Yöntem makalesi

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

29 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

Bu makalede

Özet

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyon ile akut genetik manipülasyonunu sunuyoruz. Bu kortikal organoid modeller, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğinden, insan kortikal gelişiminin, nörogelişimsel bozuklukların ve kortikal evrimin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağladığından, enjeksiyona özellikle uygundur.

Özet

İnsan kortikal organoidleri, insan beyninin gelişimini, nörogelişimsel bozuklukları ve insan beyninin evrimini incelemek için önemli araçlar haline gelmiştir. Gen fonksiyonunu aşırı ekspresyon veya nakavt yoluyla analiz eden çalışmalar, neokorteks gelişiminin düzenlenmesine ilişkin mekanik içgörüler sağlamak için hayvan modellerinde etkili olmuştur. Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu ile CRISPR/Cas9 aracılı akut gen nakavt için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kortikal organoidlerin dilimlenmesi, enjeksiyon ve müteakip elektroporasyon için ventrikül benzeri yapıların tanımlanmasına yardımcı olur, bu da bunu insan kortikal gelişimi sırasında akut genetik manipülasyon için özellikle uygun bir model haline getirir. Kılavuz RNA'ların tasarımını ve in vitro ve kortikal organoidlerde hedefleme etkinliğinin doğrulanmasını açıklıyoruz. Kortikal organoidlerin elektroporasyonu, apikal radyal glia, bazal progenitör hücreler ve nöronlar dahil olmak üzere gelişmekte olan neokorteksteki çoğu ana hücre sınıfının hedeflenmesini sağlayan orta nörojenik aşamalarda gerçekleştirilir. Birlikte ele alındığında, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu, kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonunu, gen regülasyonunu ve hücre morfolojisini araştırmak için güçlü bir tekniği temsil eder.

Giriş

Neokorteks, serebral hemisferlerin dış kaplamasını ifade eder ve memelilere özgü bir yapıdır. Neokorteks, daha yüksek bilişsel işlevlerin 1,2,3,4,5 yerini temsil eder. Gelişim sırasında, nöral kök ve progenitör hücreler, nörojenez adı verilen bir süreçte nöronlara yol açar. İnsan neokorteks gelişimini araştıran fonksiyonel çalışmalar, insan nöral kök hücre regülasyonunun, nöral patolojilerin ve insan beyninin evriminin altında yatan mekanizmaların aydınlatılması için temel sağlar 2,6,7.

Tarihsel olarak, insan beyninin gelişimi ile ilgili çalışmalar, ölüm sonrası dokuyu kullanan tanımlayıcı histolojik yaklaşımlara dayanıyordu ve daha yeni serbest yüzen doku kültürü sistemleri, insan fetal dokusu ile fonksiyonel araştırmalara olanak tanıyordu 8,9. Ek olarak, insan fetal beyin dokusunun uzun süreli genişleyen organoidler halinde kendi kendini organize etme kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir10. Fetal doku araştırmaları, insan gelişimi11,12 hakkında önemli bilgiler sağlamıştır, ancak sınırlı doku mevcudiyeti ve etik hususlar, insan beyni gelişiminin mekanik çalışmaları için yaygın uygulamasını sınırlamaktadır. Son on yılda, insan kaynaklı PSC (hiPSC) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) üç boyutlu nöral organoidlerin üretilmesine izin veren protokoller geliştirilmiştir13,14.

Serebral organoidler, ventrikül benzeri yapıların oluşumu, apikobazal polarite, kortikal sitomimari, radyal glia bölünmesi sırasında interkinetik nükleer göç ve nöronal göç gibi gelişmekte olan beynin önemli özelliklerini gösterir. Daha da önemlisi, bu yeni insan organoid modelleri, evrimsel olarak ilgili anahtar nöral progenitör tipleri, özellikle bazal radyal glia (veya dış radyal glia) dahil olmak üzere, farede iyi modellenmemiş insan gelişmekte olan beyninin özelliklerini özetlemektedir7,14,15. Erken serebral organoid protokollerinin çeşitli sınırlamaları - organoid heterojenliği ile ilgili sorunlar, iç çekirdeğe sınırlı besin tedariki ve çeşitli bölgesel kimlik gibi - son protokol ilerlemelerinde ele alınmıştır ve önümüzdeki yıllarda daha fazla gelişme beklenebilir 15,16,17,18,19. İnsan serebral ve kortikal organoidleri, insan kortikal gelişimini 20, nörolojik bozuklukları 21,22,23,24 ve beyin evrimini 25,26,27,28,29 incelemek ve büyük ölçekli tarama yaklaşımlarını gerçekleştirmek için hızla anahtar modeller haline gelmiştir 30,31,32.

Akut genetik manipülasyon için, neokorteks gelişiminin hayvan modellerinde esas olarak iki yöntem kullanılmıştır: hedef hücrelerin enfeksiyonu ile viral iletim33 ve utero veya in vitro elektroporasyon34,35. DNA'nın - ve daha yakın zamanda, CRISPR / Cas9 ribonükleoprotein (RNP) komplekslerinin36 - lateral ventriküllere enjeksiyonu, ardından elektroporasyon, elektroporasyon elektrotlarının oryantasyonuna bağlı olarak beynin belirli bölgelerinin hedeflenebilmesi avantajını sağlar. Elektroporasyon, hücre zarı geçirgenliğini geçici olarak artıran, DNA ve diğer yüklü moleküllerin hücrelere girmesine izin veren kısa elektrik darbelerini içerir. İn utero elektroporasyon ilk olarak fare37'de gerçekleştirildi ve burada hızla gelişimsel nörobiyoloji için yaygın olarak uygulanan bir metodoloji haline geldi. Yöntem daha sonra, neokorteks genişlemesini ve kortikal katlanmayı incelemek için kullanılan bir jirensefali türü olan sıçan38,39 vegelincik 40,41,42 gibi diğer türlere de uygulandı 3,43,44,45.

Elektroporasyon, insan beyni organoid araştırmalarında da önemli bir yöntem haline gelmiştir46. Serebral organoidlerde, hücre morfolojisini ve nöronal aksonları14,47 görselleştirmek, gen yıkım reaktiflerini 22,48,49 vermek ve aşırı ekspresyon ile gen fonksiyonunun araştırılması50 için elektroporasyon uygulanmıştır. Yöntem insan modelleriyle sınırlı değildir, aynı zamanda primat serebral organoidlerinin genetik modifikasyonu için de uygulanmıştır50,51. Ayrıca, bir Spin Ω eğirme biyoreaktöründe üretilen kortikal organoidlerin elektroporasyonu tanımlanmıştır52.

Bu protokolde, kortikal gelişimde gen fonksiyonu çalışmaları için dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin15 elektroporasyonunu ana hatlarıyla açıklıyoruz. Beyin bölgesine özgü organoidler, örneğin hastalık modellemesinde kantitatif analizin başarısı için kritik olan tekrarlanabilirliği ve tutarlılığı artırır. Dilimlenmiş insan kortikal organoid protokolünde15, homojen bir dorsal ön beyin progenitörleri popülasyonu elde etmek için iPSC farklılaşması sırasında güçlü modelleme ipuçları uygulanır, bunu daha az öğretici sinyalle doku büyümesini destekleyen kültür ortamının uygulanmasıizler 53,54. Kortikal organoidlerin dilimlenmesinin, organoid çekirdek15'teki besin ve oksijen mevcudiyetinin azalmasından kaynaklanan hücre ölümünü azalttığı gösterilmiştir. Ayrıca, dilimleme, bol miktarda bazal radyal glia içeren ventrikül benzeri yapıların gelişimini destekler ve sürekli nörojenez, genişlemiş bir kortikal plaka benzeri bölgeninoluşumuna yol açar 15. Bu protokolde tekrarlanan dilimleme, ventrikül lümenleri enjeksiyonla kolayca tanımlanabildiği ve hedeflenebildiği için bu kortikal organoidleri elektroporasyona özellikle uygun hale getirir. Dilimlenmiş kortikal organoidlerin elektroporasyonu, gen düzenleyici bölgeleri ve kortikal evrimi incelemek için uygulanmıştır 26,55.

Elektroporasyon prosedürü sırasında, enjeksiyon karışımı ventrikül benzeri yapıların lümenine iletilir. Darbeli bir elektrik alanının uygulanması üzerine, karışım ventrikülü kaplayan apikal radyal glia tarafından alınır. Apikal radyal glia bölünüp daha kararlı hücre tiplerine4 yol açtıkça, elektroporasyonlu ajanlar bazal progenitör hücrelere ve nöronlara geçer. Elektroporatlı döller, 3 gün sonra ventriküler bölge (VZ) ve subventriküler bölge (SVZ) içinde dağıtılır ve orta nörojenik aşamalarda elektroporasyondan 7 gün sonra kortikal plaka (CP) benzeri bölge de dahil olmak üzere kortikal duvarın çoğunu kapsar26,55.

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinde26 elektroporasyon yoluyla CRISPR/Cas9 aracılı gen bozulmasını56 açıklıyoruz. Ek olarak, elektroporasyon yöntemi, gen aşırı ekspresyonu, floresan proteinlerin ekspresyonu ile hücre morfolojisinin ve hücresel süreçlerin görselleştirilmesi, Masif Paralel Raportör Testleri (MPRA) için plazmit kütüphanelerinin verilmesi, epigenom düzenleme araçlarının verilmesi ve canlı görüntüleme için hücrelerin etiketlenmesi için de uygulanabilir.

Protokol

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSC) içeren tüm deneyler, 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Dresden Üniversitesi Hastanesi Etik İnceleme Komitesi (IRB00001473; IORG0001076; etik onay numarası SR-EK-456092021).

1. Akut CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı için kılavuz RNA'ların tasarımı

  1. Yazılım veya çevrimiçi araçlar kullanarak protein bozulması olasılığını artırmak için protospacer bitişik motifleri (PAM'ler) arasında ideal olarak 7-11 bp'lik bir mesafeyle (3 bp'nin katlarından kaçınarak) aynı eksonu hedefleyen bir çift kılavuz RNA (gRNA) tasarlayın.
    NOT: İdeal olarak, işlevsel alanları kodlayan ekzonlar hedeflenmelidir. Alternatif olarak, transkriptin ilk ekzonları seçilebilir (Şekil 1A). Aktivite skoru (1'e yakın)57 ve özgüllük skoru (%100'e yakın)58'e göre kılavuz RNA'ları seçin.

2. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin kültürü

  1. İnsan kortikal organoidleri üretmek ve gRNA fonksiyonunu doğrulamak için, sağlıklı bir donörden türetilen hiPSC hattı CRTDi004-A59'u kullanın.
  2. Standart koşullar altında (37 ° C,% 5 CO2) kök hücre ortamında bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakalar üzerinde daha önce tarif edildiği gibi iPSC'leri60 kültürleyin. İndüklenen PSC'ler, ilk 24 saat boyunca ROCK yolu inhibitörü (1: 1.000) takviyesi ile tek hücreli ayrışma için bir enzim kullanılarak% 80 birleşmede geçilmelidir.
    NOT: Organoid üretimi ve gRNA doğrulaması için diğer iPSC hatları kullanılabilir.

3. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden genomik DNA'nın ekstraksiyonu

  1. Genomik DNA ekstraksiyonu için 6 oyuklu bir plakanın %80-90 birleşik hiPSC'sine sahip 2 kuyu kullanın. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için hücreleri plakadan bir enzimle ayırın. Hücreleri 1 mL kök hücre ortamında (toplam hacim) alın, ardından 600 x g'da 10 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarın.
  2. Hücre peletini 250 μL lizis tamponu (50 mM TrisHCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, %0.5 SDS, H2O'da 5 mM EDTA) ve 12.5 μL Proteinaz K (10 mg / mL stok) içinde yeniden süspanse edin. 55 °C ve 250 rpm'de 2 saat inkübe edin.
  3. 100 μL 5 mM NaCl ile karıştırın. 4 ° C'de 18.000 x g'da 10 dakika döndürün ve süpernatanı yeni 1.5 mL reaksiyon tüplerine aktarın.
  4. 250 μL izopropanol ekleyin, tüpleri birkaç kez ters çevirin ve 4 ° C'de 18.000 x g'da 15 dakika döndürün.
  5. Süpernatanı çıkarın, 500 μL %70 EtOH (moleküler biyoloji derecesi) ile yıkayın, tüpleri ters çevirin ve 4 ° C'de 18.000 x g'de 10 dakika döndürün.
  6. Son olarak, süpernatanı dikkatlice pipetleyerek ve açık reaksiyon tüplerini kağıt havluların üzerine bastırarak tamamen çıkarın.
  7. Peletin RT'de 10 dakika kurumasını bekleyin, ardından peleti 100 μL nükleaz içermeyen suda 37 °C'de 30 dakika çözün.
  8. DNA'nın konsantrasyonunu bir spektrometre ile ölçün. İzole genomik DNA, birkaç ay boyunca -20 ° C'de stabildir.

4. Şablon tanımanın gRNA ile doğrulanması (in vitro)

NOT: gRNA'lar tarafından başarılı şablon tanımayı doğrulamak için ilk yaklaşım olarak, çift sarmallı DNA'nın agaroz jel elektroforezi 40,61,62 ile ayırt edilebilen iki parçaya bölündüğü bir in vitro Cas9 reaksiyonu gerçekleştirin.

  1. Şablonu oluşturmak için, aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak hiPSC'den (bölüm 3) izole edilen genomik DNA üzerinde yüksek kaliteli bir PCR ana karışımı ve 10 μM primer ile bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin: 30 s, 40 döngü [98 °C, 10 sn; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 dakika] için 98 °C'de ilk denatürasyon ve 72 °C'de 5 dakika boyunca son uzama.
    1. Tavlama sıcaklığını PCR astarlarına göre ayarlayın. gRNA bağlanma bölgelerinin asimetrik lokalizasyonu ile amplikonun 800 bp ila 1.5 kb boyutunda olduğundan emin olun.
    2. PCR ürününü %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde jel elektroforezi ile çözün, ilgili bandı jelden kesin ve DNA'yı26 çıkarın.
    3. Ekstrakte edilen PCR ürününün DNA konsantrasyonunu bir spektrometre ile ölçün.
  2. 10 μM CRISPR RNA'yı (crRNA, özel dizi, 100 μM stok) ve 10 μM tracrRNA'yı (100 μM stok) nükleaz içermeyen çift yönlü tamponda (5 μL toplam hacim) birleştirerek fonksiyonel gRNA'yı birleştirin. Karışımı 95 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından oda sıcaklığına (RT) soğumaya bırakın.
  3. Ribonükleoprotein (RNP) kompleksini, step 4.2'den 10 μM gRNA'yı ve 1 μM Cas9 enzimini ( Streptococcus pyogenes'ten, 62 μM stokundan) RT'de 15 dakika boyunca RT'de (25 μL toplam hacim) PBS'de birleştirerek oluşturun.
  4. İn vitro sindirim reaksiyonunu gerçekleştirmek için, 1 μM RNP kompleksini (adım 4.3'ten itibaren) 0.1 μM DNA şablonu (adım 4.1'den PCR ürünü) ve 1x Cas9 nükleaz reaksiyon tamponu (200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA içeren; pH 6.5; -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir) karıştırın.
    1. 10 μL'lik son hacme kadar nükleaz içermeyen su ile doldurun.
    2. Reaksiyonu 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    3. 2 mg / mL Proteinaz K ekleyin ve DNA substratını Cas9 enziminden serbest bırakmak için 56 ° C'de 10 dakika daha inkübe edin. Sindirilmiş reaksiyon karışımını son analize kadar 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
      NOT: En iyi bölünme verimliliğini elde etmek için 10:1 molar oranında Cas9-RNP:DNA substratının kullanılması önerilir. Gerekirse PCR ürününü nükleaz içermeyen suda gerekli konsantrasyona seyreltin. Negatif bir kontrol olarak, gRNA veya Cas9 enziminden yoksun bir reaksiyon karışımı birlikte alınabilir.
  5. Parçalanmış ürünleri %2'lik bir agaroz jel üzerinde agaroz jel elektroforezi ile görselleştirin.
    NOT: İdeal olarak, iki farklı boyutta bant görünür olmalı ve verimli gRNA'lar için şablon bandı kaybolmuş veya güçlü bir şekilde azalmış olmalıdır (Şekil 1B).

5. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde gRNA fonksiyonunun doğrulanması

NOT: Kortikal organoidlerin üretileceği aynı hücre hattını hedefleyen gRNA'ların etkinliğinin test edilmesi önerilir26. Bunun için, ilgili gRNA'ları içeren RNP kompleksleri, bir GFP ekspresyon plazmidi ile hiPSC'lere birlikte transfekte edilir, hücreler 3 gün boyunca kültürlenir ve daha sonra dizileme analizi için genomik DNA izole edilir. Her gRNA testi için yaklaşık 200.000 hücre gereklidir. Hücreler %70-80'den fazla birleşik olmamalı ve çözüldükten sonra en az iki kez pasajlanmış olmalıdır. Negatif bir kontrol (gLACZ)36,63 ve sahte bir koşul (RNP'siz nükleofeksiyon çözeltisi) almak önemlidir.

  1. Bir hücre kültürü başlığındaki hücrelerin canlılığını artırmak için deneyden 2 saat önce hiPSC'nin ortamını ROCK inhibitörü (1: 1.000) içerecek şekilde değiştirin.
  2. 6 oyuklu bir plakanın uygun sayıda kuyusunu bir bazal membran matrisi ile kaplayın.
  3. Nükleofektör ünitesini başlatın (16 oyuklu şeritler için "X ünitesi") ve önceden programlanmış olarak "ES hücreleri, H9" programını seçin (darbe CB150). Şeridin uygun sayıda oyuğunu seçin.
  4. 24 μM crRNA ve 24 μM tracrRNA'yı Dubleks Tamponda birleştirerek RNP komplekslerini hazırlayın.
    1. 95 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından adım 4.2'de açıklandığı gibi RT'ye kadar soğumaya bırakın.
    2. Bu arada, Cas9 enzimini PBS'de 8 μM'ye seyreltin.
    3. 3 μL gRNA ve 3 μL Cas9'u birleştirin ve RNP'yi birleştirmek için RT'de 15 dakika inkübe edin.
      NOT: 3:1 gRNA:Cas9 molar oranı, optimum bölünme verimliliği sağlar. gRNA'ları bir çift olarak test etmek için, her RNP'yi ayrı ayrı hazırlayın ve sonunda her RNP'nin 1.5 μL'sini birleştirin.
  5. 15 dakikalık RNP inkübasyonu sırasında, hiPSC'yi bir hücre kültürü başlığı altında nükleofeksiyon için hazırlayın.
    1. Bazal membran kaplamasını, oyuk başına ROCK inhibitörü (1: 1.000) ve 1x Penisilin / Streptomisin ile takviye edilmiş 1.5 mL kök hücre ortamı ile değiştirin.
    2. Nükleofeksiyon çözeltisini, üreticinin talimatlarına uyarak buz üzerinde bir ana karışım olarak hazırlayın.
    3. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için (bölüm 2'de açıklandığı gibi) hiPSC'leri plakadan ayırın ve hücreleri bir Neubauer sayma odasında Tripan Mavisi boyamalı olarak sayın.
    4. gRNA çifti başına 200.000 canlı hücreyi 600 x g'da 5 dakika boyunca peletleyin.
  6. Hücre kültürü davlumbazında, buz üzerinde, 20 μL nükleofeksiyon çözeltisine 3 μL RNP artı 0.2 μg/μL pCAG-GFP plazmidi ekleyin.
  7. Peletlenmiş hücreleri son nükleofeksiyon karışımının 23 μL'sinde yeniden süspanse edin ve bunları buz üzerinde 16 oyuklu bir nükleofeksiyon şeridinin 1 oyuğuna aktarın.
  8. Tüm koşullar şeridin içine girdikten sonra, kaputun dışındaki nükleofektör makinesi X ünitesine yerleştirin ve nükleofection'ı başlatmak için Başlat düğmesine basın.
  9. Daha sonra, nükleofeksiyon şeridini hücre kültürü başlığının altına geri taşıyın ve şerit oyuklarını plakadan bir miktar ortamla durulayarak nükleofected hücreleri hazırlanan 6 oyuklu plakaya aktarın.
  10. HiPSC'yi 3 gün boyunca kültürleyin, günde 1x Penisilin / Streptomisin içeren ortamı değiştirin. 24 saat sonra, ROCK inhibitörüne artık ihtiyaç duyulmaz.
  11. Geleneksel bir floresan mikroskobu altında GFP sinyalini kontrol edin (Şekil 1C).
    1. 3. günde, GFP pozitif hücreleri floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması (FACS) ile sıralayın ve toplayın.
    2. Sıralama tamponunu PBS'de %2 FBS ile hazırlayın ve 4 °C'de tutun.
    3. Masa üstü santrifüjü 4 °C'ye soğutun. Buz üzerinde FACS sonrası hücrelerin toplanması için ROCK inhibitörü (1:1.000) içeren 50 μL ayırma tamponu ile 1.5 mL reaksiyon tüpleri ve buz üzerinde hücre süzgeç kapaklı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler hazırlayın.
    4. Çekirdekli hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını yapın.
    5. Hücreleri, numune başına ROCK inhibitörü (1: 1.000) içeren 1 mL kök hücre ortamında yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri ROCK inhibitörü (1: 1.000) ile 200 μL ayırma tamponunda yeniden süspanse edin, ardından canlı hücreleri FACS ile tanımlamak için 0.4 μL DAPI (2 ng / μL) ekleyin.
    7. Kalan hücre kümelerini çıkarmak için hücre çözeltisini soğutulmuş yuvarlak tabanlı tüplerin hücre süzgeç kapağından pipetleyin.
      NOT: DAPI zamanla hücre canlılığını tehlikeye atabilir ve bu nedenle, sıralamadan önce her numuneye taze eklemek en iyisidir.
    8. 10.000 canlı GFP pozitif canlı (DAPI-negatif) hücreyi, ROCK inhibitörü (buz üzerinde) içeren 50 μL ayırma tamponu ile önceden hazırlanmış 1.5 mL reaksiyon tüplerine sıralayın.
  12. FACS'tan sonra, sıralanmış hücrelerden doğrudan genomik DNA'yı çıkarın.
    1. Toplanan, sıralanan hücreleri sıralama arabelleğinde 600 x g'da 10 dakika boyunca döndürün.
    2. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 250 μL lizis tamponu artı numune başına 12.5 μL Proteinaz K içinde alın.
    3. Bölüm 3'te açıklandığı gibi devam edin.
    4. Son olarak, DNA peletini 50 μL nükleaz içermeyen suda çözün.
  13. Adım 4.1'de açıklandığı gibi Sanger dizilemesi için bir şablon oluşturmak üzere bir PCR gerçekleştirin. Bir kontrol olarak, gLACZ koşulundan elde edilen DNA'yı ve ilgilenilen geni hedefleyen primerleri kullanın (bölüm 4'te kullanılanla aynı primerler). Agaroz jel elektroforezinden uygun bantları çıkarın, bir sütun üzerinde saflaştırın ve Sanger dizilimi için gönderin.
  14. Sanger sıralama sonuçlarını ikili, genel hizalama kullanarak hizalayın.
    NOT: Başarılı hedefleme, gRNA bağlanma bölgesi etrafındaki rastgele eklemeler/silmelerden kaynaklanan üst üste binen sinyaller veya eksik dizilerle tanımlanabilir (Şekil 1D).

6. Dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin üretilmesi

NOT: İnsan kortikal organoidleri (hCO), daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi dilimlenmiş neokortikal organoid (SNO) yöntemine göre üretilir15,60.

  1. Bir inkübatörde 37 ° C'de 30-40 dakika inkübe ederek 1 mg / mL kollajenaz içeren 6 oyuklu bir plakanın 1 oyuğundan küçük hiPSC kolonilerini ayırın. Bu arada, bazal membran matrisi ile yeni bir 6 oyuklu plakayı kaplayın.
    1. Enzimi 1 mL kök hücre besiyeri ile durdurun ve kolonileri 15 mL'lik konik bir tüpte 5 mL kök hücre besiyerinde geniş delikli bir uçla toplayın.
      NOT: "Geniş delikli pipet uçları"ndan bahseden herhangi bir adım, en az 2 mm çapında bir açıklığa kadar kesilmiş uçlarla da gerçekleştirilebilir.
    2. Koloniler dibe çöktüğünde, eski besiyerini çıkarın ve onu taze kök hücre besiyeri ile değiştirin.
    3. Geniş delikli bir uç kullanarak, kolonileri, oyuk başına 1,5 mL kök hücre ortamı ile kaplanmış 6 oyuklu plaka üzerine eşit olarak dağıtın.
    4. HiPSC'yi standart koşullar altında 2-3 gün boyunca kültürleyin.
  2. hiPSC kolonilerinin çapı yaklaşık 1,5 mm'ye ulaştığında, 37 ° C'de 1 saate kadar inkübe ederek tüm kolonileri 1 mg / mL kollajenaz ile tekrar ayırın.
    1. Enzimi 6 mL ön beyin ortamı 115 ile durdurun ve geniş delikli uçlar kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpte ayrılmış kolonileri toplayın.
    2. Koloniler yerleştikten sonra, eski ortamı çıkarın ve 5 mL ön beyin ortamı 1 ile yıkayın.
    3. Son olarak, kolonileri geniş delikli uçlara sahip oyuk başına 3 mL ön beyin ortamı 1 içeren ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmalarına izin verin. Bu adım, insan kortikal organoid protokolünün 0. gününü gösterir. Bundan sonra,yayınlanan 15 protokolü takip edin.
  3. 7. günde, EB'leri "çerez" başına yaklaşık 20 EB ve ön beyin ortamında 1 hafta boyunca kültür olacak şekilde bir bazal membran matrisine gömün 2 15. 14. günde, organoidleri matristen mekanik olarak serbest bırakın ve 120 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde ön beyin ortamı 315'te 6 oyuklu ultra düşük bağlantı plakalarında kültürlemeye devam edin.
  4. 35. günden itibaren, ortama %1 v/v bazal membran matrisi eklenir.
  5. 6. haftada, organoidleri %3 düşük erime noktalı agaroza gömün ve bir vibratom üzerinde 500 μm kalınlığında dilimler halinde kesin (Şekil 2A, B), bu da organoidler boyunca oksijen ve besin tedarikini destekler. Gerekirse, organoidlerin dilimlenmesini her 4 haftada bir tekrarlayın.
  6. 70. günden itibaren, ön beyin ortamında kültür organoidleri 415.

7. Dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu

NOT: İnsan kortikal organoidleri, ventrikül benzeri yapılar görünür hale gelir gelmez, kabaca 2. haftadan itibaren enjekte edilebilir ve elektropore edilebilir. Daha sonraki evre organoidler için (5. hafta ve üstü), elektroporasyon en verimlidir ve prosedür organoidlerin dilimlenmesinden 2 gün sonra yapıldığında hücrelerin canlılığı en iyisidir26,55. Dilimlemeden sonra, ventrikül benzeri yapıların tanımlanması kolaydır, bu da enjeksiyon prosedürüne yardımcı olur (Şekil 2C, D). Ayrıca, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra bir süre kısmen açık kalır ve fazla enjeksiyon solüsyonunun kaçmasına izin verir, bu da ventrikülleri kaplayan adherens bağlantı kayışının bütünlüğünü korur. Dilimleme zamanlaması, deneysel zaman çizelgesiyle eşleşecek şekilde kaydırılabilir. Uzun süreli kültürler için dilimleme her 3-4 haftada bir tekrarlanmalıdır.

  1. Aşağıdaki ayarlarla bir mikrokılcal çektirmeye enjeksiyonlar için borosilikat cam kılcal damarları çekin: P 500, ısı 600, çekme 30, hız 40, zaman 1. Kılcal damarları sabitleme için bant kullanarak büyük bir Petri kabında saklayın.
  2. Elektroporasyon gününde, CRISPRR / Cas9 RNP kompleksini adım 5.4'te açıklandığı gibi 24 μM RNP'lik bir nihai konsantrasyon ile taze olarak hazırlayın. 0.1 μg/μL pCAG-GFP plazmidinin (veya başka herhangi bir floresan raporlayıcının) ko-elektroporasyonu, elektroporasyonlu hücrelerin tanımlanmasını destekler. Ek olarak, son enjeksiyon karışımına su içinde% 0.1 Fast Green çözeltisi ekleyin, bu da karışımın başarılı bir şekilde teslim edildiğinin doğrulanmasını sağlar.
    NOT: İlgilenilen her gen ve gLACZ kontrolü için ayrı karışımlar yapın.
  3. Tyrode çözeltisini (bir paket Tyrode tuzu, 1 g NaHCO3, 13 mL 1 M HEPES pH 7.25 in 1 L dH2O) 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. Kalan Tyrode solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 °C'de saklayın.
  4. İyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılara sahip hCO'yu seçin (Şekil 2E) ve ventrikül benzeri yapılar göstermeyen organoidleri atın (Şekil 2F). Tyrode solüsyonunu içeren 6 cm'lik bir Petri kabına 10 adede kadar organoid aktarın ve kalan hCO'ları inkübatörde tutun.
  5. Bir mikro yükleyici pipet ucu yardımıyla bir cam mikrokıl damarı 10 μL enjeksiyon solüsyonu ile doldurun ve ince ucunu cımbızla sıkıştırarak kılcal damarı açın. Tyrode çözeltisine bir miktar enjeksiyon karışımı bırakarak kılcal damarın açık olup olmadığını kontrol edin. Enjeksiyonları bir mikroenjektör ile bir ayak pedalı ile kontrollü geçit ile sürekli bir ayarda gerçekleştirin.
  6. Kılcal damarı ventrikül benzeri yapıların merkezine yerleştirin (Şekil 2C) ve ayak pedalına basarak karışımın 0.2-0.5 μL'sini enjekte edin.
    NOT: hCO başına en fazla 5 ventrikül enjekte edilebilir ve replike başına toplam 7-8 hCO işlenir. İdeal olarak, hCO'nun dışına bakan ventriküller hedeflenmelidir, çünkü bunlar genellikle en iyi gelişmiş olanlardır (Şekil 2G, H).
  7. Hareketi kısıtlamak için organoidi itmek için ince forseps kullanın. Aslında organoidleri tutmayın (Şekil 2C).
  8. Enjeksiyondan sonra, 1-2 organoidi Tyrode solüsyonu içeren bir elektroporasyon odasına aktarmak için geniş delikli bir pipet ucu kullanın (Şekil 2C, D).
  9. Enjekte edilen organoidleri elektrotlara doğru yönlendirin, böylece organoidin dışına bakan ventrikül benzeri bölgelerdeki apikal radyal glia hedeflenir.
  10. Kabloları, organoidin enjekte edilen tarafı pozitif kutba bakacak şekilde elektroporasyon odasına takın (anot; Şekil 2D).
  11. 38 sn aralıklarla her biri 50 ms boyunca 1 V'luk beş darbeyle elektroporasyon yapmak için elektroporatör makinesinin Darbe düğmesine basın.
    NOT: Elektroporasyon ayarları mevcut elektroporatörüne bağlı olabilir ve optimize edilmesi gerekebilir.
  12. İstenilen sayıda organoid işlenene kadar enjeksiyon ve elektroporasyon adımlarını tekrarlayın.
  13. Aynı durum için tüm numuneler işlenene kadar elektroporasyonlu organoidleri RT'de bir ortamda toplayın. Toplamda 30 dakikadan fazla kuluçka makinesinin dışında olmadıklarından emin olun.
  14. Daha sonra, elektroporasyonlu hCO'ları uygun kültür ortamına geri koyun ve ilk 24 saat boyunca sallamadan kültürleyin.
    NOT: 2-3 gün sonra, GFP sinyali, bir floresan stereoskop altında elektroporasyonlu hCO'larda görünür olmalıdır (Şekil 2H). Elektroporasyondan sonraki analiz zaman noktası, cevaplanacak biyolojik soruya bağlı olarak seçilmelidir. 3-7 gün sonra, GFP pozitif hücreler VZ, SVZ ve CP15,60 boyunca bulunur.

8. Elektroporasyonlu insan kortikal organoidlerinin fiksasyonu ve kriyoseksiyonu

  1. Elektroporasyonlu organoidleri 2 mL'lik bir reaksiyon tüpünde RT'de 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
    DİKKAT: PFA toksik ve kanserojendir. Çeker ocak altında PFA içeren tüm adımları gerçekleştirin. Nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
  2. PBS'de bir kez 5 dakika yıkayın ve doku sükroz ile tamamen dolana kadar steril filtreli% 30 sükroz içinde PBS'de 4 ° C'de saklayın.
  3. Donmuş doku örneği için bir gömme ortamına sabit organoidleri ve kuru buz üzerindeki bloklar halinde PBS'de% 15 sükroz gömün.
  4. Bir kriyostatta 20-30 μm'lik kesitler hazırlayın ve dokuyu yapışkan slaytlar26,64 üzerinde toplayın.
    NOT: Protokol, sabit organoidler sakaroz içinde olduğunda (birkaç ay boyunca 4 ° C'de stabil) veya bir gömme ortamına gömüldükten sonra duraklatılabilir (donmuş bloklar birkaç ay ila yıl boyunca -20 ° C'de hava geçirmez torbalarda saklanabilir).

9. Elektroporasyonlu insan kortikal organoidlerinin immünohistokimyasal analizi

  1. İmmünohistokimyasal analiz26,64 için, bir su banyosunda 70 ° C'de 1 saat boyunca sitrat tamponunda (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 polisorbat 20 dH2O, pH 6.0) antijen alımı gerçekleştirin.
  2. PBS'de bir kez 5 dakika yıkayın, ardından slaytları kısa bir süre kurulayın ve bölümleri bir balmumu kalemiyle daire içine alın.
  3. RT'de 30 dakika boyunca PBS'de (pH 7.4) 0.1 M glisin kullanarak söndürün ve ardından her biri 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Bölümleri bloke edici tamponla örtün (% 10 at serumu,% 0.1 Octoxinol 9 PBS'de) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Birincil antikorları bloke edici tamponda hazırlayın ve gece boyunca 4 ° C'de bölümler üzerinde inkübe edin.
  6. Ertesi gün, her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın, RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda ikincil antikorlar ve DAPI ile inkübe edin ve her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez tekrar yıkayın.
  7. Slaytları montaj ortamına monte edin ve görüntüyü bir floresan mikroskobunda görüntüleyin (Şekil 3).
    NOT: Doğal sinyal genellikle fiksasyondan sonra söndürüldüğünden, hedeflenen hücreleri tanımlamak için enjeksiyon karışımında kullanılan florofora karşı bir antikor eklenmesi önerilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi immünofloresan boyama için kullanılan antikorlar ve boyalar Tablo 1'de listelenmiştir.

10. Protein seviyesinde CRISPR/Cas9 aracılı nakavtın doğrulanması

  1. Protein seviyesindeki nakavtı doğrulamak için, elektroporasyonlu organoidler üzerinde hedef protein için immünohistokimya yapın (Şekil 3I).
  2. Floresan yoğunluğunun karşılaştırılmasına izin vermek için aynı ayarları kullanarak hem gLACZ kontrolünü hem de hedeflenen organoidleri görüntüleyin (Şekil 3I, J). Gelişmekte olan neokorteksin farklı hücre tipleri üzerindeki etkisini karşılaştırmak için bunu bölgeye özgü bir şekilde yapın. ImageJ/Fiji'de (eklenti Hücre Sayacı) veya StarDist eklentisi65 kullanarak segmentlere ayırarak hücreleri sayın.

Sonuçlar

CRISPR/Cas9 aracılı gen ablasyonu, gRNA'ların tasarımını gerektirir. Genel olarak, ilgilenilen bir genin ilk ekzonlarından birini, 7-11 bp aralıklı bir çift gRNA ile hedeflemek (3 bp'nin katlarından kaçınarak) iyi sonuç verir (Şekil 1A). İlk test olarak, gRNA'lar tarafından şablon tanımanın etkinliği, bir PCR şablonu 26,40,62 kullanılarak in vitro olarak sorgulanabilir. Etkili hedefleme ve Cas9 aracılı kesme, şablon DNA'nın indirgenmesinde ve parçalanmış DNA ürünlerinin bir agaroz jel üzerinde görünümünde görülebilir (Şekil 1B). Kortikal organoid üretimi için kullanılan iPSC hattında daha fazla gRNA testi yapılabilir. Bu, başarılı floresan raportör ekspresyonu ile görselleştirilebilen iPSC'lerin nükleofeksiyonunu gerektirir (Şekil 1C). İlgilenilen lokusun verimli bir şekilde hedeflenmesi, Sanger dizilemesi ile doğrulanabilir, bu da hedefleme bölgesinin etrafında aniden biten veya üst üste binen bir kromatogram ile sonuçlanır (Şekil 1D), homolog olmayan uç birleştirme66 ile çift iplikli kopma onarımından elde edilen bir indel spektrumundan kaynaklanır. İn vitro ve iPSC hücrelerinde kılavuz RNA verimlilik testleri, kortikal organoidlerde gen ablasyonu için verimli gRNA çiftlerinin seçimine yardımcı olur.

Elektroporasyondan önce, kortikal organoidler dilimlenir, bu da elektroporasyon karışımının enjeksiyonu için ventrikül lümenlerinin tanımlanmasını destekler (Şekil 2A-C). Enjekte edilen organoidler daha sonra elektroporasyon odasına aktarılır (Şekil 2D). Elektroporasyon için iyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılara sahip kortikal organoidler kullanılmalı (Şekil 2E), görünür yapıları olmayan kortikal organoidler atılmalıdır (Şekil 2F). Elektroporasyon karışımı, prosedür sırasında enjekte edilen ventriküllerin görselleştirilmesine izin veren bir boya içerir (Şekil 2G). Kültürde 1-3 gün sonra, başarılı bir şekilde hedeflenen ventriküller, floresan mikroskop altında doğal GFP sinyali ile görülebilir (Şekil 2H).

Derinlemesine histolojik analiz için kriyoseksiyonların immünohistokimyası yapılabilir. İdeal olarak, elektroporasyonlu kortikal organoid içinde çoklu hedefli ventriküller bulunur (Şekil 3A,B). En optimal elektroporasyonlar, organoidin dışarıya bakan dış bölgesindeki ventrikül benzeri yapıları hedefler (Şekil 3C), çünkü bunlar tipik olarak en genişlemiş ventriküllerdir. Bazı durumlarda, elektroporasyon aşırı hücre ölümüne yol açabilir (Şekil 3D, E), örneğin, plazmit konsantrasyonları çok yüksek olduğunda veya elektroporasyon ayarları yetersiz olduğunda. Organoidin iç kısmına bakan elektroporasyonlar (Şekil 3F) genellikle ventrikül benzeri yapıların dış kısımlarına kıyasla daha az genişlemiş bölgelerini içerir. Deneyimlerimize göre, değişkenliği azaltmak için kantitatif analizin organoidin tanımlanmış bölgelerine odaklanmak faydalı olacaktır. Bazen, elektroporasyon apikal yüzeyin bozulmasına neden olabilir (Şekil 3G), örneğin, enjeksiyon hacmi çok yüksek olduğunda, ventriküllerin yırtılmasına neden olduğunda veya elektrik darbeleri çok güçlü olduğunda, hücre delaminasyonuna yol açabilir. Son olarak, iki bitişik ventrikül hedeflendiğinde (Şekil 3H), kortikal bölgelerin sınırlarını ve hedeflenen hücrelerin kökenini atamak zor olabilir.

İmmünohistokimya, ilgilenilen hücrelerde protein seviyesinde başarılı CRISPR / Cas9 aracılı nakavtı doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 3I), burada Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) proteini PCGF467'yi hedefleyerek örneklenmiştir. Sinyal yoğunluğu, deneysel koşullara karşı kontrol koşullarında GFP pozitif hücrelerde analiz edilebilir (Şekil 3J). Alternatif olarak, uygun bir antikor mevcut değilse, hedeflenen hücreler FACS ile kortikal organoidlerden60 izole edilebilir ve Sanger veya Yeni Nesil Dizileme36 ile daha fazla analiz edilebilir. Ayrıca, protein seviyelerinin azaltılması Western blotlama kullanılarak da analiz edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Akut CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı için kılavuz RNA tasarımı ve doğrulaması. (A) İlgilenilen bir genin eksonunu hedefleyen iki gRNA ile kılavuz RNA (gRNA) tasarım stratejisinin şematik gösterimi. Siyah oklar, gRNA validasyonu için kullanılan şablon hazırlama için PCR primerlerini gösterir. (B) gRNA verimliliğinin in vitro olarak doğrulanması. PCR ile güçlendirilmiş şablonlar RNP kompleksleri ile sindirildi. Başarılı bir bölünmeden sonra, jel elektroforezinden sonra farklı boyutlarda iki bant görünür (solda), oysa düşük verimli gRNA'lar için şablon kesilmeden kalır (sağda). (C) RNP kompleksi ve bir GFP plazmidi ile nükleofeksiyondan 3 gün sonra insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) parlak alan görüntüsü (solda), GFP floresansı (ortada) ve birleştirilmiş görüntüleri (sağda). Ölçek çubukları: 350 μm. (D) GFP pozitif hücrelerden amplifiye edilmiş DNA'nın Sanger dizilimi ile hiPSC'lerde gRNA verimliliğinin doğrulanması. Çift sarmallı DNA'nın başarılı bir şekilde bölünmesi üzerine, dizileme izleri, gRNA hedef bölgesinden (üstte, KO1) başlayan üst üste binmiş sinyalleri gösterir. Başarısız hedefleme durumunda, DNA dizisi izi, LACZ kontrolüne kıyasla değişmeden kalır (altta, KO2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu. (A) İnsan kortikal organoidlerinin (hCO'lar) elektroporasyonu için iş akışını gösteren şematik çizim. İlk olarak, hCO'lar 500 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayrılır. İki gün sonra, bir GFP ekspresyon plazmidi ve Fast Green içeren RNP karışımı, tercihen hCO'ların dış bölgesinde, ventrikül benzeri yapıların lümenlerine enjekte edilir. Elektroporasyon için, hCO'lar elektroporasyon odasına yerleştirilir. Birkaç günlük kültürden sonra, elektroporasyonlu alanlarda bir GFP sinyali tespit edilebilir. (B) HCI'lerin vibratom kesit alma görüntüleri. Organoidler, bir blokta (solda) bir ortamda% 3 düşük erime noktalı agaroz içine gömülür. Blok, 500 μm kalınlığında dilimler halinde (ortada) bölümlere ayrılır. Dilimlenmiş organoidler, geniş delikli bir pipet ucu (sağda) ile kültür kabına geri aktarılır. (C) RNP, PCAG-GFP ve% 0.1 Fast Green içeren karışımın organoidlerin ventrikül benzeri yapılarına enjeksiyonunu gösteren görüntüler. Organoidler Tyrode'un çözeltisine batırılır ve ince cam kılcal damar, ventrikül benzeri yapıların merkezinin lümenine yerleştirilir (solda). Forseps, organoidleri (sol ve orta) stabilize etmek için kullanılır. Organoidlerin dışındaki ventriküller hedeflenir (ortada). Enjekte edilen organoidler, geniş delikli pipet uçları (sağda) ile elektroporasyon odasına veya daha sonra kültür kabına aktarılır. (D) Bir cam Petri kabı ve cama yapıştırılmış iki metal bıçaktan oluşan elektroporasyon odasının görüntüleri. Metal bıçaklar elektrot görevi görür ve elektroporatöre bağlanmak için kabloları bağlamak için delikler içerir. Yeşil bir gölgeden görülebilen hCO'nun enjekte edilen tarafı anoda (pozitif kutup, kırmızı kablo) (sağda) bakmalıdır. (E) İyi gelişmiş ventrikül benzeri yapıları gösteren hCO'ların temsili görüntüleri. Daha hafif halka, ventriküler bölge benzeri alanı temsil eder. Ventrikül benzeri yapının ortasındaki daha koyu daire lümeni temsil eder ve enjeksiyon için hedeflenmelidir. (F) Daha sonraki deneyler için dahil edilmemesini önerdiğimiz, iyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılardan yoksun hCO'ların temsili görüntüleri. (G) Elektroporasyon karışımının enjeksiyonundan sonra, hedeflenen alanların Hızlı Yeşil (turuncu oklar) ile görülebildiği hCO'ların temsili görüntüleri. (H) Elektroporasyondan 24 saat sonra doğal GFP sinyalini gösteren hCO'nun temsili görüntüsü. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Elektroporasyonlu dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin immünohistokimyasal analizi. (A) Yeşil floresan sinyalli elektroporasyonlu bir insan kortikal organoidini (hCO) temsil eden şematik. (B) Elektroporasyondan 7 gün sonra, çoklu elektroporasyonlu ventriküllü kriyoseksiyonel bir hCO'nun GFP (yeşil) için DAPI boyaması (gri) ve immünofloresansı. (C-H) GFP (yeşil) ve çekirdekler (DAPI, gri) için boyanmış farklı elektroporasyon sonuçlarının örnek görüntüleri. (C) Sağlam çekirdekler (bkz. ek 1, D), bozulmamış ventrikül benzeri bir yapı ve organoidin dışına bakan alanda genellikle en çok genişlemiş olan elektroporasyonlu hücreler ile optimal bir elektroporasyon. (E) Küçük, DAPI yoğun ve çarpık çekirdeklerle karakterize edilen, elektroporasyonlu alanda büyük hücre ölümü gösteren hCO örneği (ayrıca bkz. ek 2, D). (F) Organoidin içine doğru yönlendirilen başarılı bir elektroporasyon, bitişik ventriküllerle birleşen kortikal plaka benzeri alanlar nedeniyle yorumlanması genellikle daha zordur. (G) Elektroporasyonlu alanın merkezinde bozulmuş ventrikül benzeri yapılar (turuncu ok). (H) Kısmen birleşmiş ve bu nedenle ölçülmesi zor olan çok sayıda küçük ventrikül içeren bir hCO örneği. (I) CRISPR / Cas9 aracılı nakavt için LACZ (gLACZ KO, solda) veya PCGF4'ü (gPCGF4 KO, sağda) hedefleyen bir RNP kompleksinin elektroporasyonundan 7 gün sonra GFP (yeşil) ve PCGF4 (macenta) için DAPI boyama (gri) ve immünofloresan . Daire içine alınmış hücreler, başarılı gen ablasyonunu gösteren PCGF4'ün azaltılmış yoğunluğunu vurgular. LACZ kontrolünde (solda) tek tip bir sinyal görülebilir. (J) Grafik, kontrol için GFP pozitif hücrelerde immünofloresan sonrası niceliksel PCGF4 yoğunluğunu (gLACZ KO) ve gLACZ koşulundaki medyan PCGF4 ekspresyonuna göre PCGF4'ün KO'sunu (gPCGF4 KO) gösterir. Her nokta bir hücreyi temsil eder. Aynı hiPSC hattının iki farklı partisinden (gri ve siyah) 3-4 organoidden elde edilen veriler. p < 0.0001, Mann-Whitney testi. Tüm görüntüler lazer taramalı konfokal (B, C) veya floresan (E-I) mikroskop ile elde edildi. Görüntüler, 10-15 μm kalınlığındaki z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını temsil eder. Beyaz kesikli çizgiler, ventrikül lümenine bakan apikal yüzeyi ve hCO'ların dış yüzeylerini gösterir. Turuncu kesikli çizgiler, birleştirilmiş ventriküllerdeki VZ/SVZ sınırını gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antikor/BoyaSeyreltme
Tavuk anti-GFP1:2,000
Fare anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavuk1:1,000
Alexa Fluor 555 Eşek Anti-Tavşan1:1,000
DAPI (DAPI)1 mg/mL stok; 1:1,000

Tablo 1: İmmünofloresan boyama için kullanılan antikorların ve boyaların listesi ve bunların seyreltilmesi.

Tartışma

İnsan serebral ve kortikal organoidleri, insan neokorteks gelişimini araştırmak için anahtar modeller haline gelmiştir 7,16,17. İnsan hastalıklarının modellenmesi için, izojenik hiPSC çizgileri ve organoidler altın standarthaline gelmiştir 68. Bununla birlikte, yeni iPSC hatlarının oluşturulması zaman alıcı ve maliyetli olduğundan, gen fonksiyonu çalışmaları için kortikal organoid modellerin akut manipülasyonu yaygın olarak uygulanmaktadır.

Serebral ve kortikal organoidlerin 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 elektroporasyonunun uygulanması kolaydır ve fonksiyonel çalışmalar için geleneksel olarak hayvan modellerini kullanan birçok laboratuvar gerekli araçlarla donatılmıştır. İn vivo enjeksiyon için, lateral ventriküller tipik olarak 34,36,37,39,40,41,42 hedeflenir. Bunlar, aynı şekilde enjekte edilebilen merkezi bir lümene sahip ventrikül benzeri yapılar tarafından kortikal organoidlerde modellenmiştir. Kortikal organoidlerin elektroporasyonu öncelikle ventrikülleri kaplayan hücrelerin uç ayaklarını, tipik olarak apikal radyal glia69'u hedefler. Hedefleme verimliliği deneyler arasında değişir, ancak tipik olarak, 3-7 günlük elektroporasyondan sonra organoid başına birkaç 100 ila 1.000 GFP pozitif hücre elde edilebilir. İnsan nöral progenitör hücrelerinde hücre döngüsünün süresi, apikal radyal glia'nın hücre döngüsü uzunluğunun 14 saat ve bazal progenitör hücrelerin 23 saat70 olduğu fareye kıyasla kabaca iki kat daha uzundur. Bu nedenle, 3 gün sonra, esas olarak apikal radyal glia ve ara progenitör hücreler GFP pozitifken, GFP pozitif hücreler 7 gün sonra tüm bölgelere dağılır. GFP sinyali, elektroporasyondan birkaç ay sonra hala gözlemlenebilir, GFP-pozitif hücreler esas olarak organoid boyunca dağılmış nöronları temsil eder ve bu da tek tek hücrelerin morfolojisini analiz etmemize olanak tanır. Ventrikülü kaplayan nöral progenitör hücrelerin hedeflenmesi, ventrikül benzeri bölgelerin parlak alan mikroskobu altında tanımlanabildiği aşamalarda mümkündür. Mevcut protokol15'te bu, kortikal organoid gelişiminin 2. haftasından 12. haftasına kadar mümkündür, bu noktadan sonra ventriküller küçülür ve artık görünmez. Deneyimli bir deneyci için, bir seansta 50-80 organoid enjekte etmek mümkündür.

Apikal radyal glia dölleri, hücre bölünmesi sırasında gen manipülasyon reaktiflerini miras alırken, nöronlar ve astrositler gibi olgun hücrelerin doğrudan hedeflenmesi standart elektroporasyon yaklaşımıyla mümkün değildir. Bunun yerine sinir sistemindeki postmitotik hücrelere viral hedefleme yöntemleri uygulanmıştır33,71. Özellikle, rekombinant adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler), yüksek verimlilikle terminal olarak farklılaşmış hücrelerin üretilmesi ve dönüştürülmesi kolay olduğu için sinir sisteminde gen transferi için yaygın olarak kullanılmaktadır71. Ayrıca, AAV'ler belirli nöronal alt popülasyonlara hedeflenebilir. Adeno, Sendai ve lentivirüslerin kullanımı da dahil olmak üzere farklı viral hedefleme yaklaşımları, serebral ve kortikal organoidlerde zaten uygulanmıştır 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Serebral organoid protokollerdeki bir sınırlama, sınırlı oksijen ve besin kaynağı nedeniyle nekrotik bir çekirdeğin gelişmesidir. Organoid merkezinde hücre canlılığını iyileştirmek için, eğirme biyoreaktörlerinde organoidlerin kültürü 14,54, endotel hücrelerinin ko-kültürü veya vaskülarizasyonu modellemek için biyomühendislik yaklaşımları75,76, kemirgen modellerine organoid nakli 18,77 ve organoidlerin dilimlenmesi15,47 dahil olmak üzere çeşitli stratejiler uygulanmıştır. Burada, organoid çekirdekte azalmış hipoksi gösterdiği ve ventrikül benzeri yapıların ve kortikal plaka benzeri bölgenin genişlemesini desteklediği gösterilen dilimlenmiş insan kortikal organoid protokolünü kullandık15. Ek olarak, serebral organoidlerin dilimlenmesi, subventriküler bölgede bulunan bazal radyal glia'nın canlı görüntülenmesi için de faydalıdır ve hücre kaderi karar haritalarının oluşturulmasına izin verir72. Benzer şekilde, nöronal sağkalımı ve aksonal büyümeyi destekleyen hava-sıvı arayüzünde kültürlenen dilimlenmiş serebral organoidleri incelemek için canlı görüntüleme kullanıldı47. İnsan kortikal organoidlerinin dilimlenmesinin, bu organoid modelleri özellikle elektroporasyona uygun hale getirdiğini, çünkü ventrikül benzeri yapıların dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğini bulduk. Kortikal organoidlerin elektroporasyonu, klasik olarak gen aşırı ekspresyonu için ve daha yakın zamanda tüm plazmit kütüphanelerinin55 verilmesi için kullanılan DNA plazmitlerinin ve gen fonksiyonunun inaktivasyonu için CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarının26 eklenmesini sağlar.

CRISPR / Cas9 teknolojisi, 56,57,58,63,66 gen fonksiyonunun araştırılmasında devrim yarattı. Bu protokolde, insan kortikal organoidlerinde akut gen inaktivasyonu için gRNA/Cas9 ribonükleoprotein komplekslerinin36 uygulamasını ana hatlarıyla belirttik. gRNA verimliliğinin ilk doğrulaması, önce bir test tüpünde ve ikincisi iPSC'lerde in vitro olarak gerçekleştirildi. Bu basit ilk testlerin, özellikle çalışan antikorların yokluğunda, umut verici gRNA çiftlerinin seçimine yardımcı olduğunu bulduk. CRISPR / Cas9 aracılı gen nakavt için giderek daha fazla araç karakterize edildikçe, ilk doğrulama adımları gelecekte atlanabilir. iPSC'lerden izole edilen hedeflenen DNA bölgelerinin Yeni Nesil Dizilemesi daha kantitatif ve daha yüksek bilgi içeriğine sahipken, Sanger dizilemesinin gRNA'ların ön taraması sırasında genellikle çok daha hızlı sonuçlar sunabildiğini bulduk. Sonuç olarak, kortikal organoidlerde verimli CRISPR / Cas9 düzenlemesinin doğrulanması ve ilgili hücrelerdeki protein seviyelerinin azaltılması, başarılı CRISPR / Cas9 aracılı gen ablasyonunun en kesin kanıtıdır.

Dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu, kazanç ve fonksiyon kaybı çalışmaları için akut genetik manipülasyona, hücre morfolojisinin ve nöronal aksonların görselleştirilmesine, tarama yaklaşımları ve büyük paralel raportör tahlilleri için plazmit kütüphanelerinin verilmesine, canlı görüntüleme için hücrelerin etiketlenmesine ve epigenom düzenleme araçlarının verilmesine olanak tanır. Bu nedenle, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu, insan kortikal gelişimi, nörogelişimsel bozukluklar ve kortikal evrim hakkında mekanik içgörüleri ortaya çıkarabilen güçlü bir yöntemdir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Sağlanan olağanüstü destek için CRTD ve Dresden Concept ortaklarına, özellikle Kök Hücre Mühendislik Tesisi'ndeki K. Neumann ve ekibine, Işık Mikroskobu Tesisi'ndeki H. Hartmann ve ekibine, Akış Sitometri Tesisi'ndeki A. Gompf ve ekibine ve elektroporasyon odalarının inşası için MPI-CBG atölyesinden Hartmut Wolf'a minnettarız. Joshua Schmidt'e el yazması hakkındaki geri bildirimi için teşekkür ederiz. MA, TU Dresden Rejeneratif Tedaviler Merkezi, DFG (Emmy Noether, AL 2231 / 1-1) ve Schram Vakfı'ndan fon sağladığını kabul eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL PP Santrifüj Tüpleri, konikCorning430791
4D-Nükleofektör ÇekirdekÜnitesi Lonza
4D-Nükleofektör XÜnitesi Lonza
5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüpCorningFalcon 352235
6 oyuklu plaka, nunclon ile muamele edilmişhiPSC için Thermo Fisher140675 kültür
6 oyuklu plaka, ultra düşük bağlantıCorning3471Organoid kültür
için A83-01KÖK HÜCRE Teknolojileri72022Ön beyin ortamı 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Hava kompresörüAerotec
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavuk IgY (IgG) (H + L)Jackson İmmüno Araştırma703-545-155İkincil antikor, RRID: AB_2340375; seyreltme 1:1000
Alexa Fluor 555 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)İnvitrojenA-31572İkincil antikor, RRID: AB_162543; seyreltme 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolEntegre DNA teknolojileriÖzel tasarım (2 nmol olarak sipariş edil)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAEntegre DNA teknolojileri10725325 nmol
Alt-R Sp HiFi Cas9 Nükleaz V3Entegre DNA teknolojileri1081060100 ve mikro; g, Streptococcus pyogenes
Amfoterisin B'den (Mantar Zonu)Gibco15290018Ön beyin ortamı 2, 3 ve 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
Anti-GFP primer antikoru (tavuk, poliklonal)Abcamab13970RRID: AB_300798; seyreltme 1:2000
Anti-PCGF4 primer antikoru (fare, monoklonal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; seyreltme 1:300
ApoTome floresan mikroskobuZeiss
Askorbik AsitSigma Aldrich1043003Ön beyin ortamı 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup >
B27 takviyesi (+ A vitamini)Gibco17504044Ön beyin ortamı 3, 4 nbsp;   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Muz - Micrograbber Kablo KitiHarvard Aparatı BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR makinesi)Analytik Jena846-2-070-723
Kılcal damarlar, filamentli borosilikat cam, OD 1,2 mm; İç çap 0,69 mm; 10 cm uzunlukBilim ÜrünleriBF120-69-10Belirli bir kalınlığa çekilmesi gerekiyor
CHIR-99021KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ72052Ön beyin ortamı 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
Kollajenaz Tip IVGibco17104019
CRTDi004-ACMCB DD'deki Kök Hücre Mühendislik Tesisihttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ASağlıklı donör DAPI Roche'dan tek hücreli uyarlanmış hiPSC hattı
10236276001 1 mg / mL stok, IF Dibutiril-cAMP için seyreltilmiş 1:1000 kullanın
KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ73884Ön beyin ortamı 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) < sup>15< / sup>
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM / F-12, HEPESFisher Scientific31330095Ön beyin ortamı 1, 2 ve 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorfinKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ72102Ön beyin ortamı 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Forseps, straigth, 11 cmGüzel Bilim Araçları11295-51
ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon SistemiHarvard Aparatı BTX45-2052
EtanolSigma Aldrich32205-1L-M
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Hızlı Yeşil FCF SigmaAldrichF7252
Fetal Sığır Serumu (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Alevli/Kahverengi Mikropipet ÇektirmeSutter Instrument Co.P-97Mikro kılcal damarların çekilmesi için
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware sürüm 2024.0.5
gLACZ>Kalebic ve diğerleri, 2016; Platt ve diğerleri, 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; altı çizili nükleotidler = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1bu kağıt5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (Şekil 3I+J'deki KO görüntülerine karşılık gelir)
gPCGF4 KO2bu kağıt5'-ACAAATAATAATACTTGCTGG (KO'ya karşılık gelir) Şekil 3I+J)
EvdeHEPES1 M stok
At Serumu, ısıyla inaktive edilmişGibco26050088
İnsan GDNF Rekombinant ProteinThermo Fisher450-10Ön beyin ortamı 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
İnsan / Fare / Sıçan BDNF Rekombinant ProteinThermo Fisher450-02Ön beyin ortamı 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Hidroklorik asit (HCl)Sigma Aldrich258148TrisHCl
ImmEdge (balmumu) yapmakKalem Vektör LaboratuvarlarıH-4000
İnsülin çözeltisi insanSigma Aldrich  I9278Ön beyin ortamı 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
İzopropanolFisher ScientificBP2618-1
Nakavt Serum DeğiştirmeGibco 10828-010Ön beyin ortamı 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Lazer Taramalı Konfokal 980 MikroskopZeiss
Düşük Erime Noktalı Agaroz, vibratomkesitleme sırasında hCO'ların gömülmesi içinThermo Fisher16520100
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV içermeyenCorning354230Organoid kültür için
Matrigel hESC Nitelikli Matris, LDEV içermeyenCorning354277hiPSC kültürü için
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Mikroenjektör PicoPump + Ayak PedalıDünya Hassas AletlerSYS-PV820
Mikro Yükleyici Pipet Uçları 0,5 ila 20 & mikro; LEppendorf5242956003Cam kılcal damarların yüklenmesi için
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1KÖK HÜCRE Teknolojileri85850Kök hücre ortamı
N-2 takviyesiGibco17502048Ön beyin ortamı 2 ve 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Sonraki Yüksek Sadakat 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Neubauer sayma odasıMarka718605
Nörobazal ortamGibco21103049Ön beyin ortamı 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerGibco 11140050Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
nükleaz içermeyen çift yönlü tamponEntegre DNA teknolojileri1072570
OCT BileşikDoku-Tek4583Donmuş doku örneği için gömme ortamı
P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehitFisher KimyasalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Soyulabilir-A-Way Gömme Kalıp KesilmişT12Polysciences Inc.18986-1Vibratom ve kriyo-kesit için hCO'ların gömülmesi için
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) Gibco15140122Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 ve nükleofeksiyon sonrası kök hücre ortamı için
Petri Kabı 60 mm x 15 mm, Havalandırmasız, SterilCorningBP50-02
Petri Kabı Platin Elektrot Odası, 5 mm boşlukHarvard Aparatı BTX45-0504
Fosfat tamponlu salin (PBS)evde
Proteinaz KSigma AldrichP2308Titrachium albümünden; 10 mg/mL stok
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28706
RHO/ROCK yolağı inhibitörü (Y-27632)KÖK HÜCRE Teknolojileri72308
SB-431542KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ72232Ön beyin ortamı 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) < sup> 15 < / sup >
Sodyum Sitrat DihidratSigma AldrichW302600-1KG-K
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Sigma AldrichL3771
Sükroz Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus yapışma kızaklarıFisher Scientific
SZX10Veya alternatif stereoskop
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284a.k.a. Okoksinol 9
Trizma tabanıSigma AldrichT1503TrisHCl
Tripan Mavi Çözeltisi yapmak için,% 0.4Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzim (1x)Thermo Fisher12604021Tek hücreli süspansiyonlar yapmak için ayrışma enzimi
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polisorbat 20
Tyrode tuzuSigma AldrichT2145-10x1l
Titreşimli Mikrotom (vibratom)LeicaVT1200 S
Geniş Çaplı 1000 & L Evrensel Fit Filtre UçlarıCorningTF-1005-WB-R-S
β-MerkaptoetanolGibco 21985-023Ön beyin ortamı 1, 3 ve 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
yapılan için ultra saf üretilmiştir KL 300 LED Olympus SZX10 Veya alternatif stereoskop ile 10149870

Kaynaklar

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nsan Beyin Geli imiElektroporasyon Tekni iGen NakavtCRISPR Cas9N ral Projenit r H crelerOrganoid Dilimlememm nohistokimyaApikal Radyal GliaVentrik l Benzeri Yap lar
Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.