Yöntem makalesi

Tam Kandan Düşük ve Normal Yoğunluklu Nötrofillerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 Şubat 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, manyetik izolasyon (negatif seçim) ve süreksiz yoğunluk gradyan ortamı kullanarak düşük ve normal yoğunluklu nötrofillerin tam kandan izole edilmesi için güvenilir bir yaklaşım sunuyoruz. Yüksek saflıkta hücrelerin (%≥93) el değmeden izolasyonunu sağlayarak, sağlık ve hastalıktaki rollerini anlamak için çok önemli olan nötrofil alt popülasyonlarının doğru aşağı akış analizini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortaya çıkan araştırmalar, insanlarda dolaşımdaki nötrofil popülasyonunun çeşitli alt tiplerden oluştuğunu ve tarihsel olarak yapıldığı gibi tek bir popülasyon olarak incelenmemesi gerektiğini göstermektedir. Özellikle, düşük yoğunluklu ve normal yoğunluklu nötrofillerin (LDN'ler, NDN'ler) fonksiyonel ve metabolik olarak farklı profillere sahip olduğu gösterilmiştir, bu da nötrofil araştırmaları yayınlanırken dikkate alınması gereken bir faktördür. Burada, LDN'lerin ve NDN'lerin tam kandan el değmeden izolasyonu ve ayrılması için modifiye edilmiş bir yöntem sunuyoruz.

Yoğunluk gradyan ortamı (1.135 g/mL) 9:10'da 10x PBS ile birleştirilir. %55, %70 ve %81'lik özgül yoğunluk gradyanları daha sonra %100 yoğunluk gradyan ortamının 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile birleştirilmesiyle yapılır. Negatif seleksiyona dayalı manyetik izolasyon kiti kullanılarak rıza gösterilen donörlerden elde edilen 12 mL periferik tam kandan izole edilen nötrofiller, %55'lik fraksiyonda yeniden süspanse edilir. % 81 ve% 70 fraksiyonların 3 mL'lik bir hacmi 15 mL'lik bir tüpe katmanlanır, ardından toplam nötrofilleri içeren% 55 fraksiyon gelir. Yoğunluk gradyanları daha sonra 30 dakika boyunca 720 x g'da santrifüjlenir. %55/%70 arayüzde (LDN'ler) ve %70/%81 arayüzde (NDN'ler) iki farklı bant elde edilir. Hücreler dikkatlice ayrı tüplere pipetlenir ve PBS kullanılarak yıkanır. İzole edilen fraksiyonların saflığı, akış sitometrisi kullanılarak belirlenir. Hem LDN'ler hem de NDN'ler akım sitometrisi ile CD14lo, CD15+ SSChi olarak tanımlandı. İzolasyon saflığı, her iki tip için de canlı hücrelerin% ≥93'ü olarak hesaplandı.

Bu yöntem, LDN ve NDN'leri periferik kandan ayırmak için güvenilir ve verimli bir yaklaşım sağlar ve izole edilen hücrelerin yüksek saflığını ve canlılığını sağlar. Nötrofil izolasyonunun hassasiyetinin arttırılması, bu farklı nötrofil alt popülasyonlarının daha doğru aşağı akış analizlerini kolaylaştırır. Bunlar, nötrofil heterojenliği ve bunun çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlardaki etkileri hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofiller granüler bağışıklık hücreleridir ve periferik kanda en bol bulunan lökosittir ve ortalama olarak lökositlerin yaklaşık %50-70'ini oluşturur. Kemik iliğinde granülosit-monosit öncüllerinden (GMP'ler) gelişirler ve bu da granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) varlığında hematopoietik progenitör hücrelerden (HPC'ler) gelişir. Homeostazda, ~ 24 saatlik bir ömre sahiptirler, ancak çalışmalar, ömürlerinin belirli fizyolojik koşullar ve kronik bağışıklık aktivasyonu1, iltihaplanma1 ve hatta kararlı durumda doku ikametgahı2 gibi ilişkili mikro ortamlar altında uzatılabileceğini göstermiştir. Nötrofiller uzun zamandır patojenlere karşı ilk savunma hattı olarak kabul edilmektedir ve anti-mikrobiyal etkilerini 3 ana efektör işlevi aracılığıyla ortaya çıkarır - degranülasyon, fagositoz ve nötrofil hücre dışı tuzak (NET) aktivasyonu ve salınımı (NETosis).

Nötrofil fonksiyonu ve biyolojisi üzerine yapılan çoğu çalışma, toplam nötrofil popülasyonu için sonuçları inceler. Bununla birlikte, N1 (anti-tümör) / N2 (pro-tümör) alt tiplerini tanımlayan kanser ortamlarında yapılan çalışmalardan, nötrofillerin olgunluk, hastalık ve fizyolojik duruma ve hatta hücresel yoğunluğa (düşük yoğunluklu ve normal yoğunluklu nötrofiller) göre sınıflandırılmasına kadar, insan nötrofil popülasyonunun fenotipik olarak çeşitli alt tipler oluşturduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Bu nötrofil alt tiplerinin varlığının tamamen farklı hücre tipleri olmasına veya plastisitenin karmaşık doğasına atfedilip atfedilemeyeceğine, atipik nötrofiller hakkında giderek artan bir literatür vardır ve normal yoğunluklu nötrofillerden ayrı düşük yoğunluklu nötrofilleri incelemek için zorlayıcı bir fırsat sunmaktadır3.

SLE hastalarında ilk kez proinflamatuar nötrofil alt kümesi4 olarak tanımlanan LDN'ler, o zamandan beri kronik hastalıklarda, gebelikte ve hatta sağlıklı dolaşımda, pro-inflamatuar ve baskılayıcı kapasitelerdetanımlanmıştır 5,6,7,8. LDN'ler, tam kan yoğunluk gradyan ortamı üzerinde santrifüj edildiğinde periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ile eş zamanlı olarak bulunur. Özgül yoğunlukları, 1.083 g/mL'deki NDN'lere kıyasla yaklaşık 1.077 g/mL'ye karşılık gelir9. Konuyla ilgili hala önemli tartışmalar olsa da, LDN'lerin daha olgunlaşmamış bir granülosit fenotipine benzediğine dair spekülasyonlar vardır (promiyelositlere ve miyelositlere benzer, yoğunluğu 1.080 g/mL'nin altındadır)9,10. Diğerleri hala hastalığın varlığına veya yokluğuna bağlı olarak hem olgun hem de olgunlaşmamış LDN fenotipleri olduğunu düşünmektedir 11,12,13. Bununla birlikte, LDN'ler sağlıklı bireylerde de tespit edilmiştir; Bununla birlikte, yeterli sayıda izole edilmesinin zorluğu nedeniyle bazı çalışmalara dahil edilmeleri sınırlıdır5.

Bu çalışma, bu iki popülasyonu, yerinde metabolik deneyler yapmamıza izin verecek miktarlarda (minimum 0.5 × 106 hücre / mL) izole etmeyi amaçladı. Bunu yaparken, mevcut bir protokol5, LDN'leri ve NDN'leri tam kandan izole etmek ve karakterize etmek için en iyi sonucu sağlayan, yaygın olarak bildirilen fenotipik belirteçler13,14 ile optimize edilmiştir (Şekil 1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan örnekleri, sağlıklı katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alınarak toplandı. Çalışma, hem St. James's Hastanesi hem de Tallaght Üniversite Hastanesi'nin Araştırma Etik Kurulu'ndan onay aldı.

1. Yoğunluk gradyan ortamı, izotonik çalışma çözeltileri fraksiyonları ve hücre ayırma tamponunun hazırlanması

  1. Yoğunluk gradyan ortamından izotonik çalışma çözeltilerinin hazırlanması
    1. İzotonik% 100 çalışma çözeltisinin hazırlanması (~ 1.123 g / mL)
      1. İzotonik% 100 çalışma çözeltisini hazırlamak için, 27 mL yoğunluk gradyan ortamını 3 mL 10x PBS ile birleştirin. Bu, daha fazla seyreltme için uygun bir izotonik çözelti ile sonuçlanır.
    2. İzotonik% 81 çalışma çözeltisinin hazırlanması (~ 1.0996 g / mL)
      1. 8.1 mL izotonik %100 çalışma solüsyonunu (adım 1.1.1'de hazırlanan) 1.9 mL 1x PBS ile karıştırarak izotonik %81 çalışma solüsyonunu hazırlayın. Homojenliği sağlamak için iyice karıştırın.
    3. İzotonik% 70 çalışma çözeltisinin hazırlanması (~ 1.0861 g / mL)
      1. İzotonik% 70 çalışma çözeltisini hazırlamak için, 7 mL izotonik% 100 çalışma çözeltisini 3 mL 1x PBS ile birleştirin. Çözeltinin iyice karıştırıldığından emin olun.
    4. İzotonik% 55 çalışma çözeltisinin hazırlanması (1.0676 g / mL)
      1. 5.5 mL izotonik %100 çalışma solüsyonunu 4.5 mL 1x PBS ile karıştırarak izotonik %55 çalışma solüsyonunu yapın. İyice karıştırın.
  2. Degrade kesirlerin katmanlanması
    1. Degrade kesir katmanlaması
      1. 15 mL'lik bir konik tüp kullanarak, altta 3 mL izotonik% 81 çalışma solüsyonunu dikkatlice katman. Ardından, katmanları karıştırmaktan kaçınarak üstüne 3 mL izotonik %70 çalışma solüsyonunu yavaşça ve nazikçe katmanlayın. Bu gradyan, hücre ayrımı için kullanılacaktır.
  3. Hücre ayırma tamponunun hazırlanması
    1. 500 mL hücre ayırma tamponunun hazırlanması
      1. Hücre ayırma tamponunu hazırlamak için,% 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asidi (EDTA) 1x PBS ile toplam 500 mL hacme birleştirin. İzolasyon işlemi sırasında hücreleri yıkamak ve yeniden süspanse etmek için bu tamponu kullanın.
        NOT: Katmanların iyi ayrıldığından ve rahatsız edilmediğinden emin olun. Bu protokolde, izotonik çalışma solüsyonları, önceki çalışmalarla tutarlı olarak, hazırlama yöntemine göre "%100", "%81", "%70" ve "%55" olarak adlandırılır5. Bununla birlikte, bu etiketlerin çalışma çözeltilerinin gerçek nihai konsantrasyonlarını temsil etmediğini açıklığa kavuşturmak önemlidir. Örneğin, "%100" yoğunluk gradyan ortamı, 27 mL saf yoğunluk gradyan ortamının 3 mL 10x PBS ile karıştırılmasıyla hazırlanır ve bu da %90 İzotonik çalışma çözeltisinin nihai konsantrasyonu ile sonuçlanır. Sonraki seyreltmeler (örneğin, "%81", "%70" ve "%55") benzer şekilde gerçek yüzde konsantrasyonlarından ziyade hazırlama oranlarını yansıtır. Bu isimlendirme, konuyla ilgili daha önceki literatürde kullanılan terminoloji ile tutarlılığı korumak için korunmuştur.

2. Negatif seçim kullanılarak nötrofillerin tam kandan izolasyonu

  1. Manyetik boncukların hazırlanması
    1. Kullanmadan önce tamamen yeniden askıya alındıklarından emin olmak için manyetik boncukları 30 saniye boyunca iyice sarın.
  2. Kan hazırlama
    1. Her donör için, 4 mL tam kanı üç ayrı 14 mL yuvarlak tabanlı tüpe alın.
  3. Nötrofil izolasyon kokteyli ve manyetik boncukların eklenmesi
    1. Her tüpe 50 μL nötrofil izolasyon kokteyli ve mL kan başına 50 μL manyetik boncuk ekleyin. 4 mL kan için, her reaktiften 200 μL ekleyin.
    2. Nazikçe pipetleyerek karışımı iyice süspanse edin ve reaktiflerin istenmeyen hücrelere bağlanmasını sağlamak için oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
  4. Yıkama ve manyetik ayırma - ilk tur
    1. Hücre ayırma tamponu kullanarak her tüpü 12 mL'ye kadar doldurun ve iyice karıştırın.
    2. Kapaksız tüpleri bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve istenmeyen hücrelere bağlı manyetik boncukların tüp duvarına çekilmesini sağlamak için RT'de 10 dakika inkübe etmelerine izin verin.
  5. İlişkisiz hücrelerin toplanması
    1. Nötrofil içeren berrak hücre süspansiyonunu her tüpten bir transfer pipeti kullanarak yeni, temiz bir tüpe dikkatlice aktarın. Orijinal tüpü mıknatıstan çıkarın.
  6. Manyetik boncuk yeniden uygulama ve inkübasyon - ikinci tur
    1. Manyetik boncukları 30 saniye boyunca tekrar vorteksleyin. Yeni aktarılan hücre süspansiyonuna adım 2.3'te olduğu gibi aynı hacimde manyetik boncuk ekleyin. İyice yeniden askıya alın ve RT'de 5 dakika daha inkübe edin.
  7. Son manyetik ayırma ve toplama
    1. Tüpleri kapaksız mıknatısın üzerine geri yerleştirin ve RT'de 10 dakika daha inkübe edin.
    2. Şeffaf hücre süspansiyonunu dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Bu son süspansiyon, izole edilmiş toplam nötrofil popülasyonunu temsil eder.

3. Düşük yoğunluklu nötrofillerin (LDN'ler) ve normal yoğunluklu nötrofillerin (NDN'ler) toplam nötrofil popülasyonundan ayrılması

  1. Hücre süspansiyonlarının havuzlanması ve hazırlanması
    1. Her donör için, izole edilmiş nötrofil süspansiyonlarını 50 mL'lik tüplere koyun. Hücre ayırma tamponunu kullanarak her tüpü toplam 50 mL hacme kadar doldurun.
  2. Santrifüj
    1. Tüpleri, fren açıkken RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
  3. Yeniden süspansiyon ve hücre sayımı
    1. Süpernatanı atın ve nötrofil peletini 1 mL hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Toplam nötrofil sayısını belirlemek için bir hücre sayımı yapın.
  4. Yoğunluk gradyan ortamı hazırlama
    1. Tüpleri, fren açıkken RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve nötrofil peletini %55 yoğunluklu gradyan ortamının 3 mL'sinde yeniden süspanse edin. Optimum çözünürlük için, 5-6 × 106 toplam nötrofil başına 3 mL %55 yoğunluk gradyan ortamı kullanın.
    2. Gerekirse, yeniden süspanse edilmiş hücreleri önceden hazırlanmış birden fazla yoğunluk gradyan tüpüne bölün ve her tüpe 3 mL hücre süspansiyonunun katmanlandığından emin olun.
  5. Yoğunluk gradyan tüpleri üzerine katmanlama
    1. %55 yoğunluk gradyan ortamını içeren 3 mL hücre süspansiyonunu önceden hazırlanmış yoğunluk gradyan tüplerinin üzerine yavaşça katmanlayın (bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlanır). Degradeyi bozmamak için dikkatli katmanlama sağlayın.
  6. Yoğunluk gradyan santrifüjleme
    1. Tüpleri freni kullanmadan 30 dakika boyunca 720 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, katmanları rahatsız etmemek için tüpleri dikkatli bir şekilde tutun.
  7. Nötrofil fraksiyonlarının izolasyonu
    1. Santrifüjlemeyi takiben, nötrofillerin iki ayrı katmana ayrıldığını gözlemleyin:
      Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN'ler) %55/%70 arayüzde yer alacak ve yaklaşık 3 mL işaretinde bir üst bant oluşturacak ve normal yoğunluklu nötrofiller (NDN'ler) %70/%81 arayüzde olacak ve 6 mL işareti civarında bir alt bant olarak görünecektir.
    2. Bir transfer pipeti kullanarak, her katmanı dikkatlice izole edin ve bunları ayrı 15 mL'lik tüplere aktarın.
  8. İzole fraksiyonların yıkanması
    1. Herhangi bir artık yoğunluk gradyan ortamını yıkamak için, her 15 mL'lik tüpe 15 mL işaretine kadar 1x PBS ekleyin.
    2. Fren açıkken RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin. Hücreler sert bir pelet oluşturmazsa ve bunun yerine askıda kalırsa, kalan yoğunluk gradyan ortamının varlığını gösteren bu yıkama adımını tekrarlayın.
  9. Hücre sayımı ve aşağı akış uygulamaları
    1. Her fraksiyondaki hücreleri sayın ve gerektiğinde metabolik deneyler, akış sitometrisi boyama, RNA ekstraksiyonu veya protein lizisi gibi aşağı akış uygulamalarına devam edin.
      NOT: Hücreleri kapladıktan sonra, plakayı 210 dakika boyunca 1 × g'da döndürmeniz (frenleme) önerilir.

4. İzole LDN ve NDN'nin fenotiplendirilmesi

  1. ~ 0.5-1 × 106 LDN ve NDN'yi izole edin. CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc bloğu ve canlılık boyası kullanarak 2x konsantre antikor mastermix yapın.
  2. İzole edilmiş LDN ve NDN popülasyonlarını, hücreleri boyayan antikorların son seyreltilmesi sırasıyla 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc bloğu) ve 1:50 (canlılık boyası) olacak şekilde eşdeğer bir antikor mastermix hacmi ile boyayın.
  3. Hücreleri RT'de karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Hücrelerin antikor mastermix ve Fc bloğu ile iyice karıştığından emin olun.
  4. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın, ardından 400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  5. Hücreleri karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca% 1 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
  6. Hücreleri tekrar PBS ile yıkayın, 400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  7. Hücreleri 200 μL PBS'de veya gerektiği gibi yeniden süspanse edin ve hücreleri mümkün olan en kısa sürede bir akış sitometresinde alın.
    NOT: Lekeli ve sabit hücreler, floroforların foto-ağartılmasını önlemek için karanlıkta 4 ° C'de kısa süreli olarak saklanabilir. Bununla birlikte, ideal olarak, fenotipleme prosedürü, optimal hücre canlılığı ve doğru sonuçlar sağlamak için boyama ve fiksasyondan hemen sonra gerçekleştirilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toplam nötrofillerin yoğunluk gradyan ortamı üzerinde başarılı bir şekilde katmanlanması Şekil 1B'de gözlemlenebilir. İki farklı bant elde edilmelidir. Gradyanların karışımı meydana gelirse veya tüp başına katmanlanan toplam nötrofil sayısı yüksekse (kabaca 5-6'dan × 106'dan büyükse), bantlar dağınık görünecektir (Şekil 1C) ve iki nötrofil alt tipinin karışma riski önemli ölçüde artar. İkincisini önlemek için, yoğunluk gradyanlı tüp başına 5-6 × 10

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, toplam nötrofil popülasyonunu düşük yoğunluklu ve normal yoğunluklu nötrofillere bölmek için optimize edilmiş bir yöntem, önceki yöntemlerden uyarlanan akış sitometrisi kullanılarak her hücre tipinin fenotipik karakterizasyonu ile birliktesunuyoruz 5.

Bu protokol, LDN'lerin ve NDN'lerin tam kandan izole edilmesine dayanır. Önemli bir adım, toplam nötrofillerin negatif seçim yöntemleriyle izole edilmesidir. Pozitif seçim yöntemle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Sağlık Araştırma Kurulu EIA-2024-002 ve Dublin Kraliyet Şehri Hastanesi Vakfı tarafından finanse edilmiştir. Bu el yazması için sağlıklı bağışçılardan örnek toplamadaki yardımları için Dr. Lorraine Thong ve Dr. Kevin Brown'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Boru (17 x 100 mm)Corning Science352059
APC anti-insan CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 anti-insan CD10 (25 test)BioLegend312217
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu SigmaD8537-1L
EasyEights EasySep MıknatısıKök Hücre Teknolojileri# 18103
EasySep Tamponu (hücre ayırma tamponu)Kök Hücre Teknolojileri# 20144
EasySep Doğrudan İnsan Nötrofil İzolasyonKiti Kök Hücre Teknolojileri# 19666
FcR Engelleme Reaktifi, insanMiltenyi Biotec130-059-901
FITC anti-insan CD16 (3G8)BioLegend302005
OneComp eBeads Tazminat BoncuklarıeBioscience Inc.01-1111-42
PE/CY7 insan karşıtı CD86 (BU63)BioLegend374209
PE/Dazzle 594 insan karşıtı CD15 (SSEA-1)BioLegend323037
Fosfat Tamponlu Salin Tabletleri Gibco18912-014
Zombi NIR Tamir Edilebilir Canlılık KitiBioLegend423105

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

D k Yo unluklu N trofillerN trofil Alt TipleriYo unluk Gradyan ile Ay rmaN trofil zolasyonuAk SitometrisiManyetik Boncuk ile zolasyonPeriferik KanH cre Ay rma TamponuN trofil Heterojenli i

İlgili makaleler