Yöntem makalesi

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 Nisan 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monosit-makrofaj soyunun hücreleri çok işlevlidir ve hemen hemen tüm vücut dokularında bulunur. Doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığın başlama ve çözülme aşamalarını koordine ederek koruyucu bağışıklığı ve bağışıklık aracılı patolojik hasarı önemli ölçüde etkilerler. Dokuda yerleşik makrofajlar, homeostazın kararlı bir durumda korunmasında kilit oyuncular olsa da, hasar veya enflamatuar hakaretlerin ardından periferik kandan dokuya büyük miktarlarda monosit alınır. Monosit kaynaklı makrofajlar (M-DM) birçok dinamik alt tipe farklılaşabilir ve fenotipleri ve işlevleri lokal doku ortamına bağlıdır.

M-DM farklılaşması ve polarizasyonu sırasında farklı uyaranları veya çevresel koşulları karşılaştırmak için, insan polarize olmayan M-DM M0 ve bazı kardinal sitokin polarize makrofajların, IFNγ/LPS'den türetilmiş M1, IL-4'ten türetilmiş M2a ve IL-10 veya deksametazondan türetilmiş M2c'nin in vitro modelini standartlaştırdık. CD64, CD206, CD163, CD14 ve MERTK'nin polarize olmayan M0 ve polarize M1, M2a ve M2c'yi akış sitometrisi ile açıkça ayırt edebildiğini bulduk. Ayrıca, IRF1 ve CXCL10'u, IL-4'ten türetilmiş M2a için klasik IFNγ/LPS'den türetilmiş M1-, IRF4-, CCL22- ve TGM2'ye özgü transkriptler için spesifik genler ve deksametazondan türetilmiş M2c için MERTK geni olarak tanımladık. Özetlemek gerekirse, standartlaştırılmış M-DM protokolümüz, çeşitli uyaranlar altında insan M-DM'nin farklılaşmasını ve polarizasyonunu analiz etmek için kardinal in vitro haritayı verebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk olarak Metchnikoff tarafından fagositik yetenekleri nedeniyle tanımlanan makrofajlar, Metazoan yaşamı için temel olan eski hücrelerdir. Yetişkin memelilerde her yerde bulunurlar, dikkate değer anatomik ve fonksiyonel çeşitlilik sergilerler. Mononükleer fagositik sistemin bir parçası olarak, dendritik hücreler ve monositlerin yanı sıra, makrofajlar, gelişim ve homeostazdan patojenlere karşı bağışıklık tepkilerine kadar çeşitli biyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar1,2. Doku mikro çevreleri için özelleşmiş yerleşik makrofajlar, nöbetçi olarak hareket eder, doku sağlığını izler ve fizyolojik değişikliklere ve dış tehditlere yanıt verir. Sınırlı plastisitelerinin, doku homeostazını sürdürmek için evrimsel bir adaptasyon olduğu düşünülmektedir. Buna karşılık, işe alınan monositler daha esnektir ve iltihaplanma sırasında çeşitli makrofaj fenotiplerine farklılaşabilir. Enflamasyon ve doku nişinin bu ikili etkisi, makrofajların fonksiyonel çeşitliliğini şekillendirir3. Bu nedenle, lokal doku ortamına bağlı olarak, monosit kaynaklı makrofajlar (M-DM) birçok alt tipe farklılaşabilir. Lokal metabolitler, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre-hücre etkileşimi4,5,6 fenotiplerini ve işlevlerini ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, makrofajlar, iltihabı azaltan ve yeniden vaskülarizasyonu ve doku onarımını yönlendiren faktörlerin anahtar üreticileridir7,8.

En az üç ana kolun polarizasyonu (dışsal, içsel ve doku ortamı koşulları) kontrol ettiği göz önüne alındığında, makrofaj polarizasyonu çok boyutlu2 olarak görülmelidir. Makrofaj farklılaşması ve polarizasyonunu tanımlamadaki ana engeller ve tuzaklar, literatürdeki heterojen deneysel koşullar ve makrofaj terimlerinin in vitro ve in vivo deneylerde tanımlanması konusunda fikir birliği olmamasıdır9. Bununla birlikte, çeşitli deneysel senaryolar için deneysel standartların bir miktar birleştirilmesi başlamıştır.

İnsan makrofaj alanını daha iyi anlamak için, belirli işlevlerin yanı sıra bağlantı, farklılaşma, polarizasyon, fenotip ve yeniden programlama için standartlaştırılmış ve iyi tanımlanmış in vitro M-DM modellerine ihtiyacımız var. Amacımız, akış sitometrisi ve gerçek zamanlı PCR ile M-DM'nin çarpık yeniden programlanmasını incelemek için insan polarize olmayan M-DM M0 ve sitokin polarize makrofajların standartlaştırılmış bir in vitro modelini oluşturmaktı. Makrofaj polarizasyonu, yüksek plastisiteleri ve çevrelerinden gelen çoklu sinyalleri entegre etme yetenekleri nedeniyle dinamik bir süreç olmasına rağmen, burada polarize olmayan M-DM (M0) ve bazı in vitro polarizasyon durumlarını, yaygın olarak M1 olarak da tanınan, IFNγ ve LPS ile indüklenen klasik pro-inflamatuar olarak karakterize ettik. Benzer şekilde, doku onarımı ve düzenleyici M2 makrofajları, IL-4 ile indüklendiğinde M2a ve deksametazon veya IL-10 ile uyarıldığında M2c olarak tanımlanabilir. Bu polarize durumlar, zaman ve uzaydaki geniş M-DM ortam spektrumunun bir anlık görüntüsünü yakalar, ancak test koşullarının yerini belirleyeceğimiz analitik haritayı belirlemek için bize bazı temel noktalar verir.

Yüzey işaretleyicilerinin ve transkripsiyonel programların karmaşık ve dinamik kombinasyonuna rağmen, in vitro M-DM'yi analiz ederken, CD64, CD206, CD163, CD14 ve MERTK'nin polarize olmayan M0 koşulunu, IFNγ/LPS ile indüklenen M1, IL-4 ile indüklenen M2a ve IL-10 veya akış sitometrisi ile indüklenen deksametazon ile ayırabildiğini belirledik. Ayrıca, IRF1 ve CXCL10 gen ekspresyonu, IFNγ/LPS ile indüklenen M1 için spesifik olarak tanımlandı; IL-4'ten türetilmiş M2a için IRF4-, CCL22- ve TGM2'ye özgü transkriptler; ve deksametazondan türetilmiş M2c için MERTK geni, farklı uyaranlarla sorgulanan veya hatta başka hücre tipleriyle birlikte kültürlenen M-DM'nin çarpık yeniden programlamasını karşılaştırmak için ek kardinal noktalar belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm sağlıklı gönüllü kan bağışçıları yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve çalışma Arjantin Ulusal Tıp Akademisi (IMEX-CONICET-ANM) Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) izolasyonu

NOT: PBMC'ler, %3,8 oranında sodyum sitrat ile 40 mL antikoagüle periferik kandan ve Ficoll-Hypaque yoğunluk gradyanı (1077) santrifüjleme kullanılarak izole edilir. Bu protokol steril koşullar altında bir BSL2 Biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

  1. Alınan antikoagüle periferik kan örneğini santrifüjleme için uygun 15 mL veya 50 mL'lik tüplere aktarın.
  2. Kan örneklerini 200 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin (hızlanma: 4 yavaşlama: 2, maksimum 5 olduğunda) oda sıcaklığında üstte trombositten zengin plazma (PRP) ve altta kırmızı ve beyaz kan hücreleri dahil olmak üzere hücresel fraksiyon elde edin. Bkz. Şekil 1.
  3. Üst fraksiyonu (PRP) 15 mL'lik tüplere aktarın (plazma saklanacaksa) ve trombositler olmadan nihai plazma fraksiyonunu elde etmek için 10 dakika boyunca (maksimum hızlanma ve yavaşlama) 600 × g'da santrifüjleyin. Plazmayı -20 °C'de saklayın.
  4. İlk santrifüjlemeden elde edilen hücresel fraksiyonu, oda sıcaklığında önceden ısıtılmış steril 1x Fosfat tamponlu Salin (1x PBS) kullanarak 2x (minimum) ila 3x (maksimum) seyreltin. Nazikçe homojenize edin ve bu seyreltilmiş fraksiyonu Ficoll-Hypaque yoğunluk gradyan santrifüjlemesi için kullanın.
  5. 15 mL Ficoll-Hypaque'ı 50 mL'lik steril bir tüpe aktarın. Ardından, fazları karıştırmaktan kaçınarak Ficoll'un üzerine dikkatlice ve yavaşça 30 mL seyreltilmiş kan ekleyin. 10 mL veya daha az seyreltilmiş kanla çalışıyorsanız, 4 mL Ficoll-Hypaque'ı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından 10 mL seyreltilmiş kan örneğini ekleyin.
    NOT: Bu adım, mononükleer fraksiyonu elde etmek için kritik öneme sahiptir.
  6. Ficoll artı seyreltilmiş kan içeren tüpü 600 × g'da 25 dakika santrifüjleyin (hızlanma: 1; Yavaşlama: 0) oda sıcaklığında.
  7. Sarı üst tabakanın bir kısmını steril bir 3 mL Pasteur pipeti ile çıkarın. Ardından, sarı üst tabaka ile Ficoll tabakası arasında oluşan arayüzü (mononükleer "halka" fraksiyonu) steril bir Pasteur pipeti ile dikkatlice toplayın. Bu "halka", ilgilenilen mononükleer hücreleri (PBMC) içerir.
    NOT: Kalan plazma fazının bir kısmı toplanabilir, ancak PBMC'ler için toksik olabileceğinden Ficoll fazından kaçındığınızdan emin olun.
  8. Toplanan PBMC'leri en az 3 mL steril 1x PBS içeren yeni bir 15 mL tüpe aktarın. Ardından, karşılık gelen steril 1x PBS hacmini 12-15 mL'ye kadar doldurun. PBMC'leri 600 × g'da (maksimum hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı atın ve PBMC'leri tekrar yıkayın. 1 mL steril 1x PBS ekleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin, ardından ek steril 1x PBS ile 12-14 mL'ye kadar doldurun. Tüpleri 600 × g'da (maksimum hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı atın ve PBMC peletini% 2 inaktive edilmiş fetal sığır serumu (1x PBS-% 2 FBS) içeren steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve hacmi 10 mL'ye getirin. Otomatik bir hücre sayacı kullanın veya hücreleri sayın, steril soğuk 1x PBS'de seyreltilmiş 1: 5 hücre süspansiyonu hazırlayın ve ardından 1: 10'luk bir son seyreltme elde etmek için Tripan Mavisi içinde (1: 2) hazırlayın. Saymak için bir ışık mikroskobu kullanın.
  11. PBMC süspansiyonunu 300-× °C'de 5 dakika boyunca 10 g sıcaklıkta döndürün. 108 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücreleri istenen hacimde steril, soğuk 1x PBS-2% FBS'de yeniden süspanse edin. Bu hücreleri bir sonraki adıma kadar 4 °C'de bırakın.
    NOT: Toplanan PBMC'ler aynı gün kullanılmayacaksa, uygun dondurma ortamında (FBS'nin %90'ı %10 dimetil sülfoksit, DMSO içeren %90'ı) 108 hücre/mL'de kriyojenik bir şişede dondurulması önerilir. Hücrelerin yavaşça donmasını sağlamak ve böylece hücre hasarını en aza indirmek için gece boyunca bir polietilen glikol kabında -80 °C'de saklayın. Ertesi gün, hücreleri bir saklama kutusuna aktarın ve birkaç gün -80 °C'de bırakın veya uzun bir depolama süresi için sıvı nitrojen tankına aktarın.

2. Manyetik boncuklar kullanarak CD14+ monosit sıralama

NOT: Sağlıklı donörlerin PBMC'lerinde bulunan CD14 monosit miktarı yaşa ve cinsiyete bağlı olarak değişkendir. Mümkün olduğunda, her numunedeki monositlerin yüzdesini elde etmek için bir hücre sayacı kullanın ve ardından gerekli CD14 monositlerini sıralamak için gereken PBMC sayısını hesaplayın. Hücre sayacı yoksa, PBMC örneği başına monositlerin %10'u geniş bir yaklaşım olarak kabul edilebilir4,6,7,10,11,12,13.

CD14+ monositleri, bir insan CD14 pozitif seçim kiti5 kullanılarak izole edilir. 100 μL reaksiyonda 1 ila 2 × 107 PBMC kullanarak izolasyon protokolünü standardize ettik; Daha yüksek sayılar için bu oranı kullanın. Önerilen minimum reaksiyon hacmi, 1 × 107 PBMC'den daha düşük bir hücre sayısında bile 100 μL'dir.

  1. 1 mM etilendiamintetraasetik asit (1x PBS-%2 FBS-1 mM EDTA) tamponu içeren 1x PBS-%2 FBS'de 1-2 ×10 8 hücre/mL konsantrasyonda PBMC hücre süspansiyonu hazırlayın ve istenen miktarda PBMC'yi 5 mL Polistiren Yuvarlak tabanlı tüpe aktarın.
  2. Her 100 μL hücre süspansiyonu için 10 μL Pozitif Seçim Kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. 100 μL hücre süspansiyonu başına 10 μL manyetik nanopartikül ekleyin, manyetik nanopartikülleri eşit şekilde süspanse etmek için 5 kattan fazla kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika
    NOT: Vorteksleme önerilmez.
  4. Hücre süspansiyonunun toplam hacmini 2,5 mL'ye çıkarmak için 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tamponu ekleyin. Tüpteki hücreleri 2-3 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Tüpü mıknatıs sıralayıcıya yerleştirin ve 5 dakika bekletin.
  5. Mıknatısı alın ve süpernatan fraksiyonu atarak onu ve tüpü tek bir sürekli hareketle ters çevirin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreler tüpün içinde kalacaktır. Mıknatısı ve tüpü 2-3 saniye ters çevirin, ardından dikey olarak dik çevirin.
    NOT: Tüpün ağzından sarkan damlaları bırakın; Onları sallamayın veya lekelemeyin.
  6. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve tekrar tüpe 2,5 mL 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tamponu ekleyin. Karıştırmak için hücre süspansiyonunu 2-3 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Tüpü tekrar mıknatısa yerleştirin ve 5 dakika bekletin.
  7. Tek bir sürekli hareketle, süpernatan fraksiyonu atarak hem mıknatısı hem de tüpü ters çevirin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve hücreleri uygun miktarda 1x PBS-2% FBS tamponunda (EDTA olmadan) yeniden süspanse edin. Olumlu olarak seçilen hücreler artık kullanıma hazırdır.
    NOT: Mıknatısta toplam iki adet 5 dakikalık ayırma işlemi gereklidir.
  8. 1x PBS-2% FBS tamponu kullanarak sıralanmış CD14 hücrelerini yıkayın, kalan EDTA'yı seyreltmek için hücre süspansiyonunu 12-14 mL'ye getirin ve ardından 10 dakika boyunca 600 × g'da (maksimum hızlanma ve yavaşlama) santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı atın ve hücre peletini önce 1 mL 1x PBS-%2 FBS tamponu ile yeniden süspanse ederek ve ardından hacmi 12-14 mL'ye yükselterek yıkamayı tekrarlayın. Tüpleri 600 × g'da (maksimum hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı atın ve pozitif seçilen CD14 monositlerini 2 mL 1x PBS-2% FBS tamponunda yeniden süspanse edin. Otomatik hücre sayacını kullanın veya hücre süspansiyonunu (1:5) steril soğukta 1x PBS'de ve ardından (1:2) bir ışık mikroskobu kullanarak Tripan Mavisi içinde seyrelterek hücreleri sayın. Kültür hazırlığına kadar hücreleri buz üzerinde bırakın.
    NOT: Hücre saflığı, 50 μL hücre süspansiyonu alınarak ve CD14 + hücreleri (klon HCD14) için boyanarak akış sitometrisi ile test edilebilir. % 90'dan fazla saflık önerilir.
  11. Kültürleme için, hücre süspansiyonunu 8-10 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. % 10 inaktive edilmiş FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (RPMI-10% FBS-% 1 P / S) ile desteklenmiş RPMI 1640 kullanarak peleti 106 hücre / mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
    NOT: Yüksek kaliteli, düşük endotoksinli, ısıyla etkisiz hale getirilmiş bir FBS kullanmak çok önemlidir. Kaplamadan önce plastik duvara monosit yapışmasını önlemek için her zaman buz üzerinde tutun.

3. Monosit kaynaklı makrofaj (M-DM) farklılaşması ve polarizasyonu

NOT: M-DM kültürü, 500 μL RPMI-%10 FBS-%1 P/S içeren 48 oyuklu plakalarda 2,5 ×10 5 CD14+ monositlerin kaplanması ve 37 °C'de CO2 (%5) ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 7 gün süreyle kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Monositin plakaya yapışmasını arttırmak için işlem görmüş plakaları seçin.

  1. Bazal M-DM (M0), inflamatuar M1, doku onarımı M2a, düzenleyici M2c ve istenen test koşulları dahil olmak üzere çalıştırılacak tüm deneysel koşulları tanımlayın.
  2. Adım 2.11'de hazırlanan hücre süspansiyonunun 250 μL'sini pipetleyin ve her bir oyukta 2.5 ×10 5 CD14 + monosit tohumlayın.
  3. 500 μL toplam hacmi tamamlamak için her oyuğa 250 μL RPMI-%10 FBS-%1 P/S artı 50 ng/mL M-CSF ekleyin.
  4. Makrofaj farklılaşmasının ilk adımına izin vermek için hücre kültürü plakasını 37 ° C'de% 5 CO2 ile 4 gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Morfolojik değişikliklerin beklendiği gibi meydana gelip gelmediğini veya istenmeyen bağlanmamış hücrelerin olup olmadığını görmek için hücre kültürü farklılaşmasını periyodik olarak kontrol edin.
  5. M-DM kültürünün 4. gününde kültür ortamının yarısını (250 μL RPMI-%10 FBS-%1 P/S) değiştirin. Polarizasyon koşulları için sitokinler veya reaktifler ekleyin ve bunları 3 gün boyunca kültürleyin (son nokta 7. gündür): LPS (1 ng / mL) artı M1 için IFNy (50 ng / mL), M2a için IL-4 (40 ng / mL), M2c için IL-10 (50 ng / mL) veya deksametazon (0.1 μM).
  6. Fenotipik karakterizasyon yapmak için 7. günde M-DM'yi hasat edin, sonraki iki adımda belirtildiği gibi mRNA ekspresyonu için toplayın veya fonksiyonel bir test yapın.

4. Akış sitometrisi ile polarize M-DM'de yüzey fenotip karakterizasyonu

  1. Toplam kültür ortamı hacmini (48 oyuklu bir plakanın 500 μL'si) atın ve hücre toplama için 200 μL 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tamponu ekleyin. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve ardından EDTA tamponunu seyreltmek için 200 μL 1x PBS-%2 FBS ekleyin. M-DM'yi 1,5 mL mikrotüplerde yukarı ve aşağı pipetleyerek toplayın. Hasat edilen bu hücreleri 1x PBS-2% FBS ile bir kez yıkayın ve 800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  2. M-DM peletini 200 μL 1x PBS-%5 FBS ile yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika bloke etmek için 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir mikroplakaya aktarın. Hücreleri 800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  3. 1x PBS -% 2 FBS'de doğrudan konjuge antikorların uygun kombinasyonunu hazırlayın. Her bir kuyuyu veya durumu (1x) 50 μL antikor paneli ile boyayın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Burada, antikor paneli CD11b-APC / Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP / Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 ve MERTK-biotin artı Streptavidin-PE'den oluşuyordu. Önceden yüklenmiş antikor konsantrasyonu Tablo 1'de listelenmiştir.
  4. Lekeli M-DM'yi 150 μL 1x PBS ekleyerek yıkayın ve 800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  5. Hücre canlılığını ölçmek için, 100 μL sabitlenebilir canlılık boyası Zombie Violet (1x PBS'de 1: 1.000) ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Lekeli hücreleri 100 μL 1x PBS ekleyerek yıkayın ve 800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. 200 μL 1x PBS kullanarak yıkama işlemini tekrarlayın.
  7. M-DM peletini 100 μL fiksatif reaktif (fiksatif/geçirgenleştirme kitinden itibaren) ile yeniden süspanse ederek ve buz üzerinde ve karanlıkta 20 dakika inkübe ederek sabitleyin.
    NOT: Uygun fiksasyonu elde etmek için, hücre peletini doğru şekilde homojenize etmek esastır.
  8. M-DM'yi 100 μL 1x PBS-2% FBS ekleyerek yıkayın ve 800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. 200 μL 1x PBS-2% FBS kullanarak yıkama işlemini tekrarlayın.
  9. M-DM peletini 200 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve lekeli hücreleri akış sitometresinde çalıştırın.

5. M-DM polarizasyonunu qPCR ile ayırt etmek için gen programı profili

NOT: Kültürün 7. gününde, yüksek kaliteli toplam RNA'nın izolasyonu için RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak 2,5 ×10 5 M-DM hasat edilebilir. RNA izolasyonu, kolon bazlı RNA ekstraksiyonu ve bir elüsyon kiti gibi alternatif yöntemler kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

  1. Doğrudan 350 μL ekstraksiyon reaktifi ekleyerek toplam kültür ortamı hacmini ve parçalanmış M-DM'yi atın. Bu hücre süspansiyonunu homojenize edin ve 1.5 mL RNaz-/DNaz içermeyen bir mikrotüpe aktarın ve RNA izolasyonuna devam edin.
    NOT: RNA izolasyonu aynı gün gerçekleştirilmeyecekse, adım 5.1'deki numune gece boyunca 4 °C'de veya bir yıla kadar -20 °C'de saklanabilir.
  2. Nükleoprotein kompleksinin tamamen ayrışmasına izin vermek için, homojenize edilmiş numuneleri adım 5.1'den itibaren 25 ° C'de 5 dakika inkübe edin
  3. Her numuneye 70 μL kloroform ekleyin. Sızıntıyı önlemek için her tüpü güvenli bir şekilde kapatın ve tüpü sallayarak içindekileri iyice karıştırın. Numuneleri 2-3 dakika inkübe edin ve ardından numuneleri 12.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Bu adım, fazları bir alt fenol-kloroform fazına, bir ara faza ve renksiz bir üst sulu faza tamamen ayıracaktır.
    NOT: Kloroform hacmi, lizis aşaması sırasında kullanılan 1 mL ekstraksiyon reaktifi başına 0.2 mL kloroform oranına dayanmaktadır.
  4. RNA'yı içeren sulu fazı yeni bir 1.5 mL RNase-/DNaz içermeyen mikrotüpe aktarın.
    NOT: İnterfaz veya organik katmanların herhangi birinin aktarılmasını önlemek için sulu fazı alırken küçük bir hacim bırakın.
  5. RNA'yı çökeltmek için her numuneye 175 μL izopropanol ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika veya alternatif olarak gece boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
    NOT: İzopropanol hacmi, ilk ekstraksiyon reaktifinin mL'si başına 0.5 mL izopropanol oranına dayanmaktadır.
  6. Numuneleri 12.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Toplam RNA'nın beyaz jel benzeri bir topağı, tüpün dibinde çökelecektir. Bir mikropipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
  7. Beyaz jel benzeri peleti 350 μL %75 etanol (lizis için kullanılan 1 mL ekstraksiyon reaktifi (v/v) başına 1 mL) yeniden süspanse ederek RNA'yı yıkayın.
    NOT: RNA, -20 °C'de 1 yıla kadar veya 4 °C'de 1 haftaya kadar %75 etanol içinde saklanabilir.
  8. Yeniden süspanse edilmiş peleti kısaca vorteksleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7.500 × g'da santrifüjleyin. Bir mikropipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve atın. RNA peletini 5-10 dakika havayla kurutun veya vakumlayın
    NOT: RNA'yı çözündürmek için, RNA peletinin aşırı kurumasını kaçının.
  9. Peleti 20-30 μL RNaz içermeyen suda yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. 55-60 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda veya ısı bloğunda 10-15 dakika inkübe edin. RNA konsantrasyonunu ölçmeye devam edin ve RNA'yı -70 °C'de saklayın.
  10. Bir cDNA sentez kiti kullanarak 20 μL reaksiyon hacminde 100-500 ng RNA (sırasıyla minimum ve maksimum) kullanarak ters transkripsiyonu (cDNA kopyası) gerçekleştirin.
  11. 1 μL cDNA (5-25 ng) kullanarak gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarını çalıştırın.
    1. 5 μL SYBR yeşil karışımı (2x), her bir astardan 0.2 μL (ileri ve geri) ve 3.6 μL nükleaz içermeyen su kullanarak her tüp (1x) için reaksiyon karışımını hazırlayın. Tüm bileşenleri numune numarasına göre ölçeklendirin. Reaksiyon karışımını iyice karıştırın ve her bir qPCR tüpüne 9 μL dağıtın ve son olarak 10 μL'lik nihai toplam hacme ulaşmak için 1 μL cDNA'yı dağıtın.
    2. Termal döngü protokolünü gerçek zamanlı bir PCR cihazında aşağıdaki gibi programlayın: 98 °C'de 2-3 dakika (1x); 98 °C'de 5-15 sn artı 60 °C'de 15-30 s (35-40x); son olarak 2-5 s/adımda 0,5 °C'lik artışla eriyik eğrisi analizini (65-95 °C) dahil edin veya cihazın varsayılan ayarını kullanın.
      NOT: Bu reaksiyon, evrensel SYBR Green karışımı kullanılarak standartlaştırılmıştır. M-DM polarizasyon analizi için önerilen primerler Tablo 2'de listelenmiştir.
  12. Referans gen olarak ökaryotik translasyon uzama faktörü 1 alfa 1 (EEF1A1) kullanarak sonuçları normalleştirin ve ayrışma eğrilerinin analizi yoluyla amplifiye edilmiş ürünlerin özgüllüğünü kontrol edin.
    NOT: Ayrışma eğrisi analizi, reaksiyonda yalnızca bir qPCR amplifikasyon ürününün varlığının doğrulanmasına izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birkaç yıldır makrofaj karakterizasyonu konusundaki çalışmalarımıza dayanarak, in vitro M-DM'nin farklı alt kümelerini açıkça ayırt eden doğru bir belirteç kombinasyonu belirledik. Fenotip belirteçleri, literatüre ve daha önce gerçekleştirdiğimiz geniş bir önceki taramaya göre seçildi9,14,15,16,17. Ayrıca, CD64, CD206, CD163, CD14 ve MERTK'nin polariz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofaj farklılaşması, aktivasyonu ve polarizasyonu immünoloji, doku homeostazı, hastalık patogenezi ve inflamasyonun çözülmesinde merkezi bir odak noktası haline gelmiştir. Ek olarak, doku makrofajlarının, bozulmuş homeostaz koşulları altında dolaşımdaki monositlerden türetilebileceğine dair ortaya çıkan tablo, tanımlanmış fenotipler, transkripsiyonel programlar ve aktivasyon yolları ile karakterize edilen kesin M-DM modellerinin gerekliliğini vurgulamaktadır.

Başarılı bir şekilde uygulanmas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknolojiyi Teşvik Ajansı (ANPCyT-FONCYT) tarafından PICT 2018-3070 ve 2021-I-A-00807 hibeleri aracılığıyla desteklenmiştir. E.A.C.S. ve PICT 2021-I-A-00716 AEE'ye ve Ulusal Bilimsel ve Teknik Araştırma Konseyi (CONICET) tarafından PIP 2022-0763 hibesi yoluyla ve Buenos Aires Üniversitesi tarafından Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 aracılığıyla desteklenmiştir. A.E.E., E.A.C.S. ve A.E.E. CONICET'te kariyer araştırmacılarıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488 fare anti-insan  CD206 Antikor klonu 15-2BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 321113; RRID:AB_571874
APC fare anti-insan CD64 Antikor klonu 10.1BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 305013; RRID:AB_1595539
APC/Cy7 sıçan anti-fare/insan CD11b Antikor klonu M1/70BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, ABDCat# 554714fiksatif/geçirgenleştirme kiti
Biotin anti-insan MERTK Antikor klonu 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 367616; RRID:AB_2721500 
CFX-Connect ekipmanı Bio-Rad, Hercules, CA, ABD
EasySep İnsan CD14 Pozitif Seçim Kiti; EasySep Pozitif Seçim Kokteyli; EasySep manyetik Nanopartiküller; Kolay Eylül MıknatısSTEMCELL Teknolojileri, Vancouver, KanadaKedi # 18058
FACS Kanto sitometresi Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, ABD.
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, Yeni Zelanda Gibco ve ticaret;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA ABD 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Yaşam Bilimleri, ABDCat# 17144003
FlowJo FlowJoLLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prizması   GraphPad Yazılım A.Ş.RRID: SCR_002798
iScript cDNA sentez kiti, 5x ters transkripsiyon reaksiyon karışımı, iScript ters transkriptaz, nükleaz içermeyen suBio-Rad, Hercules, CA, ABDCat# 1708891
Partec CyFlow uzay sitometresi içerir;Sysmex Partec, Almanya
PE StreptavidinBioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi # 405203
PE / Cy7 fare anti-insan CD14 Antikor klonu HCD14BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 325618; RRID: AB_830691
PerCP / Cy5.5 fare anti-insan CD163 Antikor klonu GHI / 61BioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 333607; RRID: AB_1134006
RPMI 1640 OrtaGibco ve ticaret;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA ABD 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, antikor aracılı sıcak başlangıçlı Sso7d fusi&oakut içerir; n polimeraz, dNTP'ler, MgCl2, SYBR Yeşil I Boya, arttırıcılar, stabilizatörler ve pasif referans boyaların bir karışımı (ROX ve floresein dahil).Bio-Rad, Hercules, CA, ABDCat# 1725271
TriZol ReaktifiThermo Fisher Scientific
Yaşam Bilimleri Çözümleri
Carlsbad, CA, ABD 		Kedi#  15596026RNA ekstraksiyon reaktifi
Zombie Violet Tamir Edilebilir Canlılık KitiBioLegend, San Diego, CA, ABD.Kedi# 423113

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

İlgili makaleler