Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Döllenme Sırasında Spermden Oosit'e Aktarılan Baba Metabolitlerinin Kütle Spektrometresi Tanımlaması için Kararlı İzotop In-Vivo Etiketleme

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

17 Haziran 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

Bu makalede

Özet

Bu prosedür, 2H2O veya U13C Glukoz ile stabil izotop etiketleme ve ardından metabolomik analiz kullanılarak döllenme sırasında spermden oositlere aktarılan metabolitleri tanımlamayı amaçlar. Döteryum etiketli sirler, etiketlenmemiş barajlarla eşleştirilir. Toplanan implantasyon öncesi embriyolar, maternal (döteratlanmamış) metabolitlerden paternal (döteratlanmış) metabolitleri ayırmak için kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Özet

Embriyo genetiğine baba katkısı şimdiye kadar onlarca yıldır alelik dizilerle sınırlı kalmıştır. On yıllık sonuçlar, bunun yerine, epigenetik faktörlerin - DNA metilasyonu, histon modifikasyonları, kromozomal organizasyon ve düzenleyici RNA'lar - baba kalıtımında çok önemli roller oynadığını ve embriyonik gelişimi ve zigot gen ekspresyonunu etkilediğini göstermektedir. Nükleik asitlerle birlikte sperm metabolomu (lipitler, karbonhidratlar, serbest amino asitler) epigenetik sinyal olarak işlev görebilir. Bu protokol spermden oosit transferli metabolitleri kütle spektrometresi ile tanımlamayı amaçlar. Prosedür, döllenme sırasında oosit üzerine aktarılan baba metabolitlerini metabolomikler yoluyla izlemek için sperm hücrelerinin 2H2O veya U13C Glikoz ile stabil izotop etiketlemesini içerir. Protokolün genel amacı, yavruların dismetabolizmaya yatkınlığında baba sperm metabolomunun rolünü ortaya çıkarmaktır ve diyet ve kirleticilere maruz kalma gibi çevresel koşulların, yavruların sağlığını ve diyabet, obezite ve kardiyovasküler hastalıklara yatkınlığını potansiyel olarak etkileyen baba metabolik mesajlarını nasıl değiştirdiğine dair içgörüler sağlamak için uyarlanabilir.

Giriş

Baba epigenomu, yavruların dismetabolizmaya duyarlılığını etkiler
Embriyo gelişimi sırasında anneler tarafından sömürülen gebelik öncesi ve sonrası rollerin bolluğundan farklı olarak, sperm hücrelerinin katkısının onlarca yıldır yalnızca genetik olduğu düşünülmektedir. Genetik kalıtım teorisine göre, bir bireyin fenotipik değişkenliğine (hastalığa yatkınlığı dahil) baba katkısı, yalnızca baba tarafından kalıtılan alelik varyantların genetik dizisine ve bunların anne tarafından kalıtsal olanlarla etkileşimlerine atfedilmek zorundaydı1. Günümüzde, döllenme sırasında baba tarafından yavrularına iletilen tek genetik mesajın aleller olmadığı ve bunun yerine çok sayıda epigenetik sinyalin baba kalıtımına katkıda bulunduğu açıktır 2,3,4. Şimdiye kadar tanımlanan epigenetik sinyaller şunları içerir: (1) ebeveyn genomunun sitozinlerine kovalent olarak eklenen metil grupları 5,6,7, (2) sperm kromozomları ile ilişkili histonların translasyon sonrası modifikasyonları (asetilasyon, metilasyon) ve oositlereiletilir 8, (3) zigotta devam eden kromozomal etkileşim içi etkileşime (topolojik olarak ilişkilendirme alanları, TAD olarak da bilinir) yol açan baba kromozomlarının 3 boyutlu organizasyonu9,10 ve (4) düzenleyici RNA molekülleri (miRNA'lar, tRNA'dan türetilmiş fragmanlar ve piwi ile etkileşime giren RNA'lar)11,12 ve ayrıca döllenme sırasında spermden oosite salınan rRNA'lar13 ve tRNA'lar14.

Baba epigenomu, döl için önemli bir bilgi aracıdır. Baba bilgisi, zigotu, gelişimi sırasında embriyoyu ve doğumdan sonra yavruların metabolizma bozukluğu ve hastalıklara eğilimini etkileyecektir. Bu Mendel dışı kalıtım (bir veya birden fazla ardışık nesli etkilemesine bağlı olarak nesiller arası veya nesiller arası olarak adlandırılır), birçok yazar tarafından gelişmiş Batı ülkelerinde meydana gelen dismetabolik hastalıklardaki ciddi artıştan sorumlu gizli katkıda bulunan faktörlerden biri olarak kabul edilir15. Nitekim, PoHaD (Sağlık ve Hastalığın Baba Kökeni) ve DoHaD (Sağlık ve Hastalığın Gelişimsel Kökeni) teorilerine göre, ebeveyn epigenetik katkısı, yavruların yetişkinliklerinde diyabet, obezite ve kardiyovasküler hastalıklar geliştirmeye yatkın faktörlerden biridir16,17. İlginç bir şekilde, ebeveyn epigenomu çevresel uyaranlara karşı son derece hassastır ve metabolik koşullardan (ilaç kullanımı, beslenme alışkanlıkları ve metabolik uygunluk gibi)18 ve kesinlikle çevresel parametrelerden (kirleticilere maruz kalma, sosyal ilişkiler ve zihinsel ve ilişkisel stres gibi) etkilenebilir5,11. Yukarıda belirtilen uyaranların her biri, germinal hücrelerin (sperm ve oositler) epigenomlarını değiştirebilir ve gelecek nesilleri etkileyebilir.

Yüksek yağlı diyet (HFD) tüketimi, baba epigenomunu değiştirebilen ve yavrulara iletilen zararlı mesajlara yol açabilen en kapsamlı çalışılan çevresel uyaranlardan birini temsil eder19. Bu uyaran, kalori alımlarından bağımsız olarak, genellikle dismetabolizma geliştirme eğilimi gösteren yavru fenotipini (üçüncü nesle kadar) etkiler. HFD tüketen babadan gelen yavrular, hem farelerde hem de sıçanlarda büyüme geriliği, glukoz intoleransı ve insülin direnci gösterir20,21. İnsanlarda, epigenetik kalıtım öncelikle kıtlık veya aşırı beslenme dönemleri sırasında ve hemen sonrasında doğan nesillerde incelenmiştir22. Överkalix kohortunda, baba tarafından büyükanne ve büyükbabaların yavaş büyüme dönemlerinde yiyecek bulunabilirliği, torunlarının genel mortalite riski, kardiyovasküler hastalıklar, BMI, bel çevresi ve yağ kütlesi ile ilişkiliydi23. Son zamanlarda, baba nesiller arası aktarımın kanıtları diğer kohortlarda da doğrulanmıştır24.

Nesiller arası kalıtımda yer alan baba metabolitleri
Klinik ve epidemiyolojik kanıtlara rağmen, baba nesiller arası kalıtımın moleküler detayları belirsizliğini korumaktadır. İlk başta, epigenetik bilginin tüm moleküler dönüştürücülerinin tanımlanması hala tamamlanmalıdır. Bilimsel kanıtlar, spermatozoanın nükleik bileşeninin kendi başına nesiller arası kalıtımın karmaşıklığını açıklayamadığını göstermektedir. DNA metilasyonundaki varyasyonlar gerçekten de HFD ile beslenen farelerin ve sıçanların spermatozoasında ölçülmüştür, ancak sperm popülasyonunun o kadar düşük bir yüzdesinde ki, bu, yavrularda gözlenen dismetabolik fenotipin yüksek penetransını açıklayamaz25. Öte yandan, spermden oositlere aktarılan sinyal RNA'ları havuzu çok kısa bir yarı ömre sahiptir ve zigotik gen ekspresyonunu etkileyebilmesine rağmen, döllenme sonrası etkili konsantrasyonlarda tutulması olası görünmemektedir, 2. gün, 3. gün embriyolarında zigotta, morulalarda ve blastosistlerde. Bu nedenle, nesiller arası kalıtım mekanizmasına yeni moleküler belirleyicilerin dahil olması gerektiği açık görünmektedir.

Nükleik asitlerle birlikte sperm, zigota lipitler, karbonhidratlar ve amino asitler gibi metabolomik bileşenlere de katkıda bulunur 26,27,28,29. Bu metabolitler, özellikle modülatör aktivitelere sahip olanlar, zigotik gen ekspresyonunu ve embriyonik gelişimi etkileyebilir ve böylece epigenetik sinyaller olarak işlev görebilir30. Ayrıca, nükleik asitlere benzer şekilde, spermdeki bu metabolitlerin konsantrasyonu ve nispi bolluğu, babanın yaşadığı çevresel koşullardan etkilenebilir ve bu nedenle yavrular için bilgi araçlarını temsil edebilir 28,30,31,32,33,34. Gerçekten de, olgun spermatozoanın sperm metabolomunun babanın sağlık durumuna bağlı olduğu ve diyet, fiziksel egzersiz, toksik maddeler ve endokrin bozucular gibi çevresel faktörlerden etkilendiği gösterilmiştir.

Embriyonik gelişimde sperm metabolitlerinin rolünü anlamak, birkaç teknik sınırlama nedeniyle karmaşıktır: (1) sperm ve oosit arasındaki boyut farkı, bu da spermin zigot için minimal metabolik kütle katkısı ile sonuçlanır ve (2) spermin üretim aşamaları (spermatogenez), epididimal olgunlaşma sırasında geçirdiği çeşitli metabolomik varyasyonlar, boşalma ve oosit ile füzyon.

Sperm olgunlaşması sırasında sperm metabolomunun dalgalanması
Memelilerde spermatozoa, testiste, taahhüt edilen spermatogonia'nın mayoz bölünmeye giren ve yuvarlak haploid spermatidler üreten birincil spermatositlere dönüştüğü spermatogonial kök hücreye bağlı bir süreç olan spermatogenez yoluyla üretilir. Bu hücrelerin spermatozoaya morfogenezi, spermatogenezin son aşamasına karşılık gelen, yuvarlak hücrelerden uzun/yoğunlaştırılmış/yüksek derecede özelleşmiş hücrelere spermatidlerin büyük bir morfo-fonksiyonel yeniden şekillenmesi olan spermiyogenez yoluyla gerçekleşir. Bununla birlikte, ortaya çıkan spermatozoa hareketsizdir ve henüz döllenme yeteneğine sahip değildir35. Spermasyondan sonra, spermatozoalar rete testisten epididim içine salınırken, sperm hücreleri epitelyal epididimal hücrelerle etkileşime girer ve bu hücreler tarafından salgılanan proteinler ve ekzozomal veziküllerle (epididimozomlar, sfingomyelin ve araşidonik asit açısından zengin) etkileşime girer. Epididimden geçiş, spermin tam olgunluğa ulaşmasını sağlar ve önceden kapasitif bir durumda tutulsa bile, motilite için yeterlilik kazanırlar36. Epididimal geçiş sırasında, sperm zarı daha negatif yüklü hale gelir ve sfingomyelin açısından zenginleşir. Sperm zarı, kolesterolde ilerleyici bir azalma ve çoklu doymamış yağ asitlerinde (esas olarak araşidonik, dokosapentaenoik ve dokosaheksaenoik asitler) eşlik eden bir artış nedeniyle daha sıvı hale gelir. Boşalma sonrası, kadın genital sisteminde, seminal sıvı proteinleri ve albümin, sperm motilitesini aktive etmek için hiperpolarizasyonu ve kalsiyum akışını teşvik ederek sperm kapasitesini arttırır. Kapasitasyonlu spermlerin plazma zarı daha fazla akışkanlık, düşük kolesterol-fosfolipid oranı ve azalmış sialik asit, GM1 gangliosit ve trigliserit içeriği sunar31,37.

Oosit ile karşılaşmadan önce, sperm akrozom reaksiyonuna uğrar, akrozomun (sperm çekirdeğinin ön kısmını kaplayan ve spermiogensis sırasında oluşan Golgi türevi zarlı bir organel) sperm plazma zarı ile füzyonuna uğrar, bu da sperm plazma zarının yeniden düzenlenmesini ve oositi çevreleyen bir glikoprotein matrisi olan zona pellucida'ya (ZP) nüfuz etme yeteneğini kolaylaştırır35, 38. Son adım olarak, sperm proteinleri IZUMO1, SPACA6 ve TMEM9539 tarafından desteklenen sperm ve oosit zarı arasındaki hemifüzyon, sperm lipitlerinin oosit zarlarına dahil edilmesi ve nükleik ve metabolik içeriğin oosit içine aktarılması ile sonuçlanır.

Prosedürün gerekçesi
Bu işlemin amacı, sperm tarafından taşınan ve döllenme sırasında oosit içine aktarılan metabolitleri tanımlamaktır (Şekil 1). Zigottaki sperm ve oosit türevli metabolitleri ayırt etmek için, spermler Döteryum (2H, bir hidrojen izotopu) veya 13C (bir karbon izotopu) ile etiketlenir in vivo Döteryum Oksit, 2H2O40 ile metabolik etiketleme veya düzgün bir şekilde U13C Glikoz41. İzotop etiketli erkek fareler daha sonra sonuçta zigotlar, morulalar ve blastosistler toplamak için etiketlenmemiş dişilerle çiftleştirilir. Erken evre embriyolar (1) polar, (2) polar olmayan metabolitler ve (3) steroller çıkarmak için işlenir. Metabolomlar daha sonra kütle spektrometresi teknikleri kullanılarak analiz edilir. İzotopik olarak etiketlenmiş (baba) metabolitler, etiketsiz (anne) olanlardan tanımlanacak ve ayırt edilecek ve baba kökenlerini kesin olarak gösterecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, İtalya'daki Napoli Federico II Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. C57BL / 6J erkeklerin seçimi ve gruplandırılması

  1. Yaklaşık 12 haftalık C57BL / 6J erkekleri seçin.
  2. Erkekleri iki gruba ayırın ve onları ETİKETLİ (kararlı izotop etiketlemesine tabi tutulan) veya ETİKETLENMEMİŞ (kontrol olarak ve sperm hücrelerinde ve morulalarda izotop etiketlemesinin etkinliğini ölçmek için kullanılır) olarak adlandırın.
  3. Epididimi etiketlenmemiş sperm hücrelerinden boşaltmak için, erkeklerin eşleştirilmiş dişilerle çiftleşmesine izin verin.

2. C57BL / 6J erkeklerin kararlı izotopik etiketlemesi

  1. In-vivo etiketleme için 2H2O kullanılıyorsa, 100 mL 2H2O ile 900 mL musluk suyunu karıştırarak içme suyu olarak kullanılacak %10 v/v 2H2O ile zenginleştirilmiş su hazırlayın. In-vivo etiketleme için U13C-Glikoz kullanılıyorsa, 50-150 g U13C-Glikozu 1 L musluk suyunda çözerek içme suyu olarak kullanılacak %5-15 U13C-Glikoz suyu hazırlayın;
    DİKKAT: Uzun süreli 2H2O tüketimi fareler için toksiktir. Her bir özel fare türü için, maksimum etiketleme verimliliği ve minimum yan etki elde etmek için içme suyuna eklenecek maksimum 2H2O miktarını ayarlayın. Uzun süreli Glikoz tüketimi farelerde hiperglisemi ve diyabete neden olur. Maksimum etiketleme verimliliği ve minimum yan etki elde etmek için içme suyuna eklemek için maksimum U13C-Glikoz miktarını ayarlayın.
  2. Su şişelerini izotop etiketli içme suyu içerenlerle değiştirin ve farelerin 2.5-5 hafta boyunca (spermatogenezin en az yarısını kapsayan) içmesine izin verin ve sıvıyı haftada iki kez yenileyin.
  3. Tedavi süresinin sonunda, etiketli erkeklerin süper yumurtlanmış dişilerle çiftleşmesine izin verin.

3. C57BL / 6J dişilerinin süper yumurtlaması

  1. Prepubertal yaşta, ağırlığı 12.5-14 g arasında olan yaklaşık 4 haftalık kadınları seçin.
  2. 5 IU / 50 μL / fare PMSG (Hamile kısrak serumu) intraperitoneal enjeksiyonu ile folikül olgunlaşmasını indükleyin.
  3. 47 saat sonra, folikülün olgunlaşmasının tamamlanmasını teşvik etmek ve yumurtlamayı ve korpus luteum oluşumunu indüklemek için intraperitoneal olarak luteinize edici hormon HCG (İnsan koryonik gonadotropini, 5 IU / 50 μL / fare) enjekte edin.
  4. HCG enjeksiyonundan sonra, Şekil 1'in 1. adımına göre dişilerin ETİKETLİ ve ETİKETSİZ farelerle çiftleşmesine izin verin.
  5. Çiftleşmeden sonra vajinal tıkaç kontrolünü42 gerçekleştirin. Pozitif dişileri ayırın ve onları kafesleyin.

4. Yıkama ile implantasyon öncesi embriyo toplama

  1. Vajinal tıkaç pozitif kadınları kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek feda edin (morulae toplamak için Coitum'dan 2.5 Gün sonra).
  2. Hayvanları sırt yaslanacak şekilde masanın üzerine yerleştirin; Karnı% 70 etanol ile ıslatın ve geniş bir laparotomi yapın.
  3. Rahim ağzını sıkıştırarak ve rahim ağzının kaudal ucunu keserek uterusu bir taraftan çıkarın; diğer tarafta, rahim boynuzunun ucundan kesilerek (infundibular kısım).
  4. Uterusları durulamak için PBS ile Petri kabına yerleştirin ve ardından kalıntıların varlığını önlemek için başka bir temiz Petri kabına aktarın.
  5. Uteriyi yıkamak için, kültür ortamı ile 2.5 mL'lik bir şırınga yükleyin ve 33 G künt uçlu bir Hamilton iğnesine takın.
  6. İğneyi yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan yumurta kanalının infundibulumuna yerleştirin ve tüm uterusu yıkayın.
  7. Morulaları, kalıntı mukoza ve kandan yıkamak için bir damla kültür ortamında toplayın.
  8. Toplanan numuneleri yeni toplama tüplerine aktarın ve ETİKETLİ veya ETİKETLENMEMİŞ sireleri içeren çiftleşme olaylarından türetilip türetilmediğine bağlı olarak ETİKETLİ MORULAE ve ETİKETSİZ MORULAE olarak gruplandırın. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun.
  9. Döllenmemiş oositleri toplamak için bir grup çiftleşmemiş süper yumurtlanmış dişiyi (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) kurban edin. Toplanan örnekleri yeni toplama tüplerine aktarın ve bunları ETİKETSİZ OOSİT olarak etiketleyin. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun.

5. Epididimal kaudadan sperm toplanması

  1. ETİKETLİ veya ETİKETSİZ kardeşleri feda edin.
  2. Hayvanları masanın üzerine sırt yaslanmış olarak yerleştirin, karnı% 70 etanol ile ıslatın ve geniş bir laparotomi yapın.
  3. Epididimi çıkarın ve hemen 3 mL PBS'ye (pH 7.6) daldırın ve spermi kanallardan boşaltmak için gevşek bir şekilde kesin.
  4. Sperm örneklerini tülbentten süzün.
  5. Sperm hücrelerini 800 x g'da 10 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.
  6. Peleti 1 mL soğuk deiyonize suda tekrar süspanse edin. Sadece sperm hücreleri hipotonik çözeltiye direnirken, sperm olmayan hücreler patlayacaktır.
  7. Sperm hücrelerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
  8. Tüpleri etiketleyin ve ETİKETLİ veya ETİKETSİZ kardeşlerden toplanıp toplanmadıklarına bağlı olarak ETİKETLİ SPERM ve ETİKETSİZ SPERM olarak gruplandırın.
  9. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve numuneleri -80 °C'de saklayın.

6. Lipitlerin ve polar metabolitlerin ekstraksiyonu

  1. Numuneyi 1-5. adımlardan 4°C'de buz üzerinde dengeleyin.
  2. Numunelere 225 μL buz gibi soğuk metanol (MeOH) ekleyin ve -30 °C'de 1 dakika inkübe edin ve ardından 10 dakika sonik banyoya koyun.
    1. İsteğe bağlı: deney koşulunu ayarlarken, polar olmayan ve polar metabolitler için ekstraksiyon verimliliğini ölçmek için sırasıyla iç standartlar olarak hem C16-Seramid-13 C3-15 N hem de L-Lizin-ε-15N hidroklorürden 0.1-2 ppm ekleyin.
  3. 750 μL buz gibi soğuk metil tert-bütil eter (MTBE) bir Termomiksere 4 ° C'de (550 rpm) 1 saat ekleyin.
  4. Santrifüj işleminden sonra numunelere 188 μL H2O ekleyin. Üst fazları (lipitler) alt fazdan (polar metabolitler) ayırın ve kurutun.
    DİKKAT: MeOH, yutulduğunda körlüğe ve karaciğerde, böbreklerde ve kalpte hasara neden olur. Aşırı maruz kalma, merkezi sinir sistemi üzerinde birikimli bir etkiye sahiptir. MTBE cilt, göz ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Çeker ocak altında çalışın.
  5. Numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun. Kurutulmuş numuneleri kütle/spektrometri analizine kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Kurutulmuş numuneler -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir ve kütle/spektrometri analizi için beklenebilir. İmplantasyon öncesi embriyolarda daha az temsil edilen metabolitlerin tanımlanması için, aynı çiftleşme çiftinden ve çiftleşme olayından elde edilen örneklerin havuzlanması gerekebilir.

7. Sterollerin çıkarılması

NOT: Plastik tüplerin ve uçların kullanılmasından kaçının [polar olmayan organik çözücü tarafından çözülürler]; bunun yerine, sıvıları dağıtmak için cam tüpler ve cam Pasteur pipetleri kullanın.

  1. Numuneyi 1-5. adımlardan 4 °C'de buz üzerinde dengeleyin. Toplanan numuneleri 500 μL'lik bir Metanol / H20 %70 v / v çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir cam tüpe aktarın.
    1. 30 saniye boyunca girdap yaparak homojenize edin. Homojenatı 4 °C'de 16 saat bekletin.
    2. İsteğe bağlı: Deney koşulunu ayarlarken, steroller için ekstraksiyon verimliliğini ölçmek için iç standartlar olarak 0.1-2 ppm bitki sterol Sitostanol-5,6,22,23-d4 ekleyin.
      DİKKAT: MeOH, yutulduğunda körlüğe ve karaciğerde, böbreklerde ve kalpte hasara neden olur. Aşırı maruz kalma, merkezi sinir sistemi üzerinde birikimli bir etkiye sahiptir.
  2. Numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.220 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı temiz bir cam tüpe aktarın ve 500 μL PBS ile destekleyin.
  3. 7 mL di buz gibi soğuk Dietil eter ekleyin ve 1 dakika boyunca girdap yapın. Numuneyi 1-2 dakika bekletin ve faz ayrılmasını bekleyin. Tüpü kuru buz/aseton banyosuna batırarak dondurun. Dondurulmamış Dietil eter fazını yeni etiketlenmiş bir cam tüpe aktarın.
    DİKKAT: Dietil eter son derece yanıcı bir sıvı ve buhardır ve hava ve ışıkta patlayıcı peroksitlere ayrışır. Alevlerle yakın temas halinde çalışmayın. Dietil eter yutulduğunda tehlikelidir ve cilde zararlıdır.
  4. Su fazını 37 °C'de çözdürün ve adım 4.3'ü tekrarlayın. Adım 4.3-4.4'te toplanan Dietil eter fazlarını tek bir cam tüpte birleştirin.
  5. Numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun. Kurutulmuş numuneleri kütle/spektrometri analizine kadar -80°C'de saklayın.

8. Örnek türevlendirme

NOT: Numuneler, spesifik metabolitlerin (kolesterol, yağ asitleri, amino asitler) analizi için TMS türevlendirmesinden faydalanacaktır.

  1. Numuneleri oda sıcaklığında dengeleyin
    DİKKAT: Eksik dengeleme, tüp duvarları ve numuneler üzerinde atmosferik suyun yoğunlaşmasına neden olabilir. Su, TMS türevlendirmesi için ciddi bir rekabet içindedir.
  2. Numuneleri 50 μL piridin içinde çözündürün ve 25 μL N, O-Bis (trimetilsilil (TMS) trifloroasetamid (BSTFA) ekleyerek türevlendirin. Numuneleri 60 ° C'de 90 dakika inkübe edin. Numuneleri döndürün ve hemen GC-MS analizine devam edin.
    DİKKAT: Piridin yanıcı, tahriş edici ve toksiktir. BSTFA yanıcı, aşındırıcı ve tahriş edicidir. Çeker ocak altında çalışın ve koruyucu eldiven kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Spermden oosite metabolit transferini izlemek için, ETİKETLİ ve ETİKETSİZ gruplardan sirelerle çiftleştirilmiş C57 BL/6J dişilerden izole edilen morulalar toplanır ve Kütle Spektrometresi tabanlı Metabolomikler ile analiz edilir. Metabolitler, adım 6-7'de tarif edildiği gibi ekstrakte edildi ve adım 8'de tarif edildiği gibi TMS ile türetildi. ETİKETLİ morulalar, ETİKETLENMEMİŞ morulalar, ETİKETLENMEMİŞ oositler, ETİKETLİ ve ETİKETLENMEMİŞ sperm hücrelerinin metabolomik ve lipidomik profillemesi yapıldı. Elde edilen profi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tarif edilen protokol, erkek farelerin 2H, 2O veya U,13C Glikoz ile stabil izotop etiketlemesi ve ardından metabolomik analiz kullanılarak döllenme sırasında spermden oositlere aktarılan metabolitlerin tanımlanmasına izin verir. Morulalarda bulunan izotopik olarak etiketlenmiş metabolitler baba kökenlidir.

Hidrojen ve döteryum izotop olmalarına rağmen, kimyasal davranış açısından tamamen aynı değildirler. Ekolarak, b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2H2O filtrelenmiş, %99,8 atom 2HSigma Aldrich756822
AsetonSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, Kaliforniya, ABD)
C16-Seramid-13C3-15NLGC standardıTRC-C342770-25MG
diklorometanSigma Aldrich34856
Dietil eter Sigma Aldrich673811
etanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (İnsan koryonik gonadotropini,Sigma AldrichCG5-1VL Serisi
L-Lizin-ε-15N hidroklorürSigma Aldrich608971
Erkek ve kadın  C57BL/6JOlaHsd farelerInotiv C57BL/6JOlaHsd
metil tert-bütil eter (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-Bis(trimetilsilil(TMS)
trifloroasetamid (BSTFA)		Supelco15238
PBSUygulamaA0965-9010 Serisi
PMSG (Hamile kısrak s serumu)Lee Biyolojik Çözümler493-10
piridinSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Şimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
Sodyum triflorasetatSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltoniği
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltoniği
U13C glukoz Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Bilimsel
VanGuard CSHTM ön sütunu (5.0 &kez; 2.1 mm; 1.7 μ m, 130 Å)Sular

Kaynaklar

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kararl zotop EtiketlemeSperm Oosit TransferiEpigenetik Kal t mMetabolomik AnalizLipid EkstraksiyonuPolar MetabolitlerD teryum EtiketlemeTemel Bile en Analizi
Döllenme Sırasında Spermden Oosit'e Aktarılan Baba Metabolitlerinin Kütle Spektrometresi Tanımlaması için Kararlı İzotop In-Vivo Etiketleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.