Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Özet

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS), müsin glikanlarının profillenmesi için yüksek hassasiyet ve verim sunan güçlü bir araçtır. Burada, MALDI-TOF MS kullanarak müsinlerden O-bağlı glikanların analizi için glikan salınımı, tuzdan arındırma, permetilasyon ve veri toplama ve analizini kapsayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu çalışma, iyon değişim kromatografisine dayalı tuzdan arındırmanın, gözenekli grafitleştirilmiş karbon (PGC) kullanılarak katı faz ekstraksiyonuna kıyasla daha büyük glikanların daha iyi geri kazanımına ve üretilen spektrumların daha iyi kalitesine yol açtığını göstermektedir. Ek olarak, bu çalışma, sialillenmiş yapıların verimli bir şekilde modifiye edilmesi için şu anda kullanılandan daha uzun bir permetilasyon reaksiyon süresinin gerekli olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, glikan bileşiminin ve yapısının doğru bir şekilde tanımlanması için parçalanma verilerinin ve O-glikan biyosentetik yollarının ön bilgisinin önemini ve gerekliliğini gösteriyoruz ve MALDI-TOF'un müsin O-glikanlarının analizinde sunduğu doğal faydaları ve sınırlamaları tartışıyoruz.

Giriş

Müsinler, mukustaki yapısal bileşenlerin çoğunu oluşturan büyük glikoproteinlerdir. Goblet hücreleri adı verilen özel epitel hücreleri tarafından üretilirler ve mukozal yüzeyde salgılanmadan önce geniş O-glikosilasyona uğrarlar. Müsinlerin glikozilasyonu, özel bir glikosiltransferaz ailesi, polipeptit-N-asetilgalaktozamin transferazları (ppGalNAc-T), bir GalNAc kalıntısını bir serin (Ser) veya bir treonine (Thr) bağlayarak işlemi başlattığı Golgi aygıtında ^{gerçekleşir.1}. Daha sonra, bir glikosiltransferaz cephaneliği, galaktoz (Gal), N-asetilglukozamin (GlcNAc), GalNAc, N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve fukoz (Fuc) kalıntıları ekleyerek glikan yapılarını genişletirken, diğer karbonhidrat modifiye edici enzimler glikanların sülfatlanması gibi reaksiyonları gerçekleştirebilir¹. Müsin proteini omurgasını süsleyen glikanlar, esas olarak Ser ve Thr kalıntıları bakımından zengin protein bölgelerindeki kümeler halinde bulunur, çünkü bu kalıntıların yan zincirindeki hidroksil grupları O-glikosilasyon bölgeleri olarak işlev görür. Bu yoğun glikozilasyon, müsinlere bir "şişe fırçası" görünümü verir ve büyük miktarlarda su tutma kabiliyeti, jel oluşturma kabiliyeti ve yüksek viskoelastisite ^2,3 gibi fiziksel özelliklerinden sorumludur. Bu özelliklerinden dolayı müsinler kayganlık sağlar, epiteli dehidrasyondan ve fiziksel yaralanmalardan korur ve epitel ile mikro çevresi arasında fiziksel bir bariyer oluşturur ^4,5. Müsin glikanları ayrıca bağlanma bölgeleri ve kommensal veya patojenik bakteriler için bir karbon kaynağı olarak da işlev görebilir ^6,7,8. Mukusun organizasyonu ve bileşimi, mikropları epitel yüzeyine yakın ancak uzak tutarak epitelin korunmasında etkilidir. Müsin glikanları ayrıca hücre-hücre iletişimine ve yapışmaya^{da katılır 9}.

Müsin glikanları, mukozal homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar ve anormal müsin glikozilasyon profilleri, bozulmuş bariyer fonksiyonu, değişmiş mikrobiyota bileşimi, artmış tümör metastazı, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve diğer hastalıklarla ilişkilidir 10,11,12. Bu nedenle, müsin glikozilasyonunun incelenmesi, mukus ve müsinlerin insan sağlığındaki rolünü anlamada önemlidir ve hastalıkların yönetimi veya tedavisinde yeni yaklaşımlara yol açabilir.

Kütle spektrometresi tabanlı teknikler, müsin glikanlarını incelemek için en popüler seçenekler arasındadır. MALDI-TOF MS, glikanlar ve glikoproteinler gibi büyük, uçucu olmayan biyomoleküllerin analizini sağlayan yumuşak bir iyonizasyon tekniğidir¹³. Bu yaklaşım, yüksek hassasiyet ve geniş bir kütle aralığı sunarak, düşük miktarda bulunan ve çeşitli glikan karışımlarının tespit edilmesine ve tanımlanmasına olanak tanır. Ek olarak, tandem kütle spektrometresi (MS/MS) deneylerinden elde edilen parçalanma modelleri, glikan bileşimi ve dizi¹³ hakkında değerli yapısal bilgiler sağlayabilir.

Tipik olarak, müsinlerden O-bağlı glikanların MALDI-TOF MS ile analizi, O-glikanların önce indirgeyici β-eliminasyon gibi yöntemler kullanılarak protein omurgasından kimyasal olarak salındığı, daha sonra tuzları kimyasal salınımdan çıkarmak için tuzdan arındırıldığı ve iyonizasyon ve algılamayı geliştirmek için türetildiği çok aşamalı bir iş akışını içerir. Saflaştırılmış, türetilmiş glikanlar daha sonra bir MALDI hedef plakası üzerinde uygun bir MALDI matrisi ile birlikte kristalize edilir ve bozulmamış glikan iyonlarının kütleleri hakkında bilgi sağlayan kütle spektrumları elde edilir. Bunu takiben, glikanlar, glikanların yapısı hakkında bilgi vermek için MS / MS deneylerinde parçalanır¹⁴. Burada, glikanları serbest bırakmak, tuzdan arındırmak ve permetillemek ve bunları MALDI-TOF MS ile analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Protokol

NOT: İş akışının şematik gösterimi için Şekil 1'e bakın.

Şekil 1: Deneysel iş akışının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Glikan salınımı

1. β eliminasyon tamponunun hazırlanması
   NOT: Bu, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
   1. Bir sodyum hidroksit (NaOH) peletini tartın ve 0,1 M'lik bir çözelti elde etmek için 50 mL'lik bir tüpte uygun miktarda_H2Oiçinde çözün.
   2. 5 mL'lik bir tüpte, 189 mg sodyum borohidrürü (NaBH₄) yukarıda adım 1.1.1'de hazırlanan alkali çözeltinin 5 mL'sinde çözün.
      DİKKAT: NaOH aşındırıcıdır ve NaBH₄ aşındırıcı, toksik, yanıcıdır ve sağlık açısından tehlike oluşturur. Her iki kimyasal da uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak bir çeker ocak altında kullanılmalıdır. NaBH_4'ü doğrudan H₂O'da çözmeyin, çünkü kendi kendine tutuşabilen hidrojeni ayrışır ve serbest bırakır.
2. β eliminasyon reaksiyonunun kurulması
   1. 4 mL'lik bir cam şişede, 250 μL_H2O'da100 μg'a kadar saflaştırılmış müsini çözün.
      NOT: Bazı müsinler tamamen çözünmeyebilir ve bunun yerine çok küçük parçacıklardan oluşan bir süspansiyon oluşturabilir.
   2. 250 μL β eliminasyon tamponu ekleyin ve şişeyi PTFE kaplı bir kapakla sıkıca kapatın. Reaksiyonu 45 ^{° C'de}16 saat inkübe edin.
3. Reaksiyonun durdurulması
   1. 100 mL'lik bir cam şişede, 95 mL_H2O'ya(%5 (h/h) konsantrasyon) 5 mL buzlu asetik asit ekleyin.
      NOT: Bu, oda sıcaklığında saklanabilir ve tekrar kullanılabilir.  DİKKAT: Asetik asit yanıcı ve aşındırıcıdır ve gerekli kişisel koruyucu ekipmanla birlikte çeker ocakta kullanılmalıdır.
   2. Buz üzerinde, her reaksiyona (adım 1.2.3) damla damla 1 mL %5 asetik asit çözeltisi ekleyin. Bu noktada, NaBH_4'ün fazlalığından hidrojen salınımından kaynaklanan köpürme olup olmadığına bakın. 1 mL% 5 asetik asit ilavesinden sonra köpürme durmadıysa, bu adımı tekrarlayın.
      NOT: %5 asetik asit ilavesi üzerine köpürme olmazsa, β eliminasyon reaksiyonu eksik veya başarısız olabilir.
4. Numunelerin tuzdan arındırılması
   1. 100 mL'lik bir cam şişede,% 5 (h / h) asetik asit içinde 200-400 ağ yoğun bir katyon değişim reçinesi süspansiyonu hazırlayın.
   2. Az miktarda cam yünü ile bir cam pipeti tıkayın. 1.5 mL reçine süspansiyonunu üstten cam pipete ekleyin ve oturmasına ve süzülmesine izin verin. Bu, tuzdan arındırma sütununu yapacaktır.
   3. Reçineyi 2 mL% 5 asetik asit ile yıkayın. Akışı atın.
   4. Müsin örneğini tuzdan arındırma kolonuna ekleyin. Akışı 5 mL'lik bir tüpte toplayın.
   5. Numune şişelerini 1 mL %5 asetik asit ile durulayın ve bunu tuzdan arındırma kolonuna yükleyin. Akışı aynı tüpte toplayın.
   6. Kolonu 2x 1 mL% 5 asetik asit ile yıkayın. Akışı aynı tüpte toplayın.
   7. Asetik asidi çıkarmak ve numuneleri konsantre etmek için santrifüjlü bir evaporatör kullanın (5 mbar, 30 ^oC, 2 saat).
   8. Numuneleri -80 ^{° C'de}dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutucuda kurutun.
      NOT: Alternatif olarak, santrifüjlü buharlaşma kurumaya devam edebilir, ancak numunelerin yeniden çözülmesini daha zor hale getirecektir.
   9. 100 mL'lik bir cam şişede, 95 mL metanole (%5 (h/h) konsantrasyon) 5 mL asetik asit ekleyin.
      DİKKAT: Metanol yanıcı ve zehirlidir. Gerekli kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır.
   10. Numuneleri 0,5 mL metanolik asetik asit içinde çözün ve numuneleri bir nitrojen akışı altında kurutun. Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın. Kurutulmuş numuneleri 4 ^°C'de saklayın.
5. Glikanların permetilasyonu
   1. 8 mL'lik bir cam şişede,% 50 NaOH çözeltisini (0.2 mL) 0.4 mL metanol ile karıştırın ve iyice girdaplayın. Tekrar hızlı bir şekilde çözülecek beyaz bir çökelti oluşacaktır.
   2. Bir cam şırınga kullanarak 4 mL susuz dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve iyice girdaplayın.
   3. Çözeltiyi 2.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Bu, tüpün dibinde bir jel, ortada sıvı bir faz ve üstte biriken tuzlar oluşturacaktır.
   4. Jeli bozmadan süpernatanı ve tuzları dikkatlice boşaltın.
   5. Daha fazla tuz oluşmayana kadar 1.5.2-1.5.4 adımlarını 5 kez tekrarlayın. Tuzlar tüpün duvarlarına yapışırsa, alttaki jeli bozmadan tuzları süspansiyon haline getirmek için tüpü hafifçe döndürün veya bir cam Pasteur pipeti kullanarak çıkarın.
   6. Daha fazla tuz oluşmadıktan sonra, jeli 4 mL susuz DMSO'da yeniden süspanse edin. Bu süspansiyon permetilasyon bazıdır.
      NOT: Bu miktardaki permetilasyon bazı ~25 numune için yeterlidir. Miktarlar buna göre ayarlanabilir.
   7. Kurutulmuş numunelere 100 μL susuz DMSO ve 150 μL permetilasyon bazı ekleyin. Bir cam pipet kullanarak, ortamdan nem emilimini önlemek için mümkün olan en kısa sürede 80 μL iyodometan ekleyin.
      DİKKAT: İyodometan toksiktir ve sağlık ve çevre için tehlike oluşturur. Gerekli kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır.
   8. Permetilasyon reaksiyonlarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuvvetli çalkalama ile inkübe edin.
   9. Reaksiyonu sonlandırmak için 0.5 mL H₂O ekleyin. Numuneler bulanıklaşacak.
      NOT: Numuneler bulanıklaşmazsa, permetilasyon reaksiyonunun eksik olması mümkündür.
   10. Numuneleri berraklaşana kadar nitrojenle yıkayın.
   11. Numuneleri Hidrofilik-Lipofilik Dengeli (HLB) 96 oyuklu ekstraksiyon plakasına (60 mg) veya HLB kartuşlarına yükleyin. Numuneleri ~1 mL/dk'lık bir akış hızında katı fazdan itmek için pozitif basınç uygulayın. HLB kartuşları kullanıyorsanız, numunelere basınç uygulamak için kauçuk bir emzik veya vakum manifoldu kullanın. Akışı atın.
   12. Kuyuları 2 x 1 mL H₂O ile yıkayın. Pozitif basınç uygulayın ve akışı atın.
   13. 1 mL metanol kullanarak glikanları HLB plakasından çıkarın. Basınç uygulayın sadece metanol plakadan çıkmaya başlayana kadar olur. Daha sonra, yerçekimi akışı gerekli akış hızını vermek için yeterlidir. Akışı toplayın.
   14. Elüsyon adımını bir kez daha tekrarlayın.
   15. Numuneleri santrifüjlü bir evaporatör kullanarak kurutun
   16. 4 mL'lik bir cam şişede, 1 mL asetonitril, 998 μL_H2Ove 2 μL trifloroasetik asidi karıştırarak TA50 tamponunu hazırlayın.
       DİKKAT: Asetonitril yanıcıdır ve trifloroasetik asit aşındırıcıdır. Her ikisi de uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak çeker ocakta kullanılmalıdır.
   17. Bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 mg süper DHB'yi [9: 1 (a/a) 2,5-dihidroksi benzoik asit ve 2-hidroksi-5-metoksibenzoik asit karışımı] 1 mL TA50 içinde çözerek matris çözeltisini hazırlayın.
   18. Kurutulmuş numuneleri 10 μL TA50 içinde çözün.
   19. Numunenin 1 μL'sini 1 μL matris solüsyonu ile karıştırın, çelik bir MALDI hedef plakasına yerleştirin ve kurumasını bekleyin.

2. Numunelerin MALDI TOF analizi

1. Ana iyon verilerini almak için ayarlama
   1. Lazerden %50 yoğunlukta 1.000 atış yapın.
      NOT: Bunlar, genel cihaz ayarlarına bağlı olarak değişebilir ve gerektiği gibi ayarlanabilir.
   2. Lazer taşıyıcı sekmesi altında, numuneyi tamamlamak için rastgele yürüyüş ayarını ayarlayın.
   3. Algılama sekmesi altında, kütle aralığını 500 - 3.000 olarak ayarlayın; 2.500-3.000 m/z'de güçlü zirveler gözlenirse bu aralığı artırın. Dedektör kazancını 20x'e ayarlayın.
      NOT: Kazanç, cihazın genel ayarlarına bağlı olarak değişebilir ve gerektiği gibi ayarlanabilir.
   4. Spektrometre sekmesi altında, polariteyi pozitif olarak ve Matris Bastırmayı Sapma, 300 Da olarak ayarlayın.
   5. Başlat'a tıklayın | veri alımı tamamlandığında, verileri uygun bir dizine kaydetmek için Farklı kaydet'i kullanın.
2. Parçalanma spektrumlarını elde etmek için ana spektrumların açılması
   1. Spektrumlara sağ tıkladıktan sonra Kütle Listesini Bul'u seçin.
   2. Oluşturulan listeden parçalanma için ilgili iyonları seçin ve seçilen tepe noktalarına sağ tıkladıktan sonra MS/MS listesine ekle seçeneğine tıklayın.
   3. Toplu listeye tekrar sağ tıklayın ve MS/MS listesini seçin.
   4. flexControl'e Gönder'e tıklayın.
   5. flexControl'de LIFT yöntemini yükleyin ve LIFT sekmesine gidin.
   6. Yüklenen her bir tepe noktasını tek tek seçin ve Ana ve Parça modları arasında geçiş yaparak hem ana hem de parça iyonlarını elde edin. Lazer yoğunluğunu ve çekim sayısını gerektiği gibi ayarlayın. Her bir ana iyonun parçalanmasından sonra verileri kaydetmek için Kaydet'e tıklayın.
   7. Spektrumları '.ascII' biçiminde dışa aktarın.
      NOT: Bu daha sonra daha fazla analiz için Glycoworkbench'e aktarılabilir.
3. Glycoworkbench kullanarak veri analizi
   1. Glycoworkbench'te, kütle spektrumunun dışa aktarılan .ascII dosyasını yükleyin ve tepe merkezlerini hesaplamadan önce pencerenin altındaki ilgili düğmeleri kullanarak bir temel düzeltme ve gürültü filtreleme gerçekleştirin. Açılır pencerede uygun kütle aralığını, Min sinyal/gürültü oranını ve Min MS tepe yoğunluğunu seçin.
   2. Tepe sentroidleri hesaplandıktan sonra, tepe listesiyle eşleşen yapı bileşimlerini bulmak için Glyco-Peakfinder aracını kullanın. Türettirme olarak perMe'yi, İndirgeme Ucu olarak redEnd'i ve beklenen kalıntıların minimum ve maksimum sayısını seçin.
      1. Müsinler için Heksoz, N-Asetil-Heksozamin, Deoksi-Heksoz ve N-Asetil-Nevoraminik asit seçin. Sülfatlanmış glikanlar için, kütlesi 87.9 olan diğer kalıntı seçeneğini kullanın. MALDI-TOF verileri için Maks # Na iyonlarını ayarlayın ve Maks # şarjları 1 ve doğruluk 0,5 Da olarak ayarlanmıştır.
         NOT: Kütle spektrometresinin kalibrasyonuna bağlı olarak doğruluğun daha da artırılması gerekebilir.
   3. Kontrol tuşunu basılı tutarak ve her bir ek açıklamaya tıklayarak tüm doğru ek açıklamaları seçin; ardından ek açıklamaya sağ tıklayın ve Açıklamalı tepe listesine ekle'ye tıklayın.
   4. Birden çok açıklamalı spektrumu karşılaştıran bir rapor oluşturmak için, araçlar sekmesinde, raporlama'nın altında, Farklı profilleri karşılaştıran bir rapor oluştur'u seçin. Raporu kaydetmek için PDF olarak yazdırın.
   5. Glikan tepe noktalarını belirledikten sonra, her bir yapının nispi bolluğunu, tüm glikan tepe noktalarının eğrisi altındaki toplam alanın yüzdesi olarak hesaplayın.
   6. Parçalanma spektrumlarının analizi için, spektrumları Glycoworkbench'e yükleyin ve adım 2.3.1'deki gibi tepe listesini oluşturun.
   7. Açıklamalı glikan bileşimlerine karşılık gelen varsayılan glikan yapılarını çizin. Parçalar aracı altındaki ilgili hesaplama parçaları seçeneğini belirleyerek çizilen her yapı için parçalar oluşturun. Ardından, tüm parçaları seçin, üzerlerine sağ tıklayın ve Parçaları tuvale kopyala'ya tıklayın.
   8. Parçalanma analizini daha fazla desteklemek için, spektrum görüntüleyicide üzerine tıklayarak bir ilgi zirvesi seçin. Ardından, sağ tıklayıp Tepe noktalarıyla eşleşen tüm yapıları bul'u seçerek, seçilen tepe noktasının m/z'sini varsayılan glikan yapıları için çevrimiçi veritabanlarına karşı sorgulayın.
   9. İlgilenilen varsayılan yapıları seçin ve sağ tıklayıp uygun seçeneği seçtikten sonra bunları yazılımın tuval penceresine kopyalayın.
   10. Her glikan yapısından oluşturulabilecek olası parçaları hesaplamak için, tuvalde ilgilenilen yapıyı seçin ve ardından Araçlar sekmesi altında, geçerli yapı için Parçalar ve Parçaları hesapla'yı seçin .
   11. Birden fazla glikan yapısı için parçalar hesaplanmışsa, Fragmanlar tablosu görünümü altındaki özet sekmesindeki karşılaştırma tablosunu görüntüleyin.
   12. Her potansiyel glikan yapısı için tepe listesiyle eşleşen parçaları seçin ve sağ tıklama açılır menüsünden Parçaları tuvale kopyala'yı seçin.
   13. Araçlar sekmesinde, profil oluşturucu altında, tüm yapılarla tepe noktalarına açıklama ekle'yi seçin ve ardından Araçlar | Raporlama | Ek açıklamaların bir raporunu oluşturun. Raporu kaydetmek için PDF olarak yazdırın.

Sonuçlar

Aşağıdaki sonuçlarda, tuz giderme ve permetilasyon adımlarını optimize etmek için domuz gastrik müsini (PGM) kullanıldı. Yaygın olarak kullanılan iki tuzdan arındırma yaklaşımını karşılaştırmak için, glikanların salınmasından sonra, numuneler ya katyon değişimi (yukarıdaki protokolde tarif edildiği gibi) ve boratın metanol ile birlikte buharlaştırılması ya da gözenekli grafitleştirilmiş karbon (PGC) kartuşları ile katı faz ekstraksiyonu yoluyla tuzdan arındırıldı. Bu, kartuşun %80 asetonitril ve %100 H₂O ile ön koşullandırılmasını, %0,1 (h/h) trifloroasetik asit (TFA) ile bir yıkama aşamasını ve glikanların %0,1 TFA'da 2 mL %25 asetonitril ile elüsyonunu gerektirir, %0,1 TFA'da 2 mL %50 asetonitril ve %0,1 TFA'da 2 mL %80 asetonitril ile elüsyonunu gerektirir.

Permetilasyondan sonra ortaya çıkan spektrumlar m/z 500 ila m/z 2.500 aralığında analiz edildi. İyon değişimi ve borat giderimi ile tuzdan arındırılan numunede toplam 33 glikan yapısı tanımlanırken, PGC ekstraksiyonu ile tuzdan arındırılan numunede 32 yapı tanımlanmıştır (Şekil 2A). PGC tuzdan arındırılmış numunede bir glikan yapısı tanımlanmamıştır ( Şekil 2A'da bir yıldız işareti ile işaretlenmiştir). Bu karşılaştırmalı analiz, daha büyük glikanların geri kazanımının, iyon değişimine kıyasla PGC ekstraksiyonundan sonra o kadar verimli olmadığını gösterdi. Bu aynı zamanda, iyon değişimi için %31'in aksine, PGC ekstraksiyonundan sonra toplam glikanların% 21'ini oluşturan daha büyük glikanların nispi bolluğu ile de kanıtlanmıştır. Ayrıca, iyon değişimi ve borat uzaklaştırma ile tuzdan arındırma, PGC ile katı faz ekstraksiyonu ile tuzdan arındırma işleminden sonra üretilenlere kıyasla daha yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip spektrumlara yol açmıştır (Şekil 2B).

Permetilasyon reaksiyon süresini optimize etmek için, aynı permetilasyon reaksiyonunun alikotları, farklı zaman noktalarında (yani 5 dakika, 30 dakika veya 90 dakika) H₂O eklenerek söndürüldü. Sonuçlar, m/z 500 ila m/z 2.500 aralığında, 30 veya 90 dakika boyunca permetillenmiş numunelerde 33 glikan zirvesinin tanımlanabileceğini ve elde edilen spektrumların benzer olduğunu gösterdi. Buna karşılık, 5 dakika boyunca permetilasyon gerçekleştirildiğinde sadece 31 glikan zirvesi tanımlanabildi (Şekil 3). İlginç bir şekilde, bu daha kısa reaksiyon süresinde tanımlanmayan iki yapı ( Şekil 3'te bir yıldızla işaretlenmiştir) iki sialillenmiş yapıdır, bu da sialik asitlerin modifikasyonunun test edilen koşullar altında 5 dakika içinde verimli olmadığını düşündürmektedir.

Glikan bileşimini doğrulamak ve glikan yapısını belirlemek için her PGM glikan zirvesi için parçalanma kullanıldı. Burada iki örnek sunulmuştur (Şekil 4). Şekil 4A'da, 983 m/z'deki bir tepe noktasının parçalanma spektrumu sunulmuştur. Glikan bileşimi HexNAc₂Hex₂ olarak adlandırılır. Bu glikan bileşimi için Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glikan 1) veya Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glikan 2) olmak üzere iki potansiyel yapı vardır. Bu bileşiğin parçalanması, glikanın farklı parçalarına atanabilen tepe noktalarına sahip bir kütle spektrumu üretti. m/z 529'daki tepe noktası ve m/z 708'deki tepe noktası, sırasıyla yapı 1 ve 2'nin karakteristiğidir ve PGM glikan karışımında hem glikan 1 hem de 2'nin mevcut olduğu sonucuna varabiliriz.

Şekil 4B'de, m/z 2,026'daki bir zirvenin parçalanma spektrumu sunulmuştur. Glycoworkbench, bu tepe için iki potansiyel glikan bileşimi hesapladı, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ ve Hex₃HexNAc₄dHex₂. Sialillenmiş bileşim daha düşük bir doğruluğa sahiptir (sırasıyla ~ 160 ppm ve 178 ppm), bu da ilkinin doğru seçim olması gerektiğini düşündürür. Bununla birlikte, parçalanma profili Neu5Ac'nin değil Fuc'un varlığını gösterir; Bu nedenle, ikinci bileşim doğru olanıdır. Burada, dört varsayılan glikan yapısı sunulmuştur ve spektrum, her bir varsayılan glikan yapısından hesaplanan parçalarla açıklanmıştır. Açıklamalı spektrumda, yalnızca glikan 4 ve 6'ya özgü tepe noktalarının mevcut olduğunu, ancak glikan 3 ve 5'e özgü hiçbir tepe noktası tanımlanmadığını görebiliriz. Bu verilere dayanarak, glikan 4 ve 6'nın mevcut olduğu sonucuna varabiliriz.

Şekil 2: Tuzdan arındırma ve katı faz ekstraksiyonuna göre glikan piklerinin karşılaştırılması. (A) Katyon değişim kromatografisi ve borat uzaklaştırma veya PGC katı faz ekstraksiyonu ile tuzdan arındırıldıktan sonra PGM glikan profilinin karşılaştırılması. (B) Tanımlanan her glikan zirvesi için elde edilen sinyal-gürültü oranındaki iki tuzdan arındırma yaklaşımının karşılaştırılması. Yıldız işareti, yalnızca katyon değişimi ve boratın uzaklaştırılması ile tuzdan arındırılmış numunelerde tanımlanan glikanı belirtir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 5, 30 veya 90 dakika permetilasyondan sonra PGM glikan profilinin karşılaştırılması. Yıldız işaretleri, yalnızca 30 veya 90 dakikalık permetilasyondan sonra tanımlanan sialillenmiş glikanları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: PGM glikanlarından parçalanma spektrumu örnekleri. (A) Glikan zirvesinin m/z 983'te parçalanması. (B) Glikan zirvesinin m/z 2026'da parçalanması. Kutular potansiyel glikan yapılarını gösterir. Parçaların üzerindeki sayılar, hangi glikan yapısından türetilebileceklerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Glikanları incelemek için araştırmacılar, spesifik epitopları tanımlamak için lektinlerin kullanımından, glikan yapılarının ayrıntılı karakterizasyonunu elde etmek için daha karmaşık sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresine (LC-MS) ve nükleer manyetik rezonansa (NMR) kadar çeşitli metodolojiler kullanırlar. MALDI-TOF MS'in alternatif yaklaşımlara göre başlıca avantajları, yöntemin hassasiyeti ve yüksek verimli doğasıdır¹³. Bununla birlikte, izobarik bileşikleri ayırma yeteneği olmadığından, aynı m/z değerine sahip farklı glikan yapıları, MS/MS altında daha sonra dekonvolüsyonu zor olan bir parça karışımı üretir¹³. Müsin glikanlarının kesin yapısının belirlenmesi gerekiyorsa, LC-MS tercih edilen yöntem olmalıdır.

Burada, müsin glikanlarının MALDI-TOF MS ile analizi için, glikan salınımı, tuzdan arındırma ve permetilasyondan veri toplama ve analizine kadar süreçteki tüm kritik adımları içeren bir protokol sunuyoruz. Bu adımların her birinin farklı yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştirilebileceğini ve hepsinin ilişkili faydalar ve sınırlamalarla birlikte geldiğini kabul etmek önemlidir.

Bu protokolde, glikanları serbest bırakmak için indirgeyici β-eliminasyon kullandık. Reaksiyon temel koşullar altında gerçekleşir. Müsin numuneleri zaten süspansiyon halindeyse ve daha önce saflaştırılmamışsa, pH bir pH indikatör kağıdı kullanılarak kontrol edilmelidir; asidik ise, ~ 8-9 pH'a yükseltilmesi gerekir. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, glikanların salınması için gerekli olan temel koşulların aynı zamanda hidrolize ve dolayısıyla sabunlaşma olarak bilinen bir reaksiyonda sialik asitlerde sıklıkla bulunan O-asetil gruplarının kaybına yol açmasıdır.

Literatürde glikanların^(15,16,17,18) salınması için bazıları kararsız O-asetil gruplarını koruyabilen başka yöntemler tanımlanmış olsa da, indirgeyici β-eliminasyon bu alanda altın standart olmaya devam etmektedir. Bu yaklaşım, yüksek konsantrasyonda tuz gerektirir. Tuzlar ve diğer iyon baskılayıcı kirleticilerin, glikanların iyonizasyon verimliliğini ve miktar tayinini etkileyebileceğinden, MALDI-TOF analizinden¹⁹ önce çıkarılması gerekir. Burada, katyon değişim kromatografisi ve ardından boratın metanol buharlaştırma ile uzaklaştırılmasının, salınan glikanların müsinden tuzdan arındırılması için en etkili yaklaşım olduğu gösterilmiştir. Bu durumda, glikanlar reçine ile etkileşime girmez ve bunun yerine içinden akarken, sodyum iyonları reçine üzerinde tutulur. Bununla birlikte, iyon değişim kolonlarının hazırlanması zahmetlidir ve bu yaklaşımı çok sayıda numune içeren büyük ölçekli deneyler için verimsiz hale getirir. Bu gibi durumlarda, PGC tuzdan arındırma tercih edilebilir, çünkü bu reçine 96 oyuklu bir plaka formatında da mevcuttur. Bununla birlikte, yukarıda sunulduğu gibi, PGC ekstraksiyonu ile tuzdan arındırma, özellikle daha büyük glikanların verimsiz elüsyonuna yol açabilir ve sonuçlar yorumlanırken bu dikkate alınmalıdır.

Doğal glikanlar MALDI-TOF ile de analiz edilebilse de, bu reaksiyon tespit hassasiyetini önemli ölçüde artırdığı için genellikle permetilasyon kullanılır, çünkü doğal glikanlar düşük iyonlaşma verimliliğine^{sahiptir 20}. Ayrıca, permetilasyon, sülfatlanmış veya sialile edilmiş glikanlar gibi negatif yüklü glikanların pozitif modda tespit edilmesini kolaylaştırır ve sialik asitler veya fukoz²⁰ gibi kararsız glikan epitoplarını korur. En yaygın olarak, permetilasyonun 5-10 dakika çalışmasına izin verilir^14,21, bazı raporlar reaksiyonun 40 dakika^22'ye kadar devam etmesine izin verir. Burada, test edilen koşullar altında, sialillenmiş glikanların 5 dakikalık permetilasyondan sonra verimli bir şekilde tespit edilmediğini ve daha uzun bir inkübasyonun gerekli olduğunu gösterdik.

Reaksiyon süresine ek olarak, permetilasyon verimliliğini etkileyebilecek bir diğer faktör de reaksiyondaki su içeriğidir. Suyun varlığı, tüm hidroksil gruplarının metil gruplarına²³ dönüştürülmediği durumlarda glikanların yetersiz metilasyonuna veya kısmi metilasyonuna yol açabilir. Bu, düşük metilasyon meydana gelmiş gibi kolayca belirlenebilir, kütle spektrumlarında 14 Da (hidroksil ve metil grupları arasındaki kütle farkı) ile farklılık gösteren tepe grupları gözlemlenebilir. Bu sorun, permetilasyon reaksiyonunun tekrarlanması ve verilerin yeniden analiz edilmesiyle ele alınabilir.

Glikan analizinde sınırlayıcı bir faktör, spektrumların yorumlanmasıdır. Son gelişmelere rağmen, bu süreç hala büyük ölçüde manueldir ve spektrumları doğru bir şekilde açıklamak için glikan biyosentetik yollarının iyi bilgi ve anlayışını gerektirir. Glycoworkbench²⁴ gibi araçlar, olası ek açıklamalar, glikan yapıları ve bileşimler sağlayarak yardımcı olabilir, ancak glikan karışımlarının doğal heterojenliği nedeniyle, araştırmacıların hangi seçimin doğru olduğuna karar vermeleri gerekir. Yukarıda PGM kullanılarak sunulan örnekte, Glycoworkbench, mz 2,025.7620'deki zirve için iki potansiyel glikan bileşimi sundu ve parçalanma profiline dayanarak, sialillenmiş olandan ziyade fukosile yapının mevcut olduğu sonucuna vardık. Bununla birlikte, bir parçalanma spektrumu mevcut değilse (ki bu genellikle düşük miktarda glikanlar için geçerlidir), araştırmacılar ek açıklamayı, Hex3HexNAc1Neu5Ac3 bileşimine sahip glikanların müsinler yerine gangliositlerde bulunduğu bilgisine dayandırabilirler ve bu nedenle bu seçenek PGM bağlamında düşünülmemelidir. Bu nedenle, tanımlanan glikan yapıları veya bileşimleri, önceki yayınlara çapraz referans verilmeli ve O-glikan biyosentezi ilkeleriyle uyumlu olmalıdır. Genel olarak, bu protokol, özellikle glikobiyoloji alanında yeni olan ve mukozal arayüzde meydana gelen etkileşimlerin incelenmesine ilgi duyan araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
150 mm cam pasteur pipetleri	Fisher Scientific	15202699	Tüketim malzemeleri Metinde referans (varsa): cam pipet
5 mL tüpler	Eppendorf	30122305	Sarf
96 kuyulu HLB ekstraksiyon plakası	Fisher Scientific	16553290	Sarf
asetik asit	Sigma-Aldrich	A6283	Reaktif
asetonitril	Fisher Scientific	15624520	Reaktif
susuz DMSO	Sigma-Aldrich	5.89569	Reaktif
susuz metanol	Sigma-Aldrich	5.89596	Reaktif
Otoflex kütle spektrometresi	Bruker		Ekipman
DOWEX 50w x8 reçine, H+ formu, 200-400 ağ	Sigma-Aldrich	44519	Reagent Metindeki referans (varsa): katyon değişim reçinesi
Kuru blok ısıtıcı	Bahşetmek	QBD2	Ekipman
Blok Isıtıcılar için Evaporatör/Konsantratör	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Ekipman
flexAnalysis	Bruker		Yazılım, tescilli
flexControl	Bruker		Yazılım, tescilli
Cenevrak EZ-2	Biopharma	EZ-2	Ekipman Metinde referans (varsa): santrifüj evaporatörü
Eşleşen PTFE kapaklı cam şişeler (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Sarf
Eşleşen PTFE kapaklı cam şişeler (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Sarf
cam yünü	Supelco	1.04086	Sarf
Glycoworkbench	NA		Yazılım; https://glycoworkbench.software.informer.com/'dan indirilebilir
HLB SPE kartuşları	Supelco	57493-U	96 kuyuyla HLB ekstraksiyon plakasına alternatif olarak tüketilebilir bir ürün
iyodometan	Sigma-Aldrich	289566	Reaktif
MALDI hedef plakası	Bruker		Ekipman
ModulyoD dondurucu kurutucu	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Ekipman Referans metinde (varsa): dondurucu kurutucu
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reaktif
NaOH pelletleri	Sigma-Aldrich	567530	Reaktif
NaOH çözümü %50	Sigma-Aldrich	415413	Reaktif
Pozitif Basınç-96 İşlemci	Sular	186006961	Ekipman
süper DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reaktif
Trifluroasetik asit	Sigma-Aldrich	T6508	Reaktif