Method Article

İn Vitro İnsan Temelli İleri Pulmoner Fibrozis Modelinin Oluşturulması ve Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/67845

⸱

July 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroblast aktivasyon proteinine (FAP) dayalı olarak insan hassas kesilmiş akciğer dilimlerinde fibroblastların aktivasyonunu değerlendirmek için bir görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu metodoloji, fibrotik ilerlemeyi evrelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir platform oluşturur, insan dokusu mikro çevresinin aslına uygunluğunu korurken terapötik gelişim için translasyonel in vitro modelleri geliştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmoner fibrozis, alveolar yapının geri dönüşümsüz yıkımı ve ekstraselüler matriksin aşırı birikimi ile karakterizedir. Hayvan modelleri pulmoner fibroz araştırmalarında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, şu anda mevcut olan modellerin hiçbiri İPF'nin ilerleyici doğasını veya fibroblastik odaklar gibi tanımlayıcı histolojik özelliğini tam olarak özetlememektedir. Hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS) dahil olmak üzere gelişmiş in vitro modeller, genellikle fizyolojik olarak en ilgili pulmoner test sistemi olarak kabul edilir ve ilaç taraması için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, İPF akciğerindeki fibroz derecesinin ayırt edilememesi, elde edilen PCLS'de körleşme ve belirsizliğe neden olmuştur. Önceki araştırmalar, fibroblast aktivasyon proteininin (FAP) ILD'nin pro-fibrotik aktivitesini değerlendirebileceğini ve potansiyel olarak erken tanıya ve uygun terapötik pencerelerin seçimine katkıda bulunabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada, sağlıklı donörlerden ve İPF hastalarından şok dilimleyici kullanılarak 600 μm PCLS elde edilecek ve floresan sinyal yoğunluğuna dayalı fibroblast aktivitesinin derecesini belirlemek için FAP'ı hedefleyen moleküler problar kullanılarak değerlendirilecektir. Bu yaklaşım, pulmoner fibroz araştırmaları için gelişmiş bir in vitro model ve değerlendirme tekniği sağlayarak hastalık mekanizmalarını inceleme ve terapötik müdahaleleri değerlendirme yeteneğini geliştirir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmoner fibrozis (PF), etiyolojisi bilinmeyen ve özellikle kötü prognozu olan yaygın bir formdur ve medyan beş yıllık sağkalım oranı sadece %25'tir1. İntratrakeal bleomisin uygulama modeli şu anda klinik öncesi çalışmalar için en yaygın kullanılan hayvan modelidir2. Bununla birlikte, bleomisin tarafından indüklenen fibroz geçicidir ve zamanla düzelir, bu da IPF3'ün geri dönüşümsüz doğası ile keskin bir tezat oluşturur. Ayrıca, intratrakeal bleomisin modeli, cerrahi veya cerrahi olmayan endotrakeal uygulamadan kaynaklanan fibrozisin heterojen şiddeti nedeniyle önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Mevcut hayvan modellerinin bu sınırlamaları, İPF4'ü hedefleyen klinik çalışmaların yüksek başarısızlık oranına katkıda bulunmaktadır.

Hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS), hastalığa özgü hücresel karışma ağlarını ve mikro çevreyi sadık bir şekilde korudukları için çeşitli hastalıklarda kullanılmıştır 5,6,7. Pulmoner fibrozda, İPF akciğerlerinden gelen PCLS, doğal doku mimarisini ve hücresel heterojenliği koruyarak, çeşitli hücre tiplerinin ve hücre-hücre dışı matris etkileşimleriningözlemlenmesini sağlar 8,9 ve bunları pulmoner patofizyolojiyi araştırmak için temsili bir ex vivo model olarak oluşturur. Bununla birlikte, pulmoner fibrozis akciğerlerde heterojen fibrotik lezyonlar ile karakterize olduğundan, PCLS örneklemesi doğal olarak kördür. Elde edilen kesitlerin hareketsiz fazda mı, aktif fazda mı yoksa normal akciğer dokusunda mı fibrotik alanları temsil ettiğini görsel olarak ayırt etmek mümkün değildir. Bu sınırlama, görsel değerlendirme ve tarama araçlarının gerekliliğini vurgulamaktadır. Önceki araştırmalar, fibroblast aktivasyon proteininin (FAP) İPF hastalarının akciğer dokusunda yüksek oranda ve spesifik olarak eksprese edildiğini buldu, bu da FAP'ın ILD10'un pro-fibrotik aktivitesini değerlendirebileceğini gösteriyor.

Bu çalışmada, FAP'a karşı tek zincirli bir antikor, gelişmiş doku penetrasyonu ile hedeflenmiş bir moleküler görüntüleme probu geliştirmek için indosiyanin yeşili (ICG) ile etiketlendi. Sağlıklı donörlerden ve İPF hastalarından elde edilen 600 μm PCLS bu prob kullanılarak görüntülendi ve fibroblast aktivitesi floresan sinyal yoğunluğuna göre değerlendirildi. Bu görüntüleme yöntemi, operasyonun basitliği, sitomimari bütünlüğü ve canlılığı korurken patojenik ilerlemenin uzunlamasına izlenmesini sağlarken geleneksel fibroz değerlendirme tekniklerinden (Western blotting, qPCR, Masson'un trikrom boyama veya immünofloresan) daha iyi performans gösterir. Daha da önemlisi, kullanımı kolaydır ve sadece 90 dakika gerektirir. Bu, PCLS in vitro modeli için akciğer fibrozu araştırmalarını kolaylaştıran gelişmiş bir tarama aracı sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Guangzhou Tıp Üniversitesi Birinci Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (2021G-29). İPF tanısı, ATS/ERS/JRS/ALAT (2022) tarafından belirlenen tanı kriterlerine uygun olarak fizik muayene ve göğüs yüksek çözünürlüklü bilgisayarlı tomografi bulgularına dayanarak konuldu. İPF hastalarının tüm örnekleri akciğer nakli veya akciğer biyopsisi ile elde edildi. Beyin ölümü tanısı konan organ bağışçılarından sağlıklı akciğer doku örnekleri alındı10. Doku toplanması için her hastadan veya hastanın ailesinden alınmadan önce yazılı onay alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, çözümler ve araçlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İnsan PCLS'nin Hazırlanması

NOT: Hastalar, akciğer nakli veya biyopsiden önce HIV, HCV veya sifiliz gibi virüsler için rutin olarak taranır ve laboratuvar personelinin iş güvenliğini sağlamak için sonraki deneylere devam etmeden önce negatif test yapmalıdır.

  1. Çözeltilerin hazırlanması
    1. Fosfat tamponlu çözelti (1× PBS) hazırlayın ve 4 °C'de önceden soğutun.
    2. % 2 agaroz çözeltisi hazırlayın. 2 g agarozu tartın ve bir Erlenmeyer şişesine aktarın. 100 mL PBS ekleyin, iyice karıştırın ve karışım kuvvetli bir kaynama noktasına (≥95 °C) ulaşana kadar bir mikrodalgada ısıtın, tamamen berrak, homojen hale gelir ve görünür parçacıklar veya çizgiler içermez. Aşırı kaynamayı önlemek için ısıtma sırasında şişeyi ara sıra döndürün. Solüsyonu kullanana kadar 37 °C'de bir su banyosuna koyun.
  2. Hassas kesilmiş akciğer dilimleri
    1. Fazla kirleri ve kanı temizlemek için akciğer dokusunun dış yüzeyini PBS ile yıkayın.
    2. Uygun hacimde agarozu aspire etmek için 20 mL'lik bir şırınga (1,2 mm iğne) kullanın ve trakeaya yerleştirin. Tamamen şişene kadar akciğer loblarına agaroz enjekte edin. Agaroz sızıntısını önlemek için belirgin bir dirençle karşılaştığınızda enjeksiyonu durdurun.
      NOT: Her 5 × 2 × 1 cm'lik doku bloğu için yaklaşık 10 mL agaroz gereklidir, taşmayı önler. Daha küçük doku parçaları için, gömmeye yardımcı olmak için 5 mL'lik bir şırınga ve gömme kalıpları (örneğin, silikon kalıplar, plastik tepsiler veya boyuta göre kesilmiş santrifüj tüpleri) kullanın. Kalıba 1-2 mm kalınlığında bir agaroz taban tabakası dökün ve yarı katılaşmasına izin verin. Akciğer dokusunu nazikçe yarı katı agarozun üzerine yerleştirin, ardından kabarcıkları önleyerek dokuyu tamamen kaplamak için yavaşça ilave agaroz dökün. Agarozun tamamen katılaşmasına izin verin.
    3. Agaroz polimerizasyonuna izin vermek için akciğerleri yaklaşık 30 dakika buzun üzerine yerleştirin. Polimerizasyonu doğrulamak için plevrayı sertlik ve serinlik açısından kontrol edin; Gerekirse soğutmaya devam edin.
    4. Akciğer dokusunu keskin bir bıçak kullanarak 1-2 cm'lik plakalar halinde kesin.
    5. Buz banyosu tepsisini kesme tezgahının üzerinde ortalayın ve ön soğutma için önceden buz küpleriyle doldurun.
    6. Güç anahtarını açın ve s'yi yükseltmek için YUKARI düğmesini basılı tutun.ampuygun bir konuma getirin.
    7. Bıçağı dikkatlice bıçak tutucusuna yerleştirin.
      NOT: Yaralanmayı önlemek için bıçağı dikkatli bir şekilde tutun. Kullanılmış bıçakları belirlenmiş keskin kaplara atın.
    8. Yaklaşık 3 cm uzunluğunda ve 1 cm genişliğinde bir bant parçası kesin. Yapışkan tarafı tepsiye takın ve yapışkan olmayan tarafı siyanoakrilat yapıştırıcı ile eşit şekilde kaplayın.
    9. Forseps kullanarak bir parça akciğer dokusu alın. Yüzeyi emici kağıtla kurulayın ve tutkal kaplı bandın üzerine yerleştirin. Sıkı bir yapışma sağlamak için hafifçe bastırın.
    10. Yapıştırıcı sertleştikten sonra tepsiyi buz banyosu tepsisine yükleyin. Doku bloğu suya batırana kadar önceden soğutulmuş PBS ile doldurun.
    11. Titreşim frekansını "10" ve kesme hızını "2" olarak ayarlayın. Dilimlemeye başlamak için FWD düğmesine basın. İlk dilim tamamen kesildikten sonra, durdurmak için STP düğmesine basın, ardından bıçağı geri çekmek için RVE düğmesine basın. İlk dilimi atın.
    12. Kesit kalınlığını 6 μm'ye ayarlamak için döner tablayı manuel olarak 600 kez döndürün. Dilimlemeye devam etmek için FWD düğmesine basın ve kesit kesildikten sonra STP düğmesine basın. Bıçağı geri çekmek ve cımbız kullanarak akciğer dilimini almak için RVE'ye basın. Dilimi %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren PBS'ye yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
    13. Her biri yaklaşık 600 μm kalınlığında ek PCLS elde etmek için yukarıdaki dilimleme adımlarını tekrarlayın.
    14. Mevcut doku bloğu neredeyse tükendiğinde, yeni bir doku bloğu ile değiştirin ve 1.2.4 ila 1.2.13 arasındaki adımları tekrarlayın.

2. FAP antikorunun saflaştırılması

NOT: Daha önce tarif edildiği gibi bir C-terminali His etiketi içeren FAP'a özgü tek alanlı antikoru oluşturun11,12.

  1. Kombinatoryal kitaplıkları hareketsiz veya çözelti fazı hedeflerine karşı tekrar tekrar kaydırarak FAP'a özgü antikor fragmanlarının (scFv) yüksek verimli seçimini sağlamak için faj gösterimi gerçekleştirin. Sıkı yıkama ve elüsyon yoluyla bağlı fajları kurtarın. E. coli'yi yeniden enfekte ederek fajları çoğaltın ve hedef bağlayıcıları 3-4 döngü boyunca zenginleştirin. Yüksek afiniteli antikorları tanımlamak için faj ELISA ve DNA dizilimi kullanarak klonları doğrulayın12.
  2. Anti-FAP tek zincirli değişken fragmanı kodlayan DNA dizisini, E. coli13'te ifade için bir His etiketi ile kaynaşmış pET-28a(+) vektörüne klonlayın.
  3. Rekombinant plazmiti E. coli BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Gece boyunca 20 ° C'de inkübe edilen shake-flask kültürlerinde izopropil-β-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG) kullanarak protein ekspresyonunu indükleyin14.
  4. Nikel-Nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) boncukları kullanarak FAP antikorunu süpernatanttan saflaştırın. Aşağı akış uygulamaları için PBS ile arabellek değişimi gerçekleştirin.
  5. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile antikor saflığını değerlendirin. Beklenen moleküler ağırlıkta tek bir baskın bant, yüksek saflığı gösterir.

3. FAP antikor afinitesinin değerlendirilmesi

  1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unda (DMEM) insan embriyonik böbrek 293T (HEK 1T) hücrelerinin kültürü.
  2. % 90 birleşmede 293T hücrelerine lentivirüs aşırı eksprese eden insan fibroblast aktivasyon proteini (hFAP) ekleyin. Kararlı bir 293T-hFAP hücre hattı oluşturmak için 96 saat inkübe edin.
  3. Hem 293T hem de 293T-hFAP hücrelerini %0.25 tripsin-EDTA ile sindirin ve hücreleri toplayın.
  4. Hücreleri PBS ile yıkayın ve FAP antikoru ile inkübe edin, ardından Alexa Fluor 488 konjuge anti-His IgG ile inkübe edin.
  5. NovoCyte akış sitometresi15,16 kullanarak floresan yoğunluğunu analiz edin.

4. scFv-FAP-ICG molekül probu etiketleme

  1. PBS kullanarak FAP-scFv konsantrasyonunu 2 mg / mL'ye ayarlayın.
  2. 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv) molar oran elde etmek için indosiyanin yeşili NHS esteri (ICG-NHS) ekleyin.
  3. Girdap yaparak ve çalkalayarak iyice karıştırın.
  4. Reaksiyonu karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. Bir tuz giderme sütunu kullanarak bağlanmamış boyayı çıkarın. Son konjuge ürünü karanlıkta 4 °C'de saklayın.

5. PCLS'de fibroblast aktivitesinin derecesini değerlendirmek için scFv-FAP-ICG moleküler probu

  1. PCLS'yi kestikten sonra, her kuyucuk için bir bölümü 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kalan kan ve kalıntıları gidermek için her kuyuyu 1 mL PBS ile iki kez durulayın.
  2. PCLS'yi FBS olmadan 1 mL DMEM'e daldırın. 5 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda scFv-FAP-ICG ekleyin. Işıktan koruyarak hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
  3. Numuneleri PBS ile her biri 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın.
  4. Aşağıdaki ayarlarla in vivo hayvan görüntüleme sistemini kullanarak PCLS'nin ICG floresan görüntülerini elde edin: 785 nm'de uyarma dalga boyu ve 810 nm'de emisyon dalga boyu.
  5. Floresan yoğunluğuna bağlı olarak PCLS'nin fibroz aktivitesini değerlendirin. Fotonlar/s/cm2/sr olarak ifade edilen floresan parlaklığı ile uyumlu yazılımı kullanarak ilgi alanlarını (ROI) tanımlayın.
    1. Yazılımın sahte renkli alanı otomatik olarak özetlemesine izin vermek için ROI Seç düğmesine tıklayın. ROI yerleşimi yanlışsa, manuel olarak ayarlayın. Bölgedeki sinyal gücünü belirlemek için Hesapla'ya tıklayın. Birden çok alt bölge seçiliyse, tüm alt bölgelerdeki değerleri toplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan akciğer dokusunun PCLS için hazırlık prosedürü Şekil 1'de gösterilmiştir. İnsan akciğer dokusu agaroz içine gömüldü ve daha sonra bir tıraş bıçağı kullanılarak yaklaşık 1cm3 boyutunda doku blokları halinde kesildi. Kesilmiş ve düzleştirilmiş dokular bir mikrotom kullanılarak 600 μm kalınlığında kesit almak için bir platforma yapıştırıldı (Şekil 1A,B). PCLS, 12 oyuklu plakalarda inkübe edildi (Şekil 1C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki araştırma yöntemleri sayesinde, sağlıklı donörlerden ve İPF hastalarından PCLS hazırlandı. Eşzamanlı olarak, FAP'ın tek zincirli değişken fragmanlarını ifade etmek için memeli hücreleri kullanıldı ve saflıkları ve özgüllükleri doğrulandı. Fibroblast aktivasyon derecesini yansıtan FAP ekspresyon seviyelerini tespit etmek için FAP'ı hedefleyen ve ICG ile etiketlenmiş bir moleküler prob kullanıldı. Bu yaklaşım, pulmoner fibrozis tedavisi için ileri bir değerlendirme yöntemi sağla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82470061), Guangzhou Laboratuvarı Genç Bilim İnsanları Programı (QNPG23-15) ve Devlet Solunum Hastalıkları Anahtar Laboratuvarı Bağımsız Projesi (SKLRD-Z-202305) tarafından desteklendiği için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.25 tripsin-EDTAGibco15050-057
2 kez; Renk SYBR Yeşil qPCR Master Mix (ROX2)EZBioscienceA0012-R2
20 ml şırıngaKazananV532159
293T hücreBeyotimeC6008
502 tutkalZhuolideD-40
Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığıSigma AldrichA9414-25G
Anti-Kollajen I antikoruabcamab138492
Anti-Fibronektin antikoruabcamab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488MBLD291-A48
BL21BeyotimeD1009S
BladeGillette7in83a7Q
Renkli Ters Transkripsiyon Kiti (gDNA Çıkarıcı ile)EZBioscienceA0010CGQ
Coomassie Blue Süper Hızlı Boyama ÇözeltisiBeyotimeP0017F
DMEMGibco12800017
Erlenmeyer şişesiSichuan ShunboGG-17
FAP Tavşan mAbCST66562
FBSGibco10099-141
ForsepsRobozRS-5135
ICG-NHSRuixibioR-TE-157
IPTGMCE367-93-1
mikro teraziSecuraSecura225D-1CN
mikrodalgaMideoPM2002
Çok Modlu İn Vivo Hayvan Görüntüleme SistemiBioLightAniView600
Ni-NTAGenscriptL00250
NovoCyte akış sitometresiACEA  BiosciencesNovocyte
PBSGibco10010023
Penisilin-StreptomisinGibco15140122
SDS-PAGEBeyotimeP00528
Evrensel RNA SaflaştırmasıEZBioscienceEZB-RN4
VibratomDOSAKADTK-1000N
β-aktin Tavşan pAbYeasen30102ES
Primer
β-aktin astar-FiGenebook BiotechCATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-aktin astar-RiGenebook BiotechCTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP astar-FiGenebook BiotechTTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP astar-RiGenebook BiotechGCTGTGCTCGTGGATTTGT
Kollajen-I astar-FiGenebook BiotechGAGGGCCAAGACGAAGACATC
Kollajen-I astar-RiGenebook BiotechCAGATCACGTCATCGCAAC
Fibronektin astar-FiGenebook BiotechCGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronektin astar-RiGenebook BiotechAAACCTCGGCTTCCTCCATAA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raghu, G., et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: Idiopathic pulmonary fibrosis: Evidence-based guidelines for diagnosis and management. Am J Respir Crit Care Med. 183 (6), 788-824 (2011).
  2. Jenkins, R. G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 56 (5), 667-679 (2017).
  3. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), L152-L160 (2008).
  4. Spagnolo, P., Maher, T. M. Clinical trial research in focus: Why do so many clinical trials fail in IPF. Lancet Respir Med. 5, 372-374 (2017).
  5. Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 10, 245-256 (2018).
  6. Ferren, M., et al. Hamster organotypic modeling of SARS-CoV-2 lung and brainstem infection. Nat Commun. 12, 5809(2021).
  7. Bai, Y., et al. Cryopreserved human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking: A viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. Am J Respir Cell Mol Biol. 54 (5), 656-663 (2016).
  8. Price, A. R., Green, A. J., Brown, K. Precision-cut tissue slices: Applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
  9. MacKenzie, B., et al. Pre-clinical proof-of-concept of anti-fibrotic activity of caveolin-1 scaffolding domain peptide LTI-03 in ex vivo precision cut lung slices from patients with idiopathic pulmonary fibrosis. bioRxiv. 28, (2024).
  10. Yu, P., et al. Comprehensive analysis of fibroblast activation protein expression in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med. 207 (2), 160-172 (2023).
  11. Han, Y., et al. Efficient generation of recombinant anti-HER2 scFv with high yield and purity using a simple method. Biotechnol J. 19 (7), e2300745(2024).
  12. Seo, P., Song, E. W. Phage display screening of therapeutic peptide for cancer targeting and therapy. Protein Cell. 10 (11), 787-807 (2019).
  13. Neuhaus, V., et al. Precision-cut lung slices: An integrated ex vivo model for studying lung physiology, pharmacology, disease pathogenesis and drug discovery. Respir Res. 25, 231(2024).
  14. Huang, Z., et al. ImmunoPET imaging of human CD8+ T cells with novel 68Ga-labeled nanobody companion diagnostic agents. J Nanobiotechnol. 19 (1), 42(2021).
  15. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 49 (10), 1457-1973 (2019).
  16. Rosen, O., et al. A high-throughput inhibition assay to study MERS-CoV antibody interactions using image cytometry. J Virol Methods. 265, 77-83 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pulmonary FibrosisIn Vitro ModelPrecision Cut Lung SlicesFibroblast Activation ProteinExtracellular MatrixFibroblastic FociDrug ScreeningMolecular ProbesFluorescent SignalFibroblast Activity
Video Coming Soon

Related Articles