Method Article

Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı

DOI:

10.3791/67696

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Anatomy, University of Zurich, 2Center for Microscopy and Image Analysis, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yinelemeli ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) ve ticari bir nükleotid etiketleme testinin (Click-iT EdU) kombinasyonu, sabit donmuş murin dokusu kesitlerinde oldukça dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deri yaralanmaları, çeşitli hücre tiplerini birbirine bağlayan karmaşık bir rejeneratif kaskad başlatır. Bunlar arasında periferik glial hücreler, onarım sürecinin başarısını sağlamada kritik bir rol oynar. Ancak mevcut teknolojilerdeki sınırlamalar nedeniyle bu süreçlere ilişkin anlayışımız eksik kalmaktadır. Bu nedenle, doku rejenerasyonunda yer alan anahtar hücre tipleri ve yapıları tarafından eksprese edilen proteinlere karşı yönlendirilen antikorlar kullanılarak cildin hücresel bileşimindeki değişiklikleri karakterize etmek için yinelemeli-ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) yöntemi kullanıldı. Daha da önemlisi, hücre proliferasyon belirteçlerine karşı yönlendirilen antikorlar genellikle ciltteki bölünen hücrelerin sayısını hafife alır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için Click-iT EdU kimyası, çoğalan hücre tiplerinin ayrıntılı karakterizasyonuna izin veren IBEX yöntemiyle birleştirildi. Tam otomatik bir dönen diskli konfokal mikroskop kullanılarak, 24 oyuklu plakalara kesitlenmiş numunelerin yinelemeli görüntülenmesi için yüksek verimli bir iş akışı geliştirildi. Click-iT EdU ile hücre durumlarını yerinde değerlendirmek için IBEX yöntemini genişletmenin ötesinde, görüntü düzeltme, birleştirme ve kayıt işlemlerini gerçekleştirmek için yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı da tanıtıldı ve kapsamlı programlama deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Ayrıca, yüksek oranda çoğullanmış görüntüleme verilerinin (Fiji ve QuPath dahil olmak üzere geleneksel görüntü analiz yazılımı kullanılarak) işlenmesi ve görselleştirilmesine ilişkin ayrıntılı bir dokümantasyon da sağlanmaktadır. Özetle, bu protokol IBEX protokolünün çok yönlülüğünü vurgulamakta ve yerleşik bir geleneksel görüntüleme platformuna adaptasyonunu göstermektedir. Özellikle, IBEX'in Click-iT EdU etiketleme ile birleştirilmesi, bozulmamış dokularda ve uzamsal çözünürlükte oldukça dinamik süreçler sırasında aktif olarak bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deri, insan vücudunun en büyük organıdır ve vücudu dış ortamdan koruyan ilkel bariyerdir1. Sonuç olarak, bariyer işlevini tehlikeye atan çok sayıda dış zorluğa maruz kalır. Bu nedenle cilt, hasarın ardından doku bütünlüğünü ve işlevselliğini yeniden sağlamak için karmaşık mekanizmalar geliştirmiştir. Deri yara iyileşmesi birbiriyle örtüşen üç aşamada gerçekleşir: iltihaplanma, çoğalma ve olgunlaşma/yeniden şekillenme. Bu üç aşama, yaralı cilt dokusunun 1,2,3 ilk biyolojik özelliklerini eski haline getirmek için birlikte hareket eden dermal fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri gibi birkaç farklı hücre tipini içerir.

Deri yoğun bir şekilde innerve edilen bir organdır ve başarılı bir onarım süreci için sinir innervasyonunun çok önemli olduğu bilinmektedir 4,5,6. Aksonal sinyalleme 4,7,8'in yanı sıra, normalde aksonları kaplayan periferik glia, başarılı doku rejenerasyonuna 9,10,11 katılır. Bununla birlikte, periferik glial hücreler gibi yeterince temsil edilmeyen hücre tiplerinin rolü, cilt dokusu rejenerasyonu gibi dinamik süreçlerde tam olarak anlaşılamamıştır. Bu hücrelerin işlevini daha iyi belirlemek için, hücresel mikro ortamı ve rejeneratif süreç sırasında etkileşime girebilecekleri komşu hücre tiplerini analiz etmek çok önemlidir. Ayrıca hücre çoğalması doku yenilenmesi için önemli bir aşama olduğundan, onarım süreci boyunca çoğalan hücre tiplerinin doğru bir şekilde tespit edilmesi ve sınıflandırılması önemlidir.

IBEX12 gibi çoğullanmış, yüksek içerikli, optik görüntüleme yöntemleri, hücresel bileşimi karakterize etmek, hücre-hücre etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek ve karmaşık dokular içindeki mikroçevresel kalıpları uzamsal çözünürlükte incelemek için geliştirilmiştir. Diğer çoğullama yöntemleri özel aletler ve tescilli reaktifler gerektirirken, IBEX'in özel bir avantajı, standart bir araştırma ortamında erişilebilen ticari olarak temin edilebilen antikorlar, reaktifler ve mikroskoplar kullanılarak nispeten düşük maliyetlerle kurulabilmesidir. IBEX panellerinde sıklıkla kullanılan anti-Ki-67 antikorları, birçok dokudaçoğalan hücre tiplerini güvenilir bir şekilde etiketlerken13,14, Ki-67-pozitif (Ki-67+) hücrelerin sayısının, akut murin cilt yaralarının sabit donmuş doku kesitlerinde diğer metodolojilere kıyasla hafife alındığı bulunmuştur. Bu nedenle, Click-iT EdU kimyasını IBEX ile birleştirdik ve EdU+ hücrelerinin sayısının, diğer metodolojilerle elde edilen toplam çoğalan hücre sayısını daha doğru bir şekilde temsil ettiğini bulduk.

Ayrıca, tam otomatik bir dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak, 24 oyuklu bir plakaya yerleştirilen doku kesitlerinin yinelemeli görüntülenmesi için yüksek verimli bir iş akışı oluşturulmuştur. Ortaya çıkan görüntüler daha sonra birden fazla açık kaynaklı Python aracının, görüntüleri eşit olmayan aydınlatma için düzelten, tek tek döşemelerin birleştirilmesini ve nihayetinde görüntü kaydını gerçekleştiren yeni bir görüntü işleme hattında birleştirilmesiyle işlenir. Ayrıntılı olarak, aydınlatma düzeltmesi için BaSiCPy kitaplığı15 , görüntüleri birleştirmek için m2stitch kitaplığı ve döngü kaydı için faz çapraz korelasyonu kullanıldı. Kaydedilen görüntüler OME-TIFF'ler olarak kaydedilir ve daha sonra Fiji17 ve QuPath18 gibi geleneksel görüntü analiz yazılımlarına yüklenebilir, burada görüntüler daha sonra işlenir ve hücre tipi sınıflandırması ve yoğunluk ve mesafe hesaplamaları gibi diğer ölçümler gerçekleştirilebilir. Birlikte ele alındığında, mevcut protokol, periferik glial hücre popülasyonunu çevreleyen hücresel mikro çevreye özel olarak odaklanarak, yenilenen cildin ana hücre tiplerinin ayrıntılı, oldukça verimli bir karakterizasyonunu gerçekleştirmemize izin verdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan yetiştirme, barındırma ve deneyler, İsviçre'nin Zürih Kantonu veterinerlik ofisinin yönergelerine göre gerçekleştirildi.

1. Tam kalınlıkta cilt yaraları (0.

  1. 8-10 haftalık fareleri %70O2 içinde %5 izofluran ile indükleyin ve %2.5 izofluran kullanarak koruyun.
  2. Sırt derisini tıraş edin ve iyice temizleyin.
  3. Ameliyattan önce antibakteriyel sabun ve %70 EtOH solüsyonu kullanarak dezenfekte edin.
  4. Deri altı buprenorfin enjeksiyonu (30 μg∙mg∙kg−1) kullanarak ameliyat öncesi analjezi uygulayın.
  5. Her hayvanın alt sırt derisinde, her iki tarafta ikişer tane, hayvanın orta hattından 1 cm ve birbirinden kabaca 2 cm uzakta olmak üzere 5 mm çapında dört dairesel tam kalınlıkta eksizyonal yara oluşturun19.
  6. İçme suyuyla (%2 sükroz ile 9 μg/mL) 3 günlük buprenorfin tedavisi ile postoperatif analjezi uygulayın.
  7. Yaralar pansuman yapmadan iyileşsin.
  8. Histolojik inceleme ve akış sitometrisi analizi için yaraları tanımlanmış zaman noktalarında toplayın.
  9. IBEX protokolü için cilt dokularını gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) solüsyonu ile diseke edin ve sabitleyin. Fiksasyon sırasında numunelerin kıvrılmasını önlemek için piyasada bulunan bir Biyopsi Kapsülü kullanın. %4 PFA ile sabitlenmiş dokuları %30 sükroz içinde gece boyunca 4 °C'de PBS içinde kriyoprotektif hale getirin. Dokuları RT'de 2 saat boyunca OCT bileşiği ile %30 sükrozun 1:1 karışımına aktarın ve son olarak izopentan içinde dondurmadan önce OCT'ye gömün.

2. Numune hazırlama (1.

  1. 24 oyuklu plakayı bir rocker çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 200 μL krom şap jelatin ile kaplayın. Daha sonra jelatini tamamen çıkarın ve kaplanmış kuyucukları 40 °C'lik bir fırında 60 dakika kurutun. Yedek olarak gereken kuyuları iki katına çıkarın. Kuyu başına 2 mL PBS ekleyin.
    NOT: Mendili yerleştirmeden önce kaplamanın tamamen kuru olduğundan emin olun. Kuyular ayrıca bir gün önce kaplanabilir ve gece boyunca RT'de kurutulabilir. Kaplandıktan sonra, kaplanmış kuyucukları buzdolabında veya derin dondurucuda saklamayın ve en iyi sonucu elde etmek için kaplanmış 24 oyuklu plakayı 1-2 gün içinde kullanın.
  2. OCT gömülü dokuyu kriyostatta 15-30 μm kalınlığa kadar kesin ve hızlı bir şekilde 2 mL PBS içeren kaplanmış bir kuyuya aktarın.
    NOT: Doku metal bir spatula veya forseps kullanılarak transfer edilebilir.
  3. Doku bölümünü kuyuda ortalanmış halde tutmayı hedefleyerek 1 mL'lik bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice çıkarın. Bunu etkili bir şekilde yapmak için, PBS'yi kuyunun kenarlarından yavaşça aspire edin ve dokunun kaymasını önlemek için pipet konumunu gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Protokolün başarısı için dokunun hassas bir şekilde yerleştirilmesi esastır. Doku kaplanmış yüzeye yapıştıktan sonra yeniden konumlandırılamaz.
  4. Doku kesitlerini 37 °C'lik bir fırında 1 saat kurutun.

3. Doku blokajı, EdU Click-iT reaksiyonu ve antikor immüno-etiketlemesi, IBEX döngüsü 1 (Gün 1)

  1. 1 dakika boyunca 5 mL PBS ile rehidrate edin.
  2. RT'de 30 dakika boyunca PBS'de 500 μL %0.5 Triton ile dokuyu geçirgen hale getirin.
  3. Mendili PBS ile 2 kez kısaca yıkayın.
  4. RT'de 30 dakika boyunca üreticinin talimatlarına göre Click-iT reaksiyonu gerçekleştirin.
    NOT: Numuneleri ışıktan koruyun.
  5. Mendili PBS ile 2 kez kısaca yıkayın.
  6. Bir bloke tampon kullanarak dokuyu oda sıcaklığında (RT) 1 saat bloke edin.
    NOT: Burada, bu deney için PBS'de% 10 eşek serumu kullanılmıştır, ancak bu gerektiği gibi ayarlanabilir; Standart immün etiketleme protokolleriyle uyumlu herhangi bir bloke edici tampon uygundur.
  7. Gece boyunca 4 °C'de 1. döngü için birincil antikorları (bloke edici tamponda seyreltilmiş; Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
    NOT: Blokaj ve immün etiketleme, Radtke ve ark.12'de açıklandığı gibi, ısıtmasız bir mikrodalga kullanılarak ~ 1 saat boyunca da gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, cilt yaraları için en iyi sinyal-gürültü oranı, birincil antikorlar gece boyunca inkübe edildiğinde elde edilir. İmmün etiketli doku kesitleri, görüntülemeden önce birkaç gün PBS'de saklanabilir. Optimum sinyal kalitesi için ertesi gün görüntüleme önerilir.

4. İkincil antikor immün etiketleme ve nükleer karşı boyama (2.

  1. Kuyucukları 3 x 1 mL PBS ile yıkayın.
  2. Doku kesitini anti-tavşan sekonder antikor boyaması (1:300) ile bloke edici çözelti içinde, nükleer karşı boyama Hoechst 1:1.000 ile birlikte karanlıkta RT'de 1 saat inkübe edin.
  3. RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  4. Her oyuğa ~500 μL PBS bırakın ve plakayı mikroskoba getirin.
    NOT: Bu bir duraklama noktası olabilir: Numuneler 4 ° C'de birkaç gün stabildir, ancak sinyal-gürültü oranı, immüno-etiketlemeden sonraki 24 saat içinde görüntülendiğinde en iyisidir.

5. Mikroskop kurulumu ve ilk IBEX döngüsünün görüntülenmesi (2.

  1. Mikroskopta oturum açın ve yazılımı yükleyin ve kullanıcı profilinde oturum açın.
  2. Alım kurulumunu girin ( Screening | Edinme Kurulumu) protokol yapılandırması ve görüntü alımı için.
  3. Plakayı mikroskoba yüklemek için Çıkar düğmesini kullanın.
  4. Plakayı mikroskoba yerleştirmeden hemen önce 24 oyuklu plakanın tabanını %70 etanol ile temizleyin. Plakayı mikroskoba yüklemek için Plakayı Yükle düğmesine tıklayın.
  5. Objektif ve Kamera altında istediğiniz büyütme ve çekim modunu seçin. Çekim modu olarak konfokal 51 μm yarık modunu seçin.
    NOT: Burada, deney için 0,95 sayısal açıklığa sahip 20x suya daldırma hedefi ve 250 μm aralıklı 50 μm iğne deliklerine sahip bir dönen disk kullanılmıştır.
  6. Plaka sekmesi altında, kullanılan plaka modelini seçin.
  7. Ziyaret Edilecek Plaka/Siteler sekmesine gidin. Site seçenekleri'nin altında, Sabit site sayısı'nı tıklatın. Sütun ve Satır sayısını, kabaca tüm kuyu kaplanacak şekilde seçin. Siteleri %10 çakıştır'ı tıklayın.
    NOT: Tek tek karoların dikilmesini sağlamak için bu düğmenin etkinleştirilmesi gerekir.
  8. Kuyu haritasında ilgili kuyuya sağ tıklayarak alım için yalnızca ilk doldurulmuş kuyuyu seçin. Seçilen kuyular yeşil, seçimi kaldırılan kuyular gri renktedir.
  9. Plaka haritasındaki ilk doldurulmuş kuyuya ve site haritasında merkeze yakın bir alana sol tıklayarak sahneyi dokunun olması gereken bir konuma taşıyın. Kuyunun ve mevcut konumu gösteren alanın daha koyu bir rengini arayın.
  10. Edinme sekmesine gidin. Lazer tabanlı odaklamayı etkinleştir ve Z Serisini Al seçeneklerini belirleyin.
  11. Alım/Otomatik Odaklama sekmesine gidin. Kuyudan kuyuya otomatik netleme için Plakaya ve kuyu dibine odaklan seçeneğini belirleyin ve Site Otomatik Netleme için Tüm siteler seçeneğini belirleyin.
  12. Dalga boyları sekmesine gidin ve mevcut döngüde görüntülenecek boya sayısını seçin. Dalga Boyları sekmesinin altında açılan ilgili sayıda yeni sekme arayın.
  13. İlk dalga boyu sekmesine gidin. Aydınlatma altında, ilgilenilen florofor için en uygun filtre ayarlarını seçin (örneğin, Hoechst kullanılmışsa DAPI'yi seçin).
  14. Z konumlandırması için z-ofsetli lazer'i seçin ve doğru görüntüleme yüksekliğini ayarlamak için Ofseti Hesapla düğmesini tıklatın. Farklı z konumlarında bir dizi görüntü elde edilecektir. Numunenin en iyi odaklandığı yeri seçin.
    NOT: Sahne konumunun doku bulunan bir konuma ayarlandığından emin olun. Bu konumda doku görünmüyorsa, farklı bir bölge seçin ve tekrar deneyin (bkz. adım 4.9).
  15. Odak düğmesine basın ve dokunun odaktaki görüntüsünün gösterilmesini bekleyin.
  16. Aydınlatma Gücü için %50'yi seçin. Hedef maksimum yoğunluk için 2000 girin ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlamak için Otomatik Pozlama'ya basın.
    NOT: Alımı hızlandırmak için lazer gücü artırılabilir, bu da pozlama süresini azaltmalıdır. Ancak bu, daha fazla foto-ağartmaya yol açabilir ve bu da tek tek karoların üst üste geldiği görüntü yapaylıklarına yol açacaktır.
  17. Z Serisi için Z Serisi ve 2B Projeksiyon Görüntüsü'nü seçin ve Gölgelendirme Düzeltme için Yalnızca FL Gölgelendirme'yi seçin.
  18. Diğer dalga boyları için 5.13-5.17 adımlarını tekrarlayın, ancak z-ofsetli Lazer yerine W1'den Z-ofsetini seçin ve 0'ı seçin.
  19. Z Serisi sekmesine gidin. İstenen Adım Boyutunu girin (20x objektif için 0,5 μm'lik bir adım boyutu kullanın).
    NOT: Önerilen değerin 2-3 katı olan bir adım boyutu kullanılarak alım hızı artırılabilir.
  20. Tıkla Odak düğmesine basın ve geçerli konum etiketli bir okun görünmesini bekleyin.
  21. Canlı Başlat'a tıklayın ve canlı görüntülerin bulunduğu yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin. Geçerli konum okunu dokunun alt kısmına ulaşılana kadar sürükleyin ve B Ayarla düğmesine tıklayın. Geçerli konum okunu dokunun üst kısmına ulaşılana kadar sürükleyin ve T Ayarla düğmesine tıklayın. F2: Durdur'a tıklayın.
    NOT: Aktif Dalga Boyu altında canlı görüntüleme için kullanılan dalga boyu seçilebilir.
  22. Alınacak siteleri seçin; öncelikle, üzerine sol tıklayarak sahnenin ilk kuyuda olduğundan emin olun ve tekrar Canlı Başlat'a basın. Site haritasında farklı sitelere sol tıklayarak kuyu içindeki farklı konumlara gidin. Dokunun kenarlığını bulun ve sağ tıklayarak doku içeren tüm siteleri alınmak üzere işaretleyin. Seçilen siteler yeşil, seçimi kaldırılan siteler gri olur.
    NOT: Şimdilik bunu yalnızca ilk kuyu için yapın ve satın alma için yalnızca ilk kuyunun seçildiğinden emin olun.
  23. Çalıştır sekmesine gidin. Plaka Adı için "Cycle{i}_Well{w}_{description}" olarak adlandırın; {i}, {w} ve {description} değerlerini karşılık gelen değerlerle/açıklamayla değiştirin.
  24. Protokolü Kaydet'e tıklayın ve yine adına "Cycle{i}_Well{w}" ekleyerek kaydedin.
  25. Diğer tüm kuyular için alım bölgelerini ayarlayın. Bunun için 5.22-5.24 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Her kuyunun alınması için ayrı bir protokol dosyasının kaydedilmesi gerekir. Yeni yatırım getirisini çekmeden önce doğru kuyunun etkinleştirildiğinden emin olun. Sonuç, elde edilecek kuyu başına kaydedilmiş bir protokol olmalıdır. Dokular kuyudan kuyuya farklı şekillere sahip olduğu için bu gereklidir. Kuyular arasında ROI ve z-yığınının aynı olması durumunda, tekrarlanan 5.22-5.24 adımları atlanabilir ve 5.26-5.29 adımları da atlanabilir. Bu durumda, görüntülenecek tüm kuyucukları seçin (bkz. adım 5.22), Çalıştır sekmesine gidin ve Plaka Al'a basın.
  26. Denetim | Günlük | Kaydı başlatın ve hemen Kontrol | Günlük | Kaydı durdurun. Oluşturulan Günlüğü kaydedin ve Control | Günlük | Günlüğü Düzenle.
  27. Sol panelde, bu adımları günlüğe eklemek için Plaka Alımı - Dosyadan Protokol Yükle ve Plaka Alımı'nı bulun ve çift tıklayın; Onları sağ panelde arayın. Eklenen Plaka Alımı - Dosyadan Protokolü Yükle'ye çift tıklayın ve ilk kuyu için kaydedilen protokolü seçin (bkz. adım 5.24).
  28. Alınacak her kuyu için adım 5.27'yi tekrarlayın ve her zaman ilgili protokolü yükleyin.
  29. Edinimi başlatmak için Kaydet'e ve son olarak Günlüğü Çalıştır'a tıklayın (15 μm'lik bir z-yığınına sahip 180 karo elde etmek için yaklaşık 3 saat gerekir).

6. Florofor ağartma (2.

  1. Derginin bitiminden yaklaşık 30 dakika önce ağartma reaktifini hazırlayın. 10 mg Lityum Borohidrürü 10 mL ddH2O içinde çözün ve 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. Kabarcıkların oluşmasını bekleyerek 10 dakika bekletin. Etkili ağartma sağlamak için, ağartma reaktifini hazırlandıktan sonra 4 saat içinde kullanın.
    DİKKAT: Lityum Borohidrit ile çalışırken kimyasal bir başlık altında çalışın, çünkü hava ile reaksiyona girebilir ve yanıcı hidrojen gazı üretebilir.
  2. Floroforları standart ortam aydınlatmasına maruz kalırken 15 dakika boyunca 1 mL 1 mg / mL Lityum Borohidrit ile ağartın. Beyazlatma işlemi sırasında dokuda küçük kabarcıklar olup olmadığına bakın.
    NOT: Kimyasal başlık altında çalışırken, ağartma işlemi sırasında aydınlatmanın otomatik olarak kapanmadığından emin olun.
  3. Ağartma işlemini 1 dakika boyunca 1 mL 1 mg/mL Lityum Borohidrit (aynı çözeltiden hazırlanmış) ile tekrarlayın.
  4. Kuyuyu 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    NOT: Ağartma reaktifinin eksik çıkarılması bir sonraki antikor paneline zarar verebileceğinden yıkama sürelerini kısaltmayın.

7. IBEX döngüleri (2.

  1. Bir sonraki immün etiketleme döngüsü (adım 3.7) için birincil antikorları uygulayın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. 4.4-5.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Bağlanmamış bir tavşan antikoru sadece ilk IBEX döngüsünde kullanıldığından Adım 4.2-4.3 tekrarlanmaz. Bununla birlikte, tavuk veya kobay gibi daha az yaygın türlerde yetiştirilen eşleşmemiş antikorlar, ikincil antikorları birleştirilmiş birincil antikorlarla çapraz reaksiyona girmeyeceğinden, sonraki döngülerde de kullanılabilir. Her döngüde kullanılan antikorların kesin ayrıntıları Malzeme Tablosunda bulunabilir.
  2. Mikroskopta, yerel PC'de Cycle{i_Well}{w} (adım 5.24) olarak kaydedilen yükleme protokolüne tıklayarak ilgili kuyu için önceki IBEX döngüsünden protokol ayarlarını yükleyin. Protokol ayarları, ROI'ye (elde edilecek seçilen döşemeler), büyütmeye, otomatik odaklama ayarlarına ve önceki IBEX döngüsünden (5.5-5.25 adımları) kaydedilen tüm ek edinme ayarlarına sahip olacaktır.
  3. Dalga boyu sekmelerini seçin ve yeni antikor paneli için pozlama ve aydınlatma gücünü ayarlayın (adım 5.12-5.18). Daha sonra döngüleri hizalamak için tüm döngüler boyunca bir işaretçi (genellikle DAPI veya Hoechst) görüntülediğinizden emin olun.
    NOT: Radtke ve ark.18'de bildirildiği gibi, GFP ve tdTomato gibi yaygın olarak kullanılan floresan proteinler lityum borohidrit ağartmaya duyarlı değildir. tdTomato gibi endojen floresan proteinleri içeren doku ile çalışırken, görüntü kaydı için gerekli değilse, karşılık gelen dalga boyu döngü 1'den sonra edinimden çıkarılabilir - bu, görüntülemeyi hızlandıracaktır. Dalga boyları, toplama kanallarının sayısı azaltılarak Genel Dalga Boyu sekmesinde kaldırılabilir. Ayrıca, görüntüleme döngüleri boyunca doku otofloresansında tutarlı bir artış gözlenmedi; ancak bunun doku tipine18 bağlı olarak değişmesi muhtemeldir.
  4. z-Stack ayarlarının hala makul olup olmadığını kontrol edin ve buna göre ayarlayın (adım 5.19-5.21).
    NOT: z-yığınının adım boyutunun tüm döngüler için aynı olduğundan emin olun.
  5. Çalıştır sekmesindeki Plaka Adını güncelleyin ve Protokolü yeniden kaydedin.
  6. Tüm kuyucukların elde edilmesi için 7.2-7.5 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: İlk kuyucukta kullanılan tüm dalga boyları için Pozlama ayarının yazılması ve sonraki tüm kuyucuklarda aynı ayarın kullanılması önerilir.
  7. Günlüğü düzenleyin, yeni protokol dosyalarını seçin ve günlüğü bu döngü için kaydedin.
  8. Günlüğü çalıştırın .
  9. Floroforları ağartmak için 6.1-6.4 adımlarını tekrarlayın.
  10. İstenilen miktarda immün etiketleme elde edilene kadar 7.1-7.9 arasındaki adımları tekrarlayın.

8. Görüntü İşleme (2.Gün)

  1. IBEX döngülerinin görüntü alımını tamamladıktan sonra, görüntü verilerini dışa aktarın:
    1. Seçme Gösterimi | Plaka veri yardımcı programları | Görüntüleri dışa aktarın.
    2. Plaka(lar)ı Seç'e tıklayın ve her döngü ve kuyu için elde edilen tüm plakaları seçin.
    3. Tüm Z Düzlemleri'ni seçin, bir çıktı dizini seçin ve verileri dışa aktarmak için Tamam'a basın.
      NOT: Veriler, her döşeme ve düzlem için ayrı tiff dosyaları olarak dışa aktarılacaktır. Tüm karoları ve döngüleri birleştirmek için aşağıdaki işlem adımları gerçekleştirilmiştir.
  2. Dışa aktarılan verileri aşağıdaki şemaya göre klasörler halinde düzenleyin: her döngünün bir klasör olduğundan ve her birinin her kuyu için tekrar bir klasör içerdiğinden emin olun. Adı şu şekildedir: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", burada {i} ve {well} karşılık gelen döngü ve kuyudur ve * herhangi bir karakterdir. Örneğin: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
    NOT: Sonraki işlem adımları için doğru bir adlandırma ve klasör yapısı gereklidir.
  3. Gerekli python paketlerini yükleyin: Python ortamını yönetmek için Miniforge'u kullanın. Yükleme talimatları için https://github.com/conda-forge/miniforge bakın.
    NOT: İşleme adımlarının kodu Jupyter Notebooks biçiminde sağlanır. https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove adresinde veya ek dosyalar olarak bulunabilirler (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5).
  4. Kodu Github'dan indirirken, Kod | ZIP'i indirin ve README.md dosyadaki kurulum talimatlarını izleyin.
  5. Jupyter-Lab'ı başlatın (Ek Dosya 2):
    1. Terminalde conda activate zmb-ibex-jove girerek yüklü conda ortamını etkinleştirin.
    2. Terminalde, örneğin cd C:\path\to\zmb-ibex-jove girerek indirilen dizine geçin.
    3. Terminalde jupyter-lab girerek Jupyter-Lab'ı başlatın. Jupyter-lab ile bir tarayıcı penceresi açılacaktır.
  6. Aydınlatma düzeltmesini hesaplayın:
    1. Sol sekmede, " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" not defterine gidin ve çift tıklayarak açın. Bu not defteri, BaSiCPy kitaplığını (Ek Dosya 3) kullanarak aydınlatma düzeltme görüntülerini hesaplayacaktır.
    2. "base_dir" ve "save_dir" tuşlarını, verilerin bulunduğu ve aydınlatma düzeltme görüntülerinin kaydedilmesi gereken doğru yollara değiştirin.
    3. Kodu not defterinde çalıştırmak için her hücreyi seçin ve yürütmek için Shift+Enter tuşlarına basın. Not defterini yukarıdan aşağıya doğru çalıştırın.
  7. Her bir döngü için dikiş gerçekleştirin (Ek Dosya 4):
    1. Sol sekmede, bir sonraki not defterine gidin ve açın : "02_stitching_MD.ipynb". Bu not defterinde, her döngü için, tek tek karolar yüklenir, aydınlatma düzeltilir ve birbirine dikilir, bu da kuyu ve döngü başına bir görüntü dosyası ile sonuçlanır. Dikiş için m2stitch kitaplığını (https://github.com/yfukai/m2stitch) kullanın.
    2. İlk hücredeki girişleri doğru dosya yollarıyla değiştirin. Not defterini yukarıdan aşağıya doğru yeniden yürütün .
  8. Döngüler arasında görüntü kaydı gerçekleştirin (Ek Dosya 5):
    1. Sol sekmede, bir sonraki not defterine gidin ve açın : "03_registration_pcc.ipynb". Bu not defterinde, tek tek döngüler, yalnızca açık erişimli scikit-image kitaplığından (https://scikit-image.org/) faz çapraz korelasyon algoritması ile hesaplanan öteleme dönüşümleri kullanılarak birbiriyle hizalanır.
    2. İlk hücredeki girişleri doğru dosya yollarıyla değiştirin. Kullanılacak bir referans döngüsü ve referans kanalı seçin (genellikle DAPI). Not defterini yukarıdan aşağıya doğru yeniden yürütün .
      NOT: "Seçenek 1: Tüm kanalları birlikte yükle ve kaydet" ve "Seçenek 2: Kanalları ayrı dosyalar olarak yükle ve kaydet" bölümlerinden yalnızca birinin yürütülmesi gerekir. İlk bölüm, tüm döngülerin tüm kanallarını içeren büyük bir dosya oluşturacaktır. İkinci bölüm, her kanal için ayrı bir dosya oluşturacaktır. İkinci seçenek, işlemek için daha az bellek gerektirecektir.

9. Görüntü Analizi (2.Gün)

  1. Fiji'yi (https://imagej.net/software/fiji/downloads) indirin ve açın.
    NOT: Ortaya çıkan görüntüler, 3D görüntüler olarak analiz edilebilecek çok düzlemli ve çok kanallı görüntüler olacaktır. Burada, yalnızca ilk olarak maksimum yoğunluk projeksiyonunun hesaplandığı 2B veriler için örnek bir analiz iş akışı gösterilmektedir.
  2. Dosyayı Fiji penceresine sürükleyerek Fiji'de açın.
  3. Görüntü | Yığınlar | Z Projesi..., Maksimum Yoğunluk'u seçin ve tamam'a basın. Görüntüyü Dosya | Farklı kaydet | OME-TIFF".
  4. Hücreleri analiz etmek için açık kaynaklı QuPath yazılımını kullanın; https://qupath.github.io/'dan indirip yükleyin.
  5. QuPath'i açın ve boş bir klasörü pencereye sürükleyerek yeni bir proje oluşturun.
  6. Tüm dosyaları QuPath penceresine sürükleyerek ve standart ayarlarla İçe Aktar'a basarak projeye aktarın.
  7. Açmak için sol paneldeki bir resme çift tıklayın. İstendiğinde Floresan olarak belirtin.
  8. Shift+C tuşlarına basarak Parlaklık/Kontrast penceresini açın.
    NOT: Burada hangi kanalların gösterileceği seçilebilir, parlaklık ve kontrast ayarlanabilir. Adlara çift tıklayarak kanal adlarını ve renklerini de değiştirebilirsiniz.
  9. Araçları Seçin | Çokgen aracını kullanın ve doku bölgesine açıklama ekleyin. Ek Açıklamalar sekmesi altında yeni bir ek açıklama arayın. Ek açıklamayı seçerek, bir sınıf seçerek (örneğin, Diğer) ve Sınıfı ayarla'ya basarak belirli bir sınıfa ayarlayın.
  10. Hücreleri Algıla: Analiz Et'e Git | Hücre algılama | Hücre algılama.
    1. Bir nükleer kanal seçin.
    2. Çoğu ayarı olduğu gibi bırakın, ancak fareyle bir çekirdeğin üzerine gelerek ve sağ alt köşede görüntülenen yoğunluğa dikkat ederek Eşiği ayarlayın. Bir arka plan bölgesinin üzerine gelin ve yoğunluğu tekrar not edin. Eşik olarak arka plan ile ön plan arasında bir değer seçin.
    3. Çalıştır'ı tıklayın.
  11. Hücreleri ve ölçümleri inceleyin:
  12. Bir hücreye çift tıklayarak veya Hiyerarşi sekmesinde hücreyi seçerek, sol alt paneldeki ölçümlerini inceleyin. Hücre, çekirdek ve sitoplazma için farklı şekil ve yoğunluk ölçümleri eklenmelidir.
  13. Hücreleri sınıflandırın:
    1. Tespit edilen hücreleri bir kanaldaki yoğunluğa göre sınıflandırmak için Sınıflandır | Nesne sınıflandırması | Tek bir ölçüm sınıflandırıcısı oluşturun.
    2. Kanal filtresi altında istediğiniz kanalı ve Ölçüm altında uygun bir ölçüm seçin (örneğin, Hücre: Kanal ortalaması).
    3. Tekrar pozitif bir hücrenin ve negatif bir hücrenin üzerine gelerek ve ikisi arasında bir değer seçerek eşiği ayarlayın.
    4. Örneğin, Eşiğin Üstünde için Pozitif'i ve Eşiğin Altında için Negatif'i seçin. Canlı önizlemeyi kontrol ederek sonucu kontrol edin.
    5. Hücreleri sınıflandırmak için Uygula'ya basın.
  14. Açıklamalı nesnelere olan mesafeyi ölçün (örneğin, sinir demetleri):
    1. Araçları Seçin | Fırça aracı.
    2. İlgilenilen bölgelerin (örneğin sinir demetleri) üzerinden çizim yapın.
    3. Ek Açıklamalar sekmesine gidin. Tüm yeni ek açıklamaları seçin, ilgili sınıfı seçin ve Sınıfı ayarla'ya basın.
      NOT: Sınıf penceresine sağ tıklayıp Ekle/Kaldır | Sınıf ekle.
    4. Mekansal Analizi Analiz Etme | Ek açıklamalara 2D olan mesafeyi işaretleyin ve istendiğinde Evet'e basın.
    5. Her hücreye, belirli bir sınıfın en yakın ek açıklamasına olan uzaklığı gösteren yeni bir ölçüm ekleyin.
  15. İhracat ölçümleri:
    1. Ölç'e Git | Algılama ölçümlerini gösterin ve tüm algılamaların tüm ölçümlerinin bir listesinin görünmesini bekleyin.
    2. Tabloyu Kaydet düğmesiyle .txt olarak dışa aktarın.
    3. Verileri daha fazla analiz edilmek üzere tercih edilen veri işleme yazılımına aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, sabit donmuş murin derisi kesitlerinde EdU Click-iT kimyasını IBEX ile birleştirerek çoğalan hücre tiplerinin yeterli şekilde saptanmasını sağlar. Çoğalan hücre tiplerinin tespiti, özellikle çoğalan hücre tiplerinin Ki-67 antikoru ile etiketlenmesi ve EdU Click-iT kimya yaklaşımı kullanılarak hücre proliferasyonunun tespiti gibi farklı metodolojiler kullanılarak karşılaştırıldı (Şekil 1). Ki-67 antikor etiketlemesinin, sabit donmuş murin derisi kes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre çoğalması, cilt onarımının dört ana aşamasından biridir ve inflamatuar faz ile proliferatif faz arasındaki geçiş, başarılı bir onarım süreci için kritik öneme sahiptir20. Uzun süreli inflamasyon, önemli bir küresel sağlık sorunu olan kronik yaralara yol açabileceğinden, iyi düzenlenmiş bir bağışıklık tepkisi esastır 1,21. Proliferasyon, yalnızca doku onarımı için değil, aynı zamanda karsinojenez de d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek hiçbir çıkarları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MD ImageXpress mikroskobu ile destekleri için Mikroskopi ve Görüntü Analizi Merkezi'ne ve fare yetiştiriciliği için Laboratuvar Hayvanları Hizmetleri Merkezi'ne teşekkür ederiz. LS, iki İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibesi (310030_192075 ve 310030_207801), bir İsviçre Kanser Araştırma Vakfı hibesi (KLS-5391-08-2021) ve SKINTEGRITY tarafından finanse edildi. CH işbirlikçi araştırma konsorsiyumu. SS, Zürih Üniversitesi Doktora Sonrası Bursu (FK-22-056) tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikorlar ve reaktifler KAYNAKTANIMLAYICIYorum
antikorlar
CD31 Alexa Fluor 647 (Döngü 2) BioLegendCat#1025161:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Döngü 2) BioLegendCat#1031221:100
AB_493531
Ki-67 FITC (1. Döngü) & nbsp;BioLegendCat#1512121:50
AB_2814055
Ki-67 tavuk (ck)LSBioCat#LS-C7729461:800
Ki-67 sıçan (rt) BioLegendCat#6524021:100
AB_11204254
Nörofilament H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Döngü 3) BioLegend Cat#8377101:300
AB_2734613
p75NTR (1. Döngü) Hücre Sinyal TeknolojisiCat#8238                                            AB_108392651:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Döngü 3) BioLegendCat#6993051:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 eşek anti tavşanJackson ImmunoResearchCat#711-605-152
Reagentler 
Cellvis 24 kuyu cam taban plakasıCellvis P24-1.5H-N
Krom alum jelatiniYeni Gelen TedarikCat#1033A
Click-iT EdU kit Thermo Fisher ScientificC10637
Hoechst 33342Sigma-AldrichCat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Lityum Borohidrid, %95Thermo Fisher ScientificCat#10438443
Tissue-Tek O.C.T Bileşik SakuraBiosystems İsviçreCat#7109-4583
PBSThermo Fisher ScientificCat#10010-015
Superfrost Plus Yapışma Mikroskopu Slaytları EprediaCat#J1800AMNZ
Triton X-100Sigma-Aldrich Cat#T8787
Ekipman
Saç fırçası Faust AGCat#9172051 ve 9172050
Microtom bıçakları Biosystems İsviçreCat#207500011
MikroskopMoleküler Cihazlar, ImageXpress Konfokal HT.ai
Fırın Thermo Fisher ScientificCat#HBMCR4220
Rocker shakerEdmund Bü hler GmbHCat#32310015

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
  2. Martin, P. Wound healing - aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Harsum, S., Clarke, J. D. W., Martin, P. A reciprocal relationship between cutaneous nerves and repairing skin wounds in the developing chick embryo. Dev Biol. 238 (1), 27-39 (2001).
  5. Barker, A. R., Rosson, G. D., Dellon, A. L. Wound healing in denervated tissue. Ann Plast Surg. 57 (3), 339-342 (2006).
  6. Rinkevich, Y., et al. Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9846-9851 (2014).
  7. Donnerer, J., Schuligoi, R., Stein, C. Increased content and transport of substance P and calcitonin gene-related peptide in sensory nerves innervating inflamed tissue: Evidence for a regulatory function of nerve growth factor in vivo. Neuroscience. 49 (3), 693-698 (1992).
  8. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Derm Venereol. 96 (5), 587-597 (2016).
  9. Johnston, A. P. W., Naska, S., Jones, K., Jinno, H., Kaplan, D. R., Miller, F. D. Sox2-mediated regulation of adult neural crest precursors and skin repair. Stem Cell Rep. 1 (1), 38-45 (2013).
  10. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  11. Johnston, A. P., et al. Dedifferentiated Schwann cell precursors secreting paracrine factors are required for regeneration of the mammalian digit tip. Cell Stem Cell. 19 (4), 433-448 (2016).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  13. Uxa, S., Castillo-Binder, P., Kohler, R., Stangner, K., Müller, G. A., Engeland, K. Ki-67 gene expression. Cell Death Differ. 28 (12), 3357-3370 (2021).
  14. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: More than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  15. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nat Commun. 8 (1), 14836(2017).
  16. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Sci Rep. 7 (1), 4358(2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  19. Parfejevs, V., et al. Injury-activated glial cells promote wound healing of the adult skin in mice. Nat Commun. 8 (1), 14396(2018).
  20. Peña, O. A., Martin, P. Cellular and molecular mechanisms of skin wound healing. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (8), 599-616 (2024).
  21. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  22. Dowsett, M., Dunbier, A. K. Emerging biomarkers and new understanding of traditional markers in personalized therapy for breast cancer. Clin Cancer Res. 14 (24), 8019-8026 (2008).
  23. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: Recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  24. Gerdes, J., et al. Prognostic relevance of tumour-cell growth fraction in malignant non-Hodgkin's lymphomas. Lancet. 330 (8556), 448-449 (1987).
  25. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ImagingSkin Cell PhenotypesCell Proliferation StatesIBEX MethodClick iT EdU LabelingSpinning Disk ConfocalMultiplexed ImagingImage Processing PipelineTissue RegenerationCell Proliferation Markers

Related Articles