Yöntem makalesi

Tek Hücreli Analizler için İnsan Fallop Tüpü Epitelinin Çıkarılması İçin Etkili Bir Yöntem

DOI:

10.3791/67753

⸱

28 Mart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan fallop tüpü epitel hücrelerinin izolasyonu için bir günlük bir yöntemi tanımlar. İzole epitel hücreleri, 2 boyutlu (2D) kültürde kaplanabilir veya tek hücreli süspansiyonlara ayrılabilir ve akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi dahil olmak üzere aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan fallop tüpleri üremeye özgüdür. Fallop tüplerinin amacı, spermin, yumurtanın ve döllenme başarılı olursa embriyonun geçişine izin vermektir. Fallop tüplerinin iç yüzeyini kaplayan epitel hücreleri, hastalığın başlaması da dahil olmak üzere hem normal hem de anormal fallop tüpü süreçlerinin ayrılmaz bir parçasıdır. Menopozdan sonra, fallop tüpleri vücutta önemli bir rol oynamaktan çıkar ve intraepitelyal hücre yapısı değişir. Bu epitel hücrelerinin, minimal stromal hücre kontaminasyonu ile taze fallop tüplerinden tek hücreli bir süspansiyona izole edilebileceği bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu hücreler kültürde büyütülebilir veya akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi gibi daha ileri analizler için kullanılabilir. Bu izolasyon protokolü 4-6 saat içinde elde edilebilir ve hemen aşağı akış analizi için kullanılabilecek canlı hücreler verir. Bu etkili protokol, zenginleştirilmiş bir epitel popülasyonu ile fallop tüpü epitel hücrelerinin izolasyonunu kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fallop tüpleri birden fazla parçadan oluşur. Yumurtalıktan uterusa kadar, fallop tüpü fimbria, ampulla, isthmus ve intramural kısımdan oluşur. Fimbrialar, yumurtalık tarafından salınan yumurtayı yakaladıkları fallop tüpünün ucundan uzanır. Yumurta daha sonra döllenme olasılığının en yüksek olduğu ampulladan kıstağa geçer ve son olarak intramural kısım1 yoluyla uterusa aktarılır. Yumurta taşınmasını kolaylaştıran fallop tüpünün en iç mukozası, kirpikli ve salgı hücreleri içeren bir luminal epitel tabakasından oluşur. Kirpikli hücreler fimbriae2'de daha konsantre olma eğilimindedir. Yumurtayı fallop tüpünden yumurtalıktan uterusa fiziksel olarak hareket ettirmede ayrılmaz bir rol oynarlar. Uzantıları, kirpikli hücrelerin sadece yumurtayı hareket ettirmesine değil, aynı zamanda yumurtlamayı takiben genotoksik stresi temizlemesinede izin verir 3.

Salgı fallop tüpü epitel hücreleri, beslenmeye ve gamet montajına yardımcı olan bir sıvı salgılar4. Fallop tüpü epiteli boyunca kirpikli ve salgı hücrelerinin oranı, menopoz sonrası durumda, fallop tüpü artık taşımada kritik bir işleve hizmet etmediğinden, kirpikli hücrelerde bir azalma ile farklılık gösterir5. Ayrıca, östrojen yokluğunda, fallop tüplerinin körelmiş hale geldiği düşünülmektedir 1,6. Fallop tüpündeki siliyer hücrelerin bu kaybının, seröz karsinom gelişme riskini arttırdığı varsayılmaktadır7. Ek olarak, fallop tüpü salgı epitel hücrelerinin, tubo over kanserlerinin en agresif alt tipi olan yüksek dereceli seröz karsinomun iyi bilinen bir öncüsü olan seröz tubal intraepitelyal karsinom (STIC) lezyonlarına yol açtığı düşünülmektedir 7,8.

Bu protokolün amacı, epitel hücrelerini insan fallop tüplerinden izole etmek ve bunları tek hücreli süspansiyonlara ayırmaktır. Bu protokol, birçok analiz için kullanılabilecek zenginleştirilmiş tek hücreli bir epitel popülasyonu verir. Bu yazıda gösterildiği gibi, izolasyon sonrası 2 boyutlu olarak akım sitometri analizi ve plaka hücreleri yapıldı. Akış sitometrisi analizi, doğada çoğunlukla canlı ve epitelyal olan tek hücrelerin varlığını gösterir. Bu analizlerde, canlılık için e506, epitel hücreleri için EpCAM, immün hücreler için CD45 ve stromal hücreler için CD10 olmak üzere dört belirteç dahil ettik. Ölü hücreler e506 canlılık markörü kullanılarak dışlandı ve bağışıklık hücreleri CD45 kullanılarak dışarı çıkarıldı. Süspansiyonun bir bağışıklık hücresi popülasyonuna sahip olması mümkündür; bununla birlikte, nispeten saf bir epitel hücresi popülasyonu elde etmek için, CD45 pozitif hücreler bir CD45 tükenme kiti kullanılarak tükenebilir. Ayrıca, kültürde kaplandığında, CD45 pozitif hücreler genellikle çoğalmaz. Bu yöntemle izole edilen ve 2D olarak büyütülen hücreler, yapışık parke taşı benzeri epitel popülasyonları gösterir. Bu yöntem, tek hücreli RNA kütüphanelerine geliştirilebilen hücresel preparatlar oluşturmak için kullanılabilir.

Fallop tüpü epitelinin hücresel soyunu tanımlamaya yönelik araştırmalar, üreme yaşamının farklı evrelerinde bu soylarda meydana gelen değişiklikler ve malign transformasyon ve oluşumuna yol açan olayları kışkırtmak son dört yıl içinde daha belirgin hale gelmiştir 6,9,10,11,12 . Bu protokol, fallop tüpü epitellerini izole etmek ve bunları tek hücrelere dönüştürmek için etkili bir yol sağlayarak bu alandaki araştırmalara önemli ölçüde fayda sağlayacaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol daha önce tarif edilen bir uterus epitel hücre izolasyon yönteminden uyarlanmıştır13,14. Tanımlanmamış fallop tüplerinin taze örnekleri, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) IRB onaylı protokol #10-0727 aracılığıyla toplandı ve yaklaşık 4-6 saat içinde tek hücreli bir süspansiyona sindirildi.

1. Fallop tüpünün toplanması ve hazırlanması

  1. Taze insan fallop tüplerini (Şekil 1A) ayrışma ortamında (% 10 fetal sığır serumu (FBS), 5 mL L-glutamin ve 5 mL penisilin / streptomisin içeren DMEM [4.5 g / L D-glikoz]) 15 mL veya 50 mL tüplerde toplayın ve buz üzerinde laboratuvara taşıyın.
  2. Fallop tüplerini taze ayrışma ortamı içeren steril bir Petri kabına aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, ince uçlu forseps ve Vannas Tübingen makası kullanarak yağ, bağ dokusu ve tüpleri çevreleyen tüm damarları inceleyin (Şekil 1B).
  4. Diseksiyon mikroskobu altında, dokuyu stabilize etmek için ince nokta forsepslerini kullanarak, her biri ~ 3-5 mm çapında küçük silindirler oluşturmak için fallop tüplerinin koronal düzlemini makasla kesin (Şekil 1C).

2. Epitel hücre izolasyonu ve ayrışması

  1. Ayrışma ortamını tabaktan dikkatlice aspire edin.
  2. Doku parçalarını 2x soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile parçaları kaplamak için ~ 2 mL'yi hafifçe pipetleyerek ve plakayı hafifçe döndürerek yıkayın.
  3. Son 1x PBS yıkamasını aspire edin, doku parçalarını oda sıcaklığında soğuk 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde 5 dakika inkübe edin ve toplam iki inkübasyon için tekrarlayın. Her inkübasyondan sonra 5mM EDTA'yı aspire edin.
  4. Doku parçalarını soğuk% 1 Tripsin / Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde askıya alın ve 4 ° C'de 40 dakika inkübe edin (Şekil 1D).
  5. % 1 tripsin / HBSS'yi aspire edin ve tripsini etkisiz hale getirmek için doku parçalarını 2 kez soğuk ayrışma ortamında yıkayın.
  6. Doku parçalarını oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca 0.4 mg DNaz ile 2 mL ayrışma ortamında inkübe edin.
    NOT: Daha uzun bir inkübasyon süresi gerekli olabilir, ancak adım 2.7'ye başlamadan önce 45 dakikayı aşmayın.
  7. Diseksiyon mikroskobu altında, hala DNazlı ortamdayken, fallop tüpünün bir parçasını, lümeni tabağın dibine paralel olarak forseps ile yerinde tutun. Öte yandan, epitel hücrelerini tüpün lümeninden çıkarmak için fallop tüpü parçasına forseps ile tekrar tekrar bastırın. Hücreler tüpün lümeninden salınırken doku çevresinde bir hücre halesinin görüldüğünü onaylayın. Çanaktaki her fallop tüpü parçası için tekrarlayın (Şekil 1E).
  8. Hücreleri içeren ortamı 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın, Petri kabını ayrışma ortamıyla en az 2 kez yıkayın ve yıkamaları 15 mL'lik tüpte birleştirin. Stromal tüp parçalarını atın.
  9. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL ayrışma ortamında yeniden süspanse edin.
  10. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alikode ederek ve 1: 1'i tripan mavisi ile karıştırarak hücreleri sayın. Karışımın 10 μL'sini bir hazne sayma sürgününe pipetleyin ve bir hücre sayacına yerleştirin (Şekil 1F).

3. Tek hücreli süspansiyona sindirim

  1. Hücreleri 9 mL ayrışma ortamı, 1 mL 8 mg / mL kollajenaz (tip 1) ve 0.4 mg DNaz içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 30-45 dakika boyunca 200 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin (Şekil 1G).
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı aspire edin ve kollajenazı yıkamak için peleti 5 mL ayrışma ortamında yeniden süspanse edin.
  3. Hücre süspansiyonunu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe geçirin (Şekil 1H).
  4. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  5. Hücre peleti kırmızı görünüyorsa, 3.6-3.8 adımlarında açıklandığı gibi kırmızı kan hücresi (RBC) lizizini gerçekleştirin. Hücre peleti kırmızı değilse, adım 3.9'a geçin.
  6. 500 μL RBC lizis tamponunu 4.5 mL ultra saf su ile seyreltin.
  7. Ortamı aspire edin, 5 mL seyreltilmiş RBC lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
  8. RBC lizizini durdurmak için, 50 mL'lik tüpe 45 mL 1x PBS ekleyin.
  9. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  10. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alikote ederek ve 1: 1 oranında tripan mavisi ile karıştırarak hücreleri sayın. Karışımın 10 μL'sini bir hazne sayma slaytına pipetleyin ve hücre sayacına yerleştirin (Şekil 1I).

4. Akış sitometrisi boyama

  1. Primer konjuge antikor ve yüzey işaretleyici akış sitometrisi için izotip kontrolü için 250.000 hücreyi iki ayrı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpe ayırın.
    NOT: Aşağı akış analizi için gereken hücre sayısını ve hücre sayısını karşılamak için daha az hücre kullanılabilir. Optimum akış sonuçları elde etmek için analize en az 50.000 hücre dahil edilmelidir.
  2. Antikoru (örneğin, anti-insan EpCAM ve CD10) ve izotipi, üreticinin 1x PBS'de önerilen seyreltmesine göre seyreltin. Canlı insan bağışıklık hücrelerini dışarı atmak için sabitlenebilir canlılık boyası (e506) ve konjuge bir anti-insan CD45 antikoru içerir. Tüp başına en az 50 μL için yeterli antikor karışımı yapın. Adım 4.4'e kadar karanlıkta buz üzerinde bırakın.
  3. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  4. 1x PBS'yi aspire edin. Peleti antikor veya izotip panelinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  5. İnkübasyondan sonra, 1 mL 1x PBS ile seyreltin ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  6. 1x PBS'yi aspire edin ve hücre peletini 200 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.

5. Akış sitometrisi veri toplama

  1. FACS makinesinde oturum açın.
    NOT: Referans alınan akış sitometresini kullanan protokolü sunuyoruz (Malzeme Tablosuna bakınız). Diğer akış sitometreleri için üreticinin talimatlarına uyun. Akış sitometresinin voltaj ayarı, insan PBMC'leri ile optimum performans için önceden yapılandırılmıştır ve her FACS çalışmasından önce voltaj ayarlamaları ihtiyacını ortadan kaldırır.
  2. Makine alım modundaysa, adım 5.3'e geçin. Makine veri analizi modundaysa, sağ üstteki güç düğmesine basarak alım moduna geçin. Bir açılır pencere görüntülendiğinde, edinme modunu okuyan düğmeye basın.
  3. Sol altta, makinede Kalibrasyon Gerekli yazıyorsa adım 5.3.1'e geçin. Makine Kalibrasyon tamam mesajını okursa, adım 5.4'e geçin.
    1. Makineyi kalibre etmek için kalibrasyon boncuklarını 4 °C'lik buzdolabından ve girdaptan çıkarın.
    2. 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe 1 damla kalibrasyon boncuğu yerleştirin ve tüpü tek tüp tutucusuna yerleştirin.
    3. Sağ üstteki barkod düğmesine basın ve kalibrasyon boncuğu şişesini tarayın. Bir açılır pencere görünecektir. Her şey ayarlandıysa, Evet | Tamam ve kalibrasyonun çalışmasına izin verin.
    4. Kalibrasyon başarılı olursa, oturumu kapatın ve alım moduna geri dönün. Adım 5.4'e ilerleyin.
  4. Sol üstteki aç | yeni çalışma alanına tıklayın.
  5. Soğuk 5 rafı seçin; Kuyulardan üçünü seçin. İlk kuyuyu seçin ve ona bir açıklama yapın (örneğin, FTX Ab). Bir sonraki kuyuyu seçin ve ona benzersiz bir açıklama verin (örneğin, FTX Iso). Son kuyuyu seçin ve ona çamaşır suyu tanımını verin.
    NOT: Hücre numunelerinin zamanında temizlenmesini sağlamak için her zaman her 4-5 deney numunesinden sonra bir ağartıcı numunesi ekleyin.
  6. Tüm kuyuları seçin ve deney koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: cihaz ayarları: İnsan PBMC'leri; Akış hızı: yüksek; Karışım örneği: nazik karıştırma; Mod: standart; Numune toplam hacmi 200 μL; Numune alımı 150 μL; Ek açıklama: giriş antikorları ve florofor etiketlemesi.
  7. Düzenle | seçenekler'i seçin ve dosyaya açıklama| uygula | tamam altında bir ad verin.
  8. Rafı buzdolabından çıkarın ve barkod makineye bakacak şekilde tepsiye yerleştirin. Numune tüplerini, numunelerin sırasını ekrana yansıtacak şekilde rafa yerleştirin ve deneyi başlatmak için oynat düğmesine basın.
  9. Deneme bittiğinde USB'yi takın, Dosya | kopyala'yı seçin, özel klasörü genişletin, denemeyi seçin ve kopyala ve çıkar'a tıklayın.
  10. Veri topladıktan sonra, veri sayfasını analiz etmek için yazılım kullanın.
  11. İzotip kontrolüyle başlayın. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafiğindeki hücreleri seçmek için çokgen aracını kullanın.
  12. Y eksenini e506 ve X eksenini FSC olarak değiştirerek ölü hücreleri dışarı çıkarın. e506 negatif canlı hücre popülasyonunu seçmek için çokgen aracını kullanın.
  13. Seçilen popülasyona çift tıklayın. Y eksenini insan CD45 olarak değiştirin. Hücre popülasyonunu seçmek için çokgen aracını kullanın. Bu, insan CD45 negatif hücre popülasyonudur.
  14. CD45 negatif hücre popülasyonuna çift tıklayın. Y eksenini histograma ve X eksenini insan EpCAM'ına değiştirin. Histogramın sonuna tıklamak için aralık seçim aracını kullanın ve grafiğin sonuna kadar olan boş alanı seçin. Bu, EpCAM pozitif popülasyonu temsil eder. İnsan CD10 lekesi için tekrarlayın.
  15. İzotip geçitini antikor çalışma alanının altına sürükleyin. CD45 pozitif hücreler dışarı atılacak ve EpCAM pozitif ve CD10 pozitif popülasyonlar seçilecektir.
  16. Temsili histogramlar oluşturmak için Düzen Düzenleyicisi'ni seçin. İstediğiniz histogramları mizanpaj sayfasına sürükleyin. İzotip ve antikor boyamayı karşılaştırmak için, izotip histogramını antikor histogramı ile kaplayın. İzotip kontrolüne dayalı olarak pozitif hücreleri kapılayın.

6. İmmünositokimya

  1. Kültür hücreleri, son izolasyon adımından sonra istenen haznede cam kayar, birleşene kadar.
  2. Hücreleri sabitlemek için 500 μL soğuk %4 Paraformaldehit (PFA) ekleyin Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  3. %4 PFA'yı aspire edin ve 3x'i 1x PBS ile yıkayın.
  4. Hücrelere nüfuz etmek için, PBS'ye en az 200 μL% 0.25 Triton-X ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  5. Geçirgenlik sırasında, bloke edici tamponu hazırlayın (keçide üretilmeyen antikorlar için% 4 normal keçi serumu [NGS]).
  6. %0,25 Triton-X'i aspire edin ve 3x'i 1x PBS ile yıkayın.
  7. En az 200 μL engelleme tamponu ekleyin (PBS'de %4 NGS). Oda sıcaklığında 1 saat bloke edin.
  8. Üreticinin tavsiyelerine göre 1x PBS'de %1 NGS'de birincil antikor dilüsyonlarını hazırlayın.
  9. Bloklamadan sonra, en az 200 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    NOT: Bazı primer antikorlar gece boyunca 4 °C'lik bir inkübasyonu tercih edebilir; Antikor veri sayfasını kontrol edin.
  10. 1x PBS'de% 1 NGS'de ikincil antikor çözeltileri hazırlayın. Tüpleri kalay folyoya sarın ve ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu için karanlıkta çözeltiler hazırlayın. Hazır olana kadar karanlıkta saklayın.
  11. Primer antikor inkübasyonundan sonra, 3x'i 1x PBS ile yıkayın.
  12. İkincil antikor çözeltisinden en az 200 μL ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    NOT: Aşağıdaki adımlar sırasında, slaytı mümkün olduğunca karanlıkta tutmaya çalışın.
  13. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, 3x'i 1x PBS ile yıkayın.
  14. Hazneleri ya elle çıkararak ya da kızaklarla birlikte gelen aleti kullanarak çıkarın. Çıkarmak için hazne sürgü ambalajında yazılı olan talimatları izleyin.
  15. Bir damla 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) montaj serumu ekleyin ve üstüne bir lamel yerleştirin. Baloncuk sayısını sınırlayın ve tüm hücrelerin kaplandığından emin olun. İsteğe bağlı adım: lameli kapatmak için kenarlarda oje kullanın.
  16. Slaytı kuruması için bir slayt kutusuna düz bir şekilde yerleştirin ve görüntüleme yapılana kadar 4 °C'de yerleştirin.
  17. Temiz görüntü sağlamak için ikincil antikor konjugasyonuna dayalı doğru floresan ile donatılmış bir mikroskopta görüntü.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zenginleştirilmiş bir epitel hücre popülasyonunu izole ettiğimiz yedi fallop tüpü koleksiyonunu dahil ettik (Şekil 2A ve Ek Şekil S1A). Bu tek hücreli süspansiyon yönteminin canlılığını ve epitel hücre zenginleştirmesini değerlendirmek için akış sitometrisi yapıldı. Hücre canlılığını ölçmek için, hücreler canlılık belirteci e506 ile boyandı. Bu aynı zamanda analiz edildiğinde tüm kalıntıların ve ölü hücrelerin dışarı çıkarılmasına da izin verdi.

Bu yöntemle izole edilen hücrelerin bileşimini belirlemek için, numuneler bir epitel hücre markörü (EpCAM), bir stromal hücre markörü (CD10) ve bir bağışıklık hücresi markörü (CD45) ile boyandı. Şekil 2B'de

figure-results-1

figure-results-2

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fallop tüpleri üremede önemli bir rol oynadığından ve çoğu HGSOC için menşe bölgesi olduğundan, fallop tüpü epitelini incelemeye önemli miktarda ilgi vardır. Bu amaçla, birçok araştırmacı hem insan hem de fare modellerinde fallop tüp hücrelerini izole etmek için protokoller tanımlamıştır 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. Fallop tüpü epitel hücrelerini çıkarmak ve zenginleştirmek için tanımladığımız yöntem, mevcut fallop tüpü hücre izolasyon protokollerine eklenir. Bu protokoller içinde örtüşmeler olmasına rağmen, farelerde ve insanlarda bildirilen iki genel yöntem türü vardır. Birincisi, toplam hücre süspansiyonu10,12,15,16,17 veren tüm fallop tüpünün kıyılmasını ve enzimatik olarak sindirilmesini içerir. İkincisi, 11,18,19,20,21 doku tabakaları ile sonuçlanan çalkalama veya kazıma ile dökülmeyi içerir. Her iki yöntem de epitel hücrelerinin akış sitometrisi, dizileme ve in vitro kültür gibi aşağı akış deneyleri yoluyla analiz edilmesine izin verir. Yöntemimizin önemli bir avantajı, protokolün, enzimatik sindirim ve mekanik itme adımları yoluyla epitel hücreleri için zaten zenginleştirilmiş bir fallop tüpü hücresi popülasyonu vermesidir. Epitel için zenginleştirilmiş bu popülasyon daha fazla sindirilebilir ve bu da akış sitometrisi, 2D kültür, immünositokimya ve tek hücreli RNA dizilimi gibi birçok uygulama için kullanılabilen tek hücreli bir süspansiyon ile sonuçlanır.

Hücre verimini etkilediğini bulduğumuz temel adımlar, fallop tüpü fragmanlarının% 1 tripsin / HBSS ve DMEM / DNaz'da inkübe edilme süresini içerir. Her iki çözeltide de aşırı inkübasyon, hücreleri bozacak ve hücrelerin canlılığını önemli ölçüde azaltacaktır. Bununla birlikte, yetersiz inkübasyon süresi, araştırmacının protokol adımı 2.6 sırasında birçok epitel hücresini dışarı itme yeteneğini engelleyecektir, çünkü bunlar birbirine yapışmaya devam edecektir. Hem düşük hem de daha yüksek konsantrasyonlarda tripsin çözeltileri canlı fallop tüpü epitel hücrelerinin verimini azalttığından,% 1'lik bir tripsin çözeltisi kullanmak da önemlidir. Kimyasal ve mekanik izolasyonu ve bir sindirim adımını (protokol adımı 3.1) birleştirerek, dokudan tek hücreli süspansiyona geçmek için gereken süreyi katlanarak kısaltabiliriz. Bu, aynı gün aşağı akış analizi yapmak için iyi bir uygulanabilirlik ve zaman sağlar.

Protokol adımı 1.4'te, fallop tüpünün kesilen parçalarının 3-5 mm kalınlığında olduğundan emin olmak çok önemlidir. Parçalar çok büyükse, protokol adımı 2.7'yi gerçekleştirmek zor olacak ve sonuçta DMEM / DNaz'da daha uzun bir inkübasyon süresi gerekli olacağından hücre verimini azaltacaktır.

Hücre süspansiyonu epitel hücreleri için zenginleştirilmiş olsa da stromal hücre kontaminasyonu kaçınılmazdır. Preparatın tamamen epitel hücreleri olması gerekiyorsa, epitel hücrelerini izole etmek ve stromal hücreleri tüketmek için akış sitometrisi ve tarif ettiğimiz belirteçler kullanılarak sıralama yapılabilir.

Bu çalışmada postmenopozal fallop tüpleri kullanıldı. Bununla birlikte, bu yöntem laboratuvarımızda premenopozal fallop tüpleri üzerinde başarıyla kullanılmıştır. Menopoz öncesi ve sonrası fallop tüpleri arasındaki temel fark, siliyer ve salgı epitel hücrelerininbileşimidir 1. Bu protokol tüm üreme aşamaları için geçerlidir.

Bu etkili protokol, hücresel soyların tanımlanması, üreme döngüleri sırasında ve menopozdan sonra dinamik değişiklikleri ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin başlatılmasındaki rolleri de dahil olmak üzere fallop tüpü epitelinin hücre tiplerinin araştırılmasını kolaylaştıracaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Ruegg L, James-Allan LB ve DiBernardo G, Greater Los Angeles Veterans Association projeleri 1I01BX006019-01A2 ve Memarzadeh S.'ye I01BX006411-01 tarafından kısmen desteklenmektedir. UCLA'daki Translasyonel Patoloji Çekirdek Laboratuvarı'na ve özellikle doku tedarikindeki yardımları için Ko Kiehle ve Chloe Yin'e teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Ken Yamauchi'ye ve BSCRC Mikroskopi çekirdeğine görüntülemedeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz. Şekil 1 , BioRender.com (anlaşma numarası JL27QWDYNT) ile oluşturulmuştur. Son olarak, akış sitometrisindeki yardımları için Felicia Cordea'ya ve BSCRC akış sitometrisi çekirdeğine teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 1 Tripsin Termo Bilimsel J63993.09
100 ve mikro; m Hücre SüzgeciCorning431752 %
4 ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710-S
5 mL yuvarlak tabanlı tüplerCorning352008
60 mm hücre kültürü plakasıCorning CLS430589-500EA
6 kuyulu Hücre Kültürü PlakasıCorning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD45 ve nbsp;BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
Odacıklı Kızak SistemiThermo Scientific 154917PK
Kollajenaz Termo Bilimsel 
DMEMTermo Bilimsel 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
İnce nokta forseps VWR102091-526Seçtiğiniz herhangi bir ince nokta forseps çalışacaktır
Düzeltilebilir Canlılık Boyası eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo yazılım sürümü 9 BD BiosciencesVeri analiz yazılımı
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
MACSQuant Analiz Cihazı 10 akış sitometresi Miltenyi Biotec
MACSQuant Kalibrasyon BoncuklarıMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Kök Hücre Teknolojileri5620
Normal Keçi SerumuFisher ScientificPI31873
PBS Termo Bilimsel 14190-144
Penisilin-Streptomyosin Gibco15140-122
PerCP Konjuge CD45BioLegend304026
Kırmızı Kan Hücresi lizis tamponu Tonbo Biyolojik BilimlerTNB-4300-L100 &
Triton X-100Termo Bilimsel BP151-100
Vannas-Tübingen Yaylı Makas Güzel Bilim Araçları15003-08
Fisher Scientific NC9524612ile VECTASHIELD
Anti-CD326 (Ep-CAM) BioLegend 324218 17100017DAPI

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).
  2. Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).
  3. Coan, M., et al. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).
  4. Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).
  5. Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).
  6. Lengyel, E., et al. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).
  7. Tao, T., et al. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).
  8. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).
  9. Hu, Z., et al. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).
  10. Dinh, H. Q., et al. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).
  11. Ulrich, N., et al. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).
  12. Brand, J., et al. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).
  13. Memarzadeh, S., et al. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).
  14. Cunha, G. R. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).
  15. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).
  16. Karst, A. M., Drapkin, R. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).
  17. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).
  18. Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).
  19. Feng, L., et al. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).
  20. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).
  21. Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Epitel H cre zolasyonuTek H cre S spansiyonuTek H cre RNA DizilemeAk SitometrisiMekanik SindirimEnzimatik SindirimEpCAM Pozitif H crelerStromal H cre KontaminasyonuOver Kanseri

İlgili makaleler