gerekli hacim 350 + (450 μL x slayt sayısı) olup, 1:20 oranında seyreltilmiş floresan prob 2 çözeltisi ve prob tamponu 2 içinde 1:40 oranında seyreltilmiş değişim nötrleştiricisinden oluşur. Floresan prob karışımı ve prob tamponu girdaplanabilir, ancak değişim nötrleştiricisi ve nihai kombine çözelti yalnızca pipetle karıştırılmalıdır.
  4. Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, tam çubuğu otomatik boyayıcıya yerleştirin ve reaktiflerin makine tarafından daldırma testine tabi tutulmasına izin verin.
  5. 5. adımı izleyerek tüm slaytları ekleyin. Slayt ekleme sırasında işaretçiyi *Negatif olarak değiştirin. Hazırlık, HIER ve Enzim için, değişim protokolü için mum giderme veya antijen alımı gerekmediğinden *---- seçeneğini seçin. Bu işlem tamamlandıktan sonra Slayt Ekle'yi tıklayın.
  6. Etütte çalıştırılacak slayt sayısı için bu işlemi gerektiği kadar yineleyin ve eklenen her slayt için Slayt Yorumları alanının daha sonra benzersiz bir şekilde tanımlanabilmesi için güncelleştirildiğinden emin olun.
  7. Tüm slaytlar eklendikten sonra, Slayt Ekle penceresini kapatın ve tüm etiketleri, karşılık gelen doku bölümlerine yapıştırarak yazdırın.
  8. Her slaytı tepsiye yükleyin ve tepsiyi yazılıma yüklemeden önce her bölümün üzerine kapak döşemeleri yerleştirin.
  9. Tüm reaktifler ve slaytlar eklendikten sonra, yazılımda İlgili Otomatik Boyayıcı'yı seçin; Bu sağ tarafta olacak. Bu seçildikten sonra, toplu reaktifler ve reaktif hazırlama sırasında eklenenler de dahil olmak üzere yazılımdaki tüm reaktifler için üç slayt tepsisinin tümü ve bilgiler görünür olacaktır.
  10. Toplu reaktif kaplarının doldurulduğundan ve atık kaplarının çalışmayı tamamlamak için yeterli hacme sahip olduğundan emin olun.
  11. Bu onaylandıktan sonra, çalıştırmayı başlatmak için Oynat düğmesine basın. Protokolün tamamlanması yaklaşık 90 dakika sürer. Durma zamanını not edin ve çalışma tamamlandıktan hemen sonra slaytların derhal kaldırıldığından emin olun.

9. Görüntüleme

  1. Adım 5'te olduğu gibi yeni prob turu için görüntülemeyi tekrarlayın. Görüntüler Şekil 3B'deki gibi görünecektir.

10. İstifleme (>4-plex protein görüntüleme için)

  1. Artık aynı slayt için birden fazla görüntü mevcut olacaktır. Yığılmış 8 katlı bir görüntü oluşturmak için görüntüleri görüntü ortak kayıt yazılımında birleştirin.
  2. Her turun görüntülerini aşağıdaki gibi birlikte kaydedin.
    1. Her yuvarlak görüntü şu şekilde adlandırılır: _ burada slaydın benzersiz adıdır (barkod) ve alfabetik olarak sıralandığında 1. turdaki görüntüyü ilk sıraya, 2. turdaki görüntüyü ikinci sıraya koyan bir dizedir. Örneğin, = 1234ABC için, dosyalar 1234ABC_Round1 ve 1234ABC_Round2 olarak adlandırılabilir ve tüm dosyalar tarayıcının uygun uzantısına (örneğin, .czi) sahip olabilir. Tüm yuvarlak görüntüleri, örneğin Kaynak Görüntüler adı verilen tek bir klasöre koyun.
    2. Ortak kayıt yazılımı içinde, kullanıcı arayüzünün kaynak görüntüler dizini bölümündeki Ayarla düğmesine tıklayın ve sorulduğunda Yukarıda Oluşturulan Klasörü seçin.
    3. Kaynak görüntüler bölümündeki dosya türünü kaynak görüntülerin uzantısına ayarlayın (ör. .czi, .qptiff, vb.). Yazılım şimdi iki yuvarlak görüntüyü, Slayt 1234ABC'nin 2 yuvarlak görüntüye sahip olduğunu gösteren bir tabloda birlikte gösterecektir.
    4. İstenirse, kullanıcı arabiriminin yığılmış görüntüler dizini bölümündeki Ayarla düğmesini kullanarak çıktı yığılmış görüntülerin konumunu kaynak görüntüler klasöründen farklı bir dizine ayarlayın ve sorulduğunda İstenen Çıktı klasörünü seçin. Aksi takdirde, varsayılan olarak kaynak görüntüler klasörü kullanılır.
    5. Varsayılan olarak, yığının yalnızca bir .afi dosya gösterimi oluşturulur. Arayüzün işleme seçenekleri bölümünde tüm yığının OME.tif bir dosyasını kaydetme seçeneğini işaretleyin.
    6. Tüm numune üzerinde ortak kayıt doğruluğunu doğrulamak için, arayüzün çıktı bölümündeki Doğrulama seçeneğini işaretleyin.
    7. Görüntü ortak kaydını başlatmak için BAŞLAT düğmesine basın.

11. Görüntü analizi

  1. Slaytlar görüntülendikten sonra, Ultivue'nin STARVUE görüntü işleme paketi veya QuPath15 gibi tercih edilen herhangi bir analiz yöntemini kullanarak slaytları görselleştirin ve analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokolü takiben, FFPE dokusu birden fazla hedefle boyanacak ve dörtlü gruplar halinde tüm belirteçlerin yüksek kaliteli görüntüleri elde edilmiştir (Şekil 3A,B). Görüntü ortak kayıt yazılımı, Şekil 3C'de görüldüğü gibi aynı slayttaki görüntülerin birleştirilmesine ve birlikte kaydedilmesine olanak tanır. Kolorektal kanser (CRC) doku lamı için Şekil 4'te benzer sonuçlar gösterilmiştir.

Protokol başarısı, beklenen boyama paterni değerlendirilerek belirlenmelidir. Gösterilen CRC örneğinde, boyanmış hedeflerin her biri beklenen hücre altı bölmede, örneğin nükleer FoxP3, membranöz CD3, sitoplazmik CD68'de ifade edilir (Şekil 4B-D). Fonksiyonel hedeflerin her biri, sırasıyla tükenmiş T hücreleri ve immün baskılayıcı makrofajları gösteren PD1 ve CD3'ün veya PDL-1 ve CD68'in birlikte lokalizasyonu örneğinde gösterildiği gibi, uygun hücre tipinde ifade edilir. Gerçek pozitif sinyalin potansiyel arka plan gürültüsünden başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağlayan iyi sinyal-arka plan oranının değerlendirilmesi, genellikle lekelenmenin kalitesini onaylayan ve başarılı görüntü analizine izin veren patologlar veya görüntü analizi uzmanları tarafından kalitatif olarak gerçekleştirilir. Boyama kalitesini ve performansını daha fazla doğrulamak için, seri kesitlerde altın standart IHC (kromojenik DAB) ile karşılaştırma eklenebilir (Şekil 5'teki örneğe bakınız) ve ayrıca çoğu bağışıklık hedefi için insan bademcik gibi pozitif bir kontrol dokusu örneği eklenebilir, boyama çalışmasının başarısını doğrulamak için yararlı olabilir. Kanserlerin insan bademciklerinden daha düşük hedef ekspresyonu gösterebileceğini unutmayın16.

Sonuçlar kalitatif olarak doğrulandıktan sonra kantitatif analiz yapılabilir. Bu çalışmada, esas olarak, belirli bir hedefi veya hedefleri ifade eden farklı fenotiplerin hücre yoğunluğunun (hücre sayısı/mm2) hesaplanmasının yanı sıra, geniş bir dinamik ifade aralığı gösterebilen fonksiyonel hedeflerin ortalama yoğunluk seviyelerinin hesaplanmasından oluşur. mIF tahlillerinin kesinliğini değerlendirirken, aynı markörlerle boyanmış seri kesitler, Şekil 6'da kalitatif olarak görülebilen slaytlar arasında karşılaştırılabilir sinyaller göstermelidir. Farklı doku tiplerindeki tek belirteç yoğunluklarının örnek kantitatif sonuçları Şekil 7'de gösterilmiştir. Bu görüntüler üzerindeki görüntü analizi, pozitif hücrelerin tanımlanmasını sağlar ve her bir işaretleyici için karşılık gelen bir pozitif hücre yoğunluğunun yanı sıra pozitif hücre başına ortalama sinyal yoğunluğu hesaplanabilir. Bu, çoğullama testinin hassasiyetini değerlendirmek için her bir belirteç için bir değişkenlik katsayısının (CV) hesaplanmasına izin verir (Tablo 4).

figure-results-1
Şekil 3: 8-plex immünofloresan protokolünde ardışık boyama turlarından elde edilen bir doku mikroarray (TMA) çekirdeğinin görüntüleri. (A) CD8, PD1, PD-L1 ve CD68 işaretleyicilerini içeren ilk görüntüleme turundan elde edilen görüntü. Değişim protokolünden sonra, (B) CD3, CD4, FoxP3 ve CK/SOX10 işaretçilerinin ikinci turu için aynı slaytta ikinci görüntüleme turunu gösterir ve (C) (A) ve (B) görüntülerini birleştiren ortak kayıtlı bir görüntüyü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: Kolorektal kanser (KRK) dokusunun 8-plex immünofloresan boyama ile temsili boyanması. Şekil, aynı hücrede birden fazla hedefin birlikte lokalize edilmesiyle tanımlanabilen hücresel fenotipleri göstermektedir. (yukarıya) CRC dokusunun tam slayt görüntüsü. (altta) (A) T-reg hücreleri (CD3 + / CD4 + / FOXP3 +), (B) PD-1 ve PD-L1 eksprese eden hücreler, tümör ve stroma içindeki hücreler, (C) tükenmiş sitotoksik T hücreleri (CD3 + / CD8 + / PD-1), (D) immün kaçan tümör hücreleri (PD-L1 + / CK +) ve immün baskılayıcı makrofajlar (CD68 + / PDL1 +). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 5: İmmünohistokimya (IHC) ile immünofloresan (IF) boyamanın kalitatif karşılaştırması. Tek belirteçli immünohistokimya boyası (DAB, üst sıra), tek belirteçli immünofloresan (ISP monoplex) ve multipleks immünofloresanın (ISP multipleks) tek kanallı görünümü ile boyanmış seri kesitler, farklı boyama yöntemleri arasında kalitatif uyumu göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 6: Seri kesit boyama. (A) Çok dokulu bir TMA'nın düzenini gösteren diyagram. (B) TMA'daki her doku tipinin doku çekirdeklerinin temsili 8-plex görüntüleri. (C) Tek bir çalışmada boyanmış altı seri TMA bölümü boyunca bir bademcik çekirdeğindeki CD8'in temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 7: TMA'ya dahil edilen doku tipi başına tek işaretli yoğunluk ölçümü. Doku başına yoğunluklar, TMA lamı üzerindeki her doku tipinin üç temsili çekirdeği boyunca ortalama yoğunluklardır. Y ekseni, x eksenindeki farklı doku tiplerinde, pozitif hücre/mm2 birimlerinde tek işaretleyici yoğunluklarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 8: Bu protokolde açıklanan güçlendirilmiş ISP mIF'yi dolaylı IF ile karşılaştıran bağıl floresan sinyalinin ilgi bölgesi (ROI) analizi. (A) Beş ROI belirtilmiş CK (solda) veya PD-L1 (sağda) için boyanmış temsili slayt. (B) CK (üstte) ve PD-L1 (altta) için temsili ROI görüntüleri. Her biri 100 μm x 100 μm ölçülerinde ve yaklaşık 200 hücre içeren beş ROI boyunca (C) CK ve (D) PD-L1 için güçlendirilmiş mIF (mor) ve dolaylı IF (mavi) ile elde edilen ortalama sinyal yoğunluğu. Y ekseni değerleri rastgele floresan birimleri gösterir ve hata çubukları standart sapmaları gösterir (n=3). (E) Güçlendirilmiş ISP mIF (mor) ve dolaylı IF (mavi) ile elde edilen bağıl sinyal yoğunluğu, tüm ROI'lerde ortalama güçlendirilmiş mIF sinyalinin ortalama dolaylı IF sinyaline oranı alınarak hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Hesaplanan varyans katsayısı (CV). Bademcik görüntüleri için pozitif hücre yoğunluğunun CV'si ve ortalama sinyal yoğunluğu Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, bir otomatik boyayıcı kullanarak çalıştırılan yüksek verimli, yüksek hassasiyetli multipleks immünofloresan boyama için bir protokolü açıklar. Bu protokolü uygularken, reaktif hazırlama adımları kritiktir ve dikkati hak eder. Aynı çalışmadaki farklı slaytlar arasındaki veya aynı bileşenleri kullanan farklı slaytlar arasındaki lekelenme değişkenliğini en aza indirmek için reaktiflerin uygun şekilde karıştırıldığından ve doğru şekilde ölçüldüğünden emin olmak gerekir.

Bu protokolü uygularken sık karşılaşılan sorunlar arasında, yüklemeden önce reaktiflerin düzgün bir şekilde karıştırılmaması ve uygun olmayan bir de-vestiyer prosedürü nedeniyle doku kaybı potansiyeli yer alır. Bu boyama protokolü, kanser türleri de dahil olmak üzere herhangi bir FFPE doku tipine uygulanabilirken, bazı doku türleri daha dikkatli kullanım gerektirebilir (örneğin, yüksek yağ içerikli dokular). Doku kaybını önlemek için, kapakla kayan slaytların, lamel kendi kendine ayrılacak kadar uzun bir süre ıslanmasına izin verin. Camı yerinden çıkarmak veya kaldırmak için lamel zorlamayın.

Bir sınırlama, immün onkolojide en sık kullanılan hedeflerin birçoğunun doğrulanmış ve kullanıma hazır olmasına rağmen, bazı hedeflerin bir multipleks panele dahil edilmeden önce test geliştirilmesi gerektirebilmesidir. Bu işlem nispeten hızlı olsa da, özel bir multipleks panel kullanabilmek için birkaç hafta daha gerekebilir.

Bu test ile diğer multipleks immünofloresan teknolojileri arasında birkaç fark vardır. Doğrudan ve dolaylı immünofloresan bazlı teknolojilerle karşılaştırıldığında, burada gösterilen tahlil, önemli ölçüde daha yüksek bir amplifikasyon seviyesine sahiptir ve özellikle FITC kanalı gibi doku otofloresan gösterme eğiliminde olan kanallarda önemli ölçüde geliştirilmiş sinyal-gürültü sağlar. Bu, tam slayt yoğunluğu analizi ve manuel ROI tabanlı analiz kullanılarak ölçüldüğü üzere, doğrudan immünofloresandan ~ 30 kat daha güçlü bir sinyal ve dolaylı immünofloresandan ~ 10 kat daha güçlü bir sinyal ile sonuçlanır (Şekil 8). Bu yöntem, önemli ölçüde daha düşük maruz kalma sürelerinde çok daha hassas hedef protein algılamasını sağlar ve düşük yoğunluklu sinyalleri kaldırma riskini taşıyan arka plan çıkarma dahil olmak üzere görüntü işleme ihtiyacını ortadan kaldırır.

Enzim katalizli amplifikasyona dayalı mIF tahlilleriyle karşılaştırıldığında, burada gösterilen tahlil, daha basit bir iş akışına ve genellikle daha kısa tahlil çalışma süresine sahip olmanın yanı sıra, çoğullama gerçekleştirme konusunda önemli ölçüde geliştirilmiş bir yeteneğe sahiptir (Şekil 1). Bu tahlilde, antikorlar tek bir adımda bir araya getirilir ve aynı anda amplifiye edilir, bu da tahlil protokolünü büyük ölçüde basitleştirir. Ayrıca, tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) gibi bazı enzim bazlı teknolojiler, şemsiye etkisi 12,17,18 olarak adlandırılan farklı antikorlar arasında girişim gösterebilir. Burada kullanılan amplifikasyon teknolojisi, Şekil 4'te görülebileceği gibi, aynı hücre üzerinde birden fazla kolokalize ve birlikte eksprese edilen markörün tespit edilmesine izin vererek bu sorunu önler.

İnsan kanserlerinin yaklaşık% 90'ı epitel hücrelerinden yükselir19. Bunun nedeni, genellikle dış çevreye karşı ilk savunma hattını oluşturmaları ve daha hızlı çoğalmaları, bu da potansiyel olarak onkojenik mutasyonların daha hızlı birikmesine yol açmasıdır. Burada inflamasyon, tümör oluşumunda, ilerlemesinde ve yayılmasında kritik bir rol oynar. Son on yılda, bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerini ve bağışıklık hücrelerini hedef alan birçok tedavi, birçok tümör tipine karşı güçlü bir cephanelik olarak ortaya çıkmıştır 5,20,21. Ancak hastaların önemli bir kısmı hala yanıt vermemektedir. Tümör mikroçevresinin (TME) ve lokal bağışıklık ortamının kritik bir rol oynaması muhtemeldir. Birçok hastada diferansiyel ilaç yanıtı ile ilişkili TME moleküler imzalarının profilini çıkararak, terapötik biyobelirteçleri daha iyi tanımlamak mümkün olabilir. Bu rapor, mIF teknolojisinin, yüzlerce tam numune lamı veya tümör mikrodizisi boyunca, düşük ekspresyonlu belirteçler de dahil olmak üzere, birden fazla protein biyobelirteçini paralel olarak profillemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. ve A. Vasaturo, bu çalışmada kullanılan multipleks immünofloresan kitlerini üreten Ultivue'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ultivue tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-CD3UltivueKlonu BC33 (BioCare).
Anti-CD4Ultivue Clone(Abcam) bir parçası.
Anti-CD68UltivueClone KP1'ULT50801 (BioCare) bir parçası.
Anti-CD8UltivueClone C8/144B ULT50801 nin (BioCare) bir parçası.
Anti-sitokeratin + anti-SOX10ultivueklonları AE1/AE3 (Bethyl Labs) ve BC34'ün (BioCare) ULT50801 parçasıdır. ULT50801 bir parçası,
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo) karışımı olarak sağlanır.
Anti-PD1UltivueClone CAL20 ULT50801 nin (Abcam) bir parçası.
Anti-PDL1UltivueClone 73-10 ULT50801 un (Abcam) bir parçası.
Axioscan.Z1 MikroskobununZeiss,metinde floresan mikroskobu olarak adlandırılır
Bond Dewax ÇözeltisiLeicaAR9222
Bağ Epitop Alma Çözeltisi 2LeicaAR9640
Bond Açık Kaplar, 30 mLLeicaOP309700
Bond Araştırma Tespit KitiLeicaDS9455
Bond Titrasyon UçlarıLeicaOPT9049
Bond Titrasyon KitiLeicaOPT9719
Bond Üniversal ÖrtülerLeicaS21.4611
Bond Yıkama Solüsyonu 10x KonsantreLeicaAR9590
BondRX Otomatik Boyama MakinesiLeica, metinde "otomatik boyayıcı" olarak adlandırılıyor
BondRX YazılımıLeicaSürüm 6.0 veya üzeri
Lameller, #1.5 kalınlıkCorning2980-244
Etanol, 200 geçirmezVWR89370-084
FFPE doku bloklarıBioIVTdoku tipleri değişir
OmniVUE 8-plex testi (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Sitokeratin/SOX10)UltivueULT50801diğer tüm Ultivue bileşenlerini içerir
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)Boston BioProductsC-9911F(2,7 mM KCl ve 137 mM NaCl ile pH 7,4)
UltivueUltiAnalyzer.AI
metninde "montaj ortamı" olarak adlandırılanProLong Gold Antifade MountantThermoP10144
ULT50801
Ultivue Antikor SeyrelticiUltivue'ninbir parçası ULT50801
Ultivue Exchange BufferUltivue'ninbir parçası Ultivue
ULT50801 Değişim BaşlatıcısıUltivue'ninbir parçası ULT50801
Ultivue Exchange NötrleştiriciUltivue'ninparçası ULT50801
Ultivue Floresan Problar 1UltivueULT50801
Ultivue Floresan Probları 2'ninUltivue'ninbir parçası ULT50801
Ultivue Ön Amplifikasyon Karışımınınbir parçasıUltivue
Ultivue Prob TamponununUltivue
SP35 ULT50801 in ULT50801 parçası UltiStacker.AI Ultivue Ultivue Amplifikasyon Tamponu Ultivue bir bir parçası ULT50801 bir parçası ULT50801 Ultra saf su Sigma-Aldrich W4502'nin bir parçası

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Otomatik mm nofloresanDNA Barkodlu AntikorlarSinyal AmplifikasyonuT m Slayt G r nt lemeUzamsal ProteomikDoku Mikro DizisiTek H cre Analizimm n FenotiplemeFormalinle Sabitlenmi Doku

İlgili makaleler