Yöntem makalesi

Yinelemeli Beyazlatma Genişletilmiş Çokluk Yaklaşımı kullanılarak tümör taşıyan dokunun üç boyutlu görüntülenmesi

DOI:

10.3791/67869

⸱

25 Nisan 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, NCI, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), NIBIB, NIH, 3Center for Immuno-Oncology, NCI, NIH

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, peritoneal metastazların üç boyutlu mimarisini karakterize etmek için optimize edilmiş bir multipleks immünofloresan protokolünü açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör mikroçevresinin (TME) mekansal heterojenliği, başarının spesifik immün hücre alt popülasyonlarının dağılımına bağlı olduğu immün onkoloji ajanları için terapötik yanıtın kritik bir belirleyicisidir. Son on yılda, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) veya sabit donmuş dokulardan iki boyutlu kesitler kullanarak TME'nin ayrıntılı çözünürlüğünü elde etmek için çok sayıda gelişmiş teknoloji tanıtılmıştır. Bu ince kesitlerin elde edilmesi ve analiz edilmesi daha kolay olsa da, bir tümörü güvenilir ve kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için gereken üç boyutlu mimariden yoksundurlar. Bu sınırlamayı ele almak için, tümör lezyonlarının doğal in vivo durumlarında üç boyutlu analizini sağlamak için bir doku montajı ve görüntüleme tekniği geliştirilmiştir. Bu protokol, insan tümör dokusunun tedarikini, numunelerin özel olarak basılmış platformlara monte edilmesini ve fiksasyon sonrası numuneler için boyama prosedürlerini ana hatlarıyla belirtir. Çoğullanmış immünofloresan tekniği olan IBEX (Yinelemeli Ağartma Çokluğu Uzatır), ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılarak tümör, bağışıklık ve stromal hücreler için 15'e kadar belirteç ile üç boyutlu TME'yi karakterize etmek için uyarlanmıştır. 100 μm'ye kadar görüntüleme derinlikleri, optimum doku oryantasyonunu sağlamak için özel baskılı görüntüleme adaptörü ve ticari cam tabanlı çanaklar ile ters çevrilmiş beyaz ışıklı lazer konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bu protokol, IBEX yönteminin çoğullanmış immünofloresan çalışmalarını genişletme potansiyelini vurgulayarak TME bileşiminin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katı tümörler, hücre tiplerinin (malign ve malign olmayan), hücre dışı matris proteinlerinin ve çözünür faktörlerinkarmaşık bir bileşimi ile oldukça değişkendir 1,2. Sonuç olarak, bu oldukça karmaşık, heterojen tümör mikroçevresi (TME), immünoterapi 3,4 gibi tedavilere duyarlılığı belirler. Bu nedenle, hücre tabakası kalınlığında (~ 4 μM) bölümlerde TME'nin karmaşıklığını karakterize etmek için yüksek oranda çoğullanmış immünofloresan 5,6 ve uzamsal transkriptomik 7 gibi teknolojiler uygulanmıştır.

Tek hücre dizileme ve akış sitometrisi 8,9,10 gibi hücre dispersiyon yaklaşımlarının aksine, bu teknikler hücresel karışma hakkında kritik bilgilere katkıda bulunmak için uzamsal ilişkileri korur ve tedavi yanıtının tahmini için potansiyel biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir 11,12,13. Bununla birlikte, tümör lezyonları doğası gereği üç boyutlu (3B) yapılardır ve yukarıda belirtilenler gibi 2B yaklaşımlar, karmaşık hücresel manzarayı yeterince yakalamaz. Hasta kaynaklı tümör organoid kültürlerinin yaygın olarak kullanılmasıyla kanıtlandığı gibi, 3D biyolojinin önemi bu alanda takdir edilmiştir14. Bununla birlikte, organoidler, orijinal in vivo TME'nin hücresel karmaşıklığını korumaz, bu da immünomodülatör ilaçlarla kullanım veya çeşitli TME hücre popülasyonlarının karakterizasyonu için uygulanabilirliği sınırlar.

Seri 2B kesitler üzerinde analizler yapmak ve 3B işleme için görüntüleri hesaplamalı olarak bir araya getirmek mümkün olsa da, bu teknik maliyet açısından engelleyicidir ve yüksek doğrulukla15 gerçekleştirilmesi zordur. 3D dokuları (ör. tümörler) tekrarlanabilir bir şekilde uygun maliyetli bir şekilde karakterize etmek için, preparat ve multipleks immünofloresan boyama/analiz için benzersiz bir yöntem geliştirildi ve primer periton kanseri olan bir hastadan alınan peritoneal tümör lezyonları kullanılarak gösterildi.

İyi bilinen IBEX tekniğinin (Yinelemeli Beyazlatma Çokluğu Uzatır)16,17 bir uyarlamasına dayanan bu protokol, bir doku tutucunun ve görüntüleme adaptörünün 3D baskısını, periton dokusu tedarikini ve montajını, çeşitli tümör ve hücre tipi belirteçlerle çoklu boyama döngülerini ve yüksek çözünürlüklü konfokal 3D görüntülemeyi detaylandırır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, protokol NCT01915225 kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı ile gerçekleştirilmiştir. İnsan dokusu, tanısal laparoskopi sırasında yazılı bilgilendirilmiş onam ile elde edildi. Tüm doku, görünür muayene ile belirlendiği ve son histopatolojik inceleme ile doğrulandığı gibi tümör taşıyordu. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Tüm iş akışının şematik bir gösterimi Şekil 1'de verilmiştir.

1. Baskı platformları, görüntüleme adaptörü ve inkübasyon plakası

  1. Platform ve 9 kuyulu plaka parçaları için dilimleme / 3D baskı / işlem sonrası prosedürler (Şekil 2A-C'de özetlenmiştir)
    1. Dilimleme: Dilimleme yazılımını açın ve tasarım dosyalarını 'a aktarın. STL formatı (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Optimum baskı için modelleri yönlendirin ve destekler ekleyin. Tıbbi sınıf yazıcıyı seçin, şeffaf reçineyi ve 50 μm katman yüksekliğini seçin. Yazdırılabilirliği kontrol edin ve işi yazıcıya gönderin.
    2. 3D baskı: Yazıcının hazır olup olmadığını kontrol edin (doğru reçine kartuşu, tank ve platform yerinde). Yazıcının dokunmatik ekranında, yazdırmayı başlatmak için dilimleyici yazılımından karşıya yüklenen işi seçin. Baskı tamamlandıktan sonra, yazdırılan parçayı platformdan ayırmak için çıkarma aracını kullanın.
    3. İşlem sonrası: %99 izopropil alkol (IPA) ile doldurulmuş parçayı yıkama ünitesinde 15 dakika durulayın. Parçaları yıkama ünitesinden çıkarın ve 5 dakika taze IPA'da bekletin.
    4. Parçayı 60 °C'de 60 dakika kürleyin. Gömme kesiciler kullanarak destekleri çıkarın. Gerekirse ince zımpara kağıdı kullanarak destek izlerini zımparalayın.
  2. Yükseklik ayarlayıcı ve dış kapak için dilimleme/3D baskı/işlem sonrası prosedürler (Şekil 2A-C'de özetlenmiştir)
    1. Dilimleme: Yazdırma yazılımını açın ve tasarım dosyalarını 'a aktarın. STL formatı (Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 4). Modelleri yönlendirin ve malzemeleri atayın. İstediğiniz yazdırma modunu (Yüksek karışım, yüksek hız) seçin ve model ayarlarını finish (Bitti) olarak Mat olarak ayarlayın. Yazdırılabilirliği kontrol edin ve işi yazıcıya gönderin.
    2. 3D baskı: Yazıcının doğru malzemeleri yüklediğinden ve yapı tepsisinin temiz olduğundan emin olun. Yazıcının monitör arayüzünde, yazdırmayı başlatmak için yüklenen işi seçin. Baskı tamamlandıktan sonra, yazdırılan parçayı yapı tepsisinden nazikçe çıkarmak için kazıyıcı aracını kullanın.
    3. İşlem sonrası: Destek malzemesini çıkarmak için yazdırılan parçaları bir su jeti temizleyicisine veya bir çalkalama temizleme sistemine yerleştirin. Gerekirse, cımbız veya pense gibi aletler kullanarak herhangi bir manuel destek kaldırma işlemini gerçekleştirin.
  3. Platform sürgüsünün lazerle kesilmesi (Şekil 2A,C'de gösterilmiştir)
    1. Tasarımın hazırlanması: * işaretini içe aktarın . Vektör yazılımındaki DWG tasarım dosyası (Ek Dosya 5). Vektör kesimi için çizgi renklerini kırmızı (RGB) olarak ayarlayın. İşi lazer kesiciye gönderin.
    2. Lazer kesicinin kurulması: Lazer kesici yazılımını açın ve tasarım dosyasını içe aktarın. Malzeme türünü seçin ve 1/32" kalınlığında akrilik için güç, hız ve çözünürlük ayarlarını yapın. Malzemeyi lazer yatağına yerleştirin, düzgün şekilde hizalandığından emin olun ve lazeri odaklayın.
    3. Lazer kesim: Lazer kesim işlemini başlatın ve malzemenin doğru şekilde kesildiğinden emin olmak için izleyin.

2. Baskılı platformlara doku montajı

  1. Hasat ortamı ve hazırlık masasının hazırlanması
    1. 100 mL DMEM'i (düşük glikoz) Anti-Anti ile destekleyin ve ihtiyaç duyulana kadar (hasat ortamı) 37 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
    2. Ameliyathanede aşağıdaki öğelerle bir "hazırlık masası" kurun: otoklavlanmış 3D baskılı platformlar, 2-0 ipek sütür bağları paketi, ısıtma plakası, 50 mL önceden ısıtılmış hasat ortamı içeren numune kabı, 30 mL önceden ısıtılmış hasat ortamı içeren 15 cm kültür plakası ve her biri 1,5 mL hasat ortamı içeren 4 oyuklu 24 oyuklu bir plaka (hepsini ısıtma plakasına yerleştirin), 1 çift forseps ve 1 çift cerrahi makas.
  2. Doku rezeksiyonu ve montajı
    NOT: Doku, ameliyathaneden temin edilir. Kalınlık ve çap olarak 0.5 mm'den daha az tümör odaklarına sahip periton alanları görsel muayenede tanımlanır (Şekil 2D). Dikkat edilmesi gereken, bir platform hazırlamak için ~ 2cm2 doku (periton) gereklidir.
    1. Tümör taşıyan peritone, altta yatan karın duvarı kas sisteminden ve fasyadan (cerrah tarafından gerçekleştirilir) dikkatlice ayırın. Elde edilen doku tabakalarını ılık hasat ortamı içeren bir numune kabına aktarın ve bir ısıtma plakasına (hazırlık masası) yerleştirin.
    2. Dokuyu, hasat ortamını içeren 15 cm'lik plakadaki platformlara monte edin. Tümör taşıyan dokuyu (mezotelyal tarafı yukarı bakacak şekilde) platformun küçük delik tarafının üzerine dikkatlice örtün ve 2-0 ipek dikişle yerine sabitleyin. Hazırlanan doku platformunu ters olarak (daldırılmış) hasat ortamı içeren 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin (Şekil 2E-G).
      NOT: Platform yüzeyinde kıvrımları önleyecek kadar öğretilen dokuyu monte edin, ancak istenmeyen biyomekanik ve fizyolojik değişikliklere neden olacağından gerilim oluşturmayın.

3. Fiksasyon / boyama / ağartma prosedürü

NOT: 4 μm inceliğinde FFPE veya sabit donmuş bölümlere uyarlanmış orijinal protokolden yapılan değişiklikler Şekil 3'te özetlenmiştir. Tablo 1 , IBEX turları 1-6 için kullanılan antikorların (seyreltmelerle birlikte) bir listesini sağlar.

  1. Fiksasyon
    1. 30 mL soğuk 1x PBS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe 10 mL Fiksatif stok ekleyerek 40 mL fiksasyon tamponu hazırlayın.
    2. Bir çift forseps kullanarak, platformlara monte edilen dokuyu fiksasyon tamponuna aktarın ve 4 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    3. Fiksatifi boşaltın ve 40 mL soğuk 1x PBS ile değiştirin ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  2. Boy -ama
    1. Her oyuğa 1 mL bloke edici tampon (% 1 BSA,% 0.3 Triton-X-100,% 1 Fc Bloğu 0.22 μm şırınga filtresi ile filtrelenmiş 1x PBS'de) ekleyin ve doku platformlarını yerleştirin. Düşük hıza (2 rpm) ayarlanmış bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında en az 30 saat bloke edin.
      NOT: Platformdaki çentiğin ve kuyudaki oluğun aynı hizada olduğundan emin olun. Bu adım zamana duyarlı değildir ve gece boyunca 4 °C'de yapılabilir.
    2. Bir mikrosantrifüj tüpünde 0.8 mL antikor / boya çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. 0.75 mL'yi 9 oyuklu inkübasyon plakasının temiz bir kuyusuna aktarın ve yıkanmış bir platform yerleştirin.
    3. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve düşük hıza (30 rpm) ayarlanmış bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında en az 2 saat inkübe edin.
    4. Platformu 50 mL'lik konik bir tüpte 40 mL 1x PBS ile 4 °C'de 10 dakika yıkayın. Platform artık görüntüleme adaptörüne takılmaya hazırdır.
  3. Beyazlatma
    1. Her boyama ve görüntüleme turunun ardından, ester indirgeyici ajan lityum borohidrür (LiBH4) kullanarak floroforları ağartın. Bu işlem, Alexa Fluor (AF)488, AF647 ve AF750'den gelen floresan sinyallerini ortadan kaldıracak, ancak AF594 ve nükleer boya Hoechst'ten gelmeyecektir.
      DİKKAT: Lityum borhidrür su ile son derece reaktiftir. Yanıcı hidrojen gazları su ile temas ettiğinde açığa çıkar; Kullanılmış lityum borhidrür ve lityum borohidrür ile kontamine olmuş tek kullanımlık malzemelerin tehlikeli atık olarak bertaraf edilmesi gerekir.
    2. Damıtılmış suda (kimyasal bir başlıkta) 5 mL 1.5 mg / mL LiBH4 çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      NOT: LiBH4 solüsyonu, kullanımdan >4 saat önce hazırlandığında indirgeme/ağartma etkinliğini kaybedecektir.
    3. 1 mL LiBH4 solüsyonunu 9 oyuklu inkübasyon plakasının temiz bir kuyusuna aktarın ve yıkanmış platformu oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yerleştirin.
    4. Platformu konik bir tüpte 20 mL 1x PBS'de kısa bir süre yıkayın ve sonraki boyama turlarına geçmeden önce önceki görüntüleme turunda Z telafisi için en yüksek lazer ayarını kullanarak kalan floresan sinyalini kontrol edin.
    5. Bir sonraki antikor inkübasyon adımına geçmeden önce numunenin oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edilmesini tekrarlayın.

4. Görüntüleme prosedürü

  1. Görüntüleme adaptörlerinin/platformlarının montajı
    1. 3,5 cm'lik bir görüntüleme kabının cam tabanının ortasına 0,1 mL 1x PBS ekleyin ve bir kenara koyun. Yükseklik ayar halkasını gevşek bir şekilde saat yönünde dış kapağa vidalayın ve platformu iç plastik tutucuya monte edin (çentik-oluk hizalaması). Platformu kaydırıcı ile sabitleyin.
    2. Monte edilmiş görüntüleme adaptörünü cam alt tabağa yerleştirin ve doku tampona temas edene kadar yükseklik ayar halkasını dikkatlice indirin. Platformu cam alt kısımda döndürmekten kaçının.
    3. Camdan en uygun mesafeye ulaşıldığında, görüntüleme sırasında doku dehidrasyonunu önlemek için dokuya (şimdi alt taraf yukarı) 0.2 mL 1x PBS ekleyin.
  2. Konfokal görüntüleme
    1. Mercek kullanımı için bilgisayar, mikroskop, lazer ve LED ışık kaynağı dahil olmak üzere ters konfokal mikroskobun tüm bileşenlerini açın. Görüntü alma yazılımını başlatın.
    2. Uygun hedefi seçin (ör. 20x veya 40x) ve uygun daldırma ortamını ekleyin. Örneğin, bu çalışmada 20x su hedefi kullanılmıştır; Uzun görüntü çekimleri sırasında kurumayı önlemek için objektife ~200 μL su eklenir.
    3. Monte edilmiş görüntüleme kabını mikroskop tablasındaki numune tutucuya yerleştirin ve numunenin güvenli olduğundan (hareket etmediğinden) emin olun.
      NOT: Birleştirilmiş numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirirken, çentik konumuna dikkat edin ve görüntü hizalamayı kolaylaştırmak için yinelemeli döngüler için aynı konumu kullanın. Art arda turlar için görüntüleme adaptörünü optimum yükseklik ayarında tutmak önemlidir.
    4. XY kontrolünü kullanarak numuneyi ortalayın ve objektifi kapak camına getirin. Göz merceğinden bakarak ve Hoechst sinyalini referans olarak kullanarak, dokuya ince bir odaklanma elde etmek için objektifi hareket ettirin.
    5. Uygun lazer çizgilerini seçin veya WLL'yi doku örneğini boyamak için kullanılan floroforların uyarma ve emisyon spektrumlarına göre ayarlayın. Ayarları ayarlayarak kanallar arasındaki örtüşmeyi ortadan kaldırın ve floroforlar benzer uyarma spektrumlarına sahipse diziler ekleyin.
    6. Aşağıdaki görüntü alma parametrelerini seçin: tarama hızı 600 Hz, XY çözünürlüğü 1024 x 1024, 3 satırlı ortalamalar ve çift yönlü tarama.
    7. Aşağıdaki Z yığını parametrelerini seçin: (1) kullanılan hedefe göre optimize edilmiş Z adım boyutunu kullanın, (2) yığının başlangıcını ve sonunu tanımlayın, (3) yığın boyunca eşit parlaklık elde etmek için Z telafisi parametrelerini ayarlayın ve (4) bir ortalamaya sahip 1 döşemeli bir test yığını elde edin.
    8. Görüntülenecek bölgeyi tanımlayın ve yüksek çözünürlüklü bir döşeme-Z yığını elde edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periton, karın duvarının yüzeyini kaplayan ve karın organlarının yüzeyleriyle bitişik olan 1 mm'den daha az kalınlıkta zarlı bir yapıdır. Yüzey mezotelyum ve yağ hücreleri, lenfositler, makrofajlar ve fibroblastların yanı sıra kan ve lenfatik damarlar ile serpiştirilmiş alttaki bağ dokusundan oluşur. Peritoneal maligniteler en sık abdominal tümör metastazlarından kaynaklanır (ör., yumurtalık kanseri veya mide kanseri)18 veya daha az sıklıkla, peritonun primer tümörleri olabilir (ör., mezotelyoma)19. Bu genellikle küçük (<1 cm) tümör lezyonları oldukça karmaşıktır, ancak belirtilen teknik kullanılarak 3D karakterizasyona uygundur. Bir platforma monte edilmiş numunenin tamamını görüntülemek için maksimum beş konfokal bölümden oluşan bir projeksiyon kullanılır (Şekil 4, sol üst köşede iç kısım). IBEX'in ilk turu için üç birincil konjuge antikor (AF488-CD44, AF594-CD45 ve AF647-Podoplanin) nükleer boya Hoechst ile birlikte kullanıldı (IBEX1, Şekil 4). Tümör lezyonları, CD44 ve Podoplanin için çift pozitif olan ve papiller mezotelyoma karakteristiği olan çekirdek düzenlemesini gösteren rozet benzeri yapılarla belirginleşir.

Tümör hücreleri, hem anti-Podoplanin hem de anti-CD44, anti-Podoplanin yoluyla lenfatik damarların saptanması ve CD44 antikorunun bağışıklık hücrelerinin alt kümelerine bağlanmasıyla kanıtlandığı gibi, tümör morfolojisi ve iki antikor kullanılarak tanımlandı. Daha küçük ilgi alanları (ROI'ler) daha sonra 3D projeksiyonları işlemek için optimize edilmiş Z adımı boyutlarında daha yüksek çözünürlükte bir döşeme tarama formatı kullanılarak yakalanır (Şekil 5A). Platformlar yinelemeli boyama prosedürlerinden geçirildi ve aynı ROI'ler IBEX döngüleri 1-6'da görüntülendi. Tümör (sarı kutu) ve tümör-üçüncül lenfoid yapı (TLS) arayüzleri (mavi kutu) için temsili görüntüler Şekil 5B-M'de birleştirilmiştir.

TLS'nin varlığı ve CD3 pozitif hücrelerin yoğunluğu, önemli immün hücre infiltrasyonunu20 ve muhtemelen immünomodülatör ilaçlara21 yanıtı gösterir. Dikkat çekici bir şekilde, TLS ve tümör lezyonlarının büyük kısmı, Şekil 6'daki farklı optik bölümlerin yığın projeksiyonlarının karşılaştırılmasında gösterildiği gibi, dokunun farklı Z-derinliklerinde bulunur ve 3D görüntülemenin faydalarını ve 2D görüntüleme 3D yapılara uygulandığında potansiyel gözden kaçan biyolojiyi vurgular. Bu lezyonların 3 boyutlu karakteri, Şekil 5'teki tek tek lezyonların hacim görüntülerini gösteren film dosyalarında (Film 1-12) daha belirgin hale gelir.

figure-results-1
Şekil 1: Periton tümörlerinin 3D baskıdan 3D görüntülemesine kadar iş akışı. Protokol, tümör taşıyan periton dokusundan 3D çoğullanmış görüntüler hazırlamak için beş adımdan oluşan bir diziden oluşur. (1) Doku alıcı platformların, görüntüleme adaptörü parçalarının ve inkübasyon plakasının yazdırılması. (2) Doku temini ve montaj işlemleri. (3) Paraformaldehit ile fiksasyon. (4) IBEX boyama ve görüntüleme döngüleri. (5) Görüntüleme yazılımı kullanarak 3D rekonstrüksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: 3D görüntüleme için doku arayüzlü donanım bileşenleri. (A) Görüntüleme adaptörü içindeki platform montajının şematik diyagramı. (B) 9 oyuklu bir inkübasyon plakası. (C) Montajlı görüntü adaptörü bileşenlerinin fotoğrafları. (D) Tanısal laparoskopi sırasında gözlenen mezotelyoma taşıyan periton. (E) Dokunun platforma monte edilmesi. (F,G) Platformlara monte edilmiş tümör taşıyan periton. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: IBEX döngülerinin zaman çizelgesi şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: IBEX1 paneli ile inkübasyon sonrası platforma genel bakış. IBEX1 paneli (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 ve AF647-Podoplanin) ile inkübasyonun ardından tüm platformun maksimum projeksiyonu. Kesikli daire tümörü vurgular. Ek: Görüntüleme platformuna monte edilmiş tümör taşıyan peritonun fotoğrafı. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Belirli platform bölgelerinin yüksek çözünürlüklü immünofloresan görüntüleri. (A) IBEX1 paneli (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 ve AF647-Podoplanin) ile inkübasyonun ardından elde edilen birleştirilmiş 56 döşemeli Z-yığını görüntüsünün maksimum projeksiyonu. Sarı dikdörtgen: panellerde gösterilen tümör lezyonu (B-G). Mavi dikdörtgen: (HM) 'de gösterilen tümör-üçüncül lenfoid yapı arayüzü. (B-G) Hacim oluşturmada IBEX panel 1-6 ile tek bir tümör lezyonu. (B) IBEX1, yeşil: CD44, kırmızı: CD45, camgöbeği: Podoplanin. (C) IBEX2, yeşil: CD20, kırmızı: F-aktin, camgöbeği: CD3. (D) IBEX3, yeşil: CD8, kırmızı: CD4, camgöbeği: panCK. (E) IBEX4, yeşil: CD31, camgöbeği: CD68. (F) IBEX5, yeşil: CD206, camgöbeği: Calretinin. (G) IBEX6, yeşil: Vimentin, kırmızı: HLADR. (H-M) Hacim oluşturmada IBEX panel 1-6 ile bir ayrı tümör-üçüncül lenfoid yapı arayüzü. (H) IBEX1, yeşil: CD44, kırmızı: CD45, camgöbeği: Podoplanin. (I) IBEX2, yeşil: CD20, kırmızı: F-aktin, camgöbeği: CD3. (J) IBEX3, yeşil: CD4, kırmızı: panCK, camgöbeği: CD8. (K) IBEX4, yeşil: CD31, kırmızı: SMA, camgöbeği: CD68. (L) IBEX5, yeşil: CD206, camgöbeği: Calretinin. (M) IBEX6, yeşil: HLADR, camgöbeği: Vimentin. Tüm paneller, mavi: Hoechst. Ölçek çubukları: (A, 1 mm); (BM, 250 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Simüle edilmiş 2D görüntüleme. Sınırlı (10 optik bölüm) ve tam yığın (102 optik bölüm) projeksiyonların karşılaştırılması, 2D simülasyonda doku bağlamı kaybını doğrular. (A) 30-40 (10 μm) kesitlerin maksimum projeksiyonu. (B) 85-95 (10 μm) kesitlerinin maksimum projeksiyonu. (C) Bölüm 1-102'nin maksimum projeksiyonu (~100 μm). Tüm paneller, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-phalloidin). Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bireysel IBEX panelleri için kullanılan antikorlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 1: IBEX panel 1 ile tek tek lezyonun animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD44, kırmızı: CD45, camgöbeği: Podoplanin). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 2: IBEX panel 2 ile bireysel lezyonun animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD20, kırmızı: F-aktin, camgöbeği: CD3). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 3: IBEX panel 3 ile bireysel lezyonun animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD8, kırmızı: CD4, camgöbeği: panCK). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 4: IBEX panel 4 ile bireysel lezyonun animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD31, camgöbeği: CD68). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 5: IBEX panel 5 ile tek tek lezyonun animasyonlu hacim görüntüsü (mavi: Hoechst, yeşil: CD206, camgöbeği: Calretinin). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 6: IBEX panel 6 ile bireysel lezyonun animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: Vimentin, kırmızı: HLADR). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 7: IBEX panel 1 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD44, kırmızı: CD45, camgöbeği: Podoplanin). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 8: IBEX panel 2 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD20, kırmızı: F-aktin, camgöbeği: CD3). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 9: IBEX panel 3 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD8, kırmızı: CD4, camgöbeği: panCK). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 10: IBEX panel 4 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD31, kırmızı: SMA, camgöbeği: CD68). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 11: IBEX panel 5 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: CD206, camgöbeği: Calretinin). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 12: IBEX panel 6 ile üçüncül lenfoid yapı-lezyon arayüzünün animasyonlu hacim sunumu (mavi: Hoechst, yeşil: Vimentin, kırmızı: HLADR). Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: İnkübasyon plakası için dosyayı yazdırın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: 36 ayrı platform için dosyayı yazdırın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Yükseklik ayar halkası için file yazdırın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Dış kapak için dosyayı yazdırın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: Kaydırıcı için lazer kesim dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan görüntüleme için mevcut multipleks teknikler ince kesitlerle sınırlıdır ve 3D bağlam sağlamaz. Bu çalışma, IBEX görüntüleme yöntemini16,17 özel olarak tasarlanmış platformlara monte edilmiş sağlam tümörlere uygulamak için bir protokolü açıklamaktadır. Peritoneal tümör lezyonları, dünya çapında çoğu üçüncül sevk merkezinde gerçekleştirilen standart sitoredüksiyon cerrahisinin bir parçası olarak çevredeki normal periton ile birlikte alınan çoklu, ideal büyüklükte tümör birikintileri ile başvuran hastalar olarak tekniği vurgulamak için seçilmiştir 22,23. Bununla birlikte, protokol, daha önce tarif edildiği gibi tümör dilimleri kullanılarak parankimal metastazlara ve fare model tümörlerine uygulanabilir24,25. Ayrıca, platformlar üzerindeki montaj halkasının çapı, daha geniş alanlar doku sarkmasına ve uzun görüntüleme sürelerine eğilimli olmasına rağmen, deneysel/doku ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Doku kaynağı ve boyutu ne olursa olsun, optimum kaliteyi sağlamak için tedarik ve koruma arasındaki süre minimum düzeyde tutulmalıdır26. Ameliyathanede bir hazırlık masasının kurulması, hastalar söz konusu olduğunda hızlı işlemeyi garanti eder. Deneyler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için dokunun tedarikinden fiksasyonuna kadar geçen süre not edilmelidir.

Doku örnekleri, sağlam doku platforma yapıştırılarak tüm montajlar, yani fiksasyon ve görüntüleme ile beyazlatma aşamaları olarak IBEX protokolü aracılığıyla alınır. Bu, yinelemeli boyama/görüntüleme/ağartma döngüleri yoluyla numunenin korunmasını garanti eder, çünkü yarı kalıcı kesit camı arayüzü yoktur ve her ikisi de doku kaybına yol açabilecek şekilde dokudan tekrar tekrar bir kapak camı yerleştirmeye/çıkarmaya gerek yoktur. Reaktiflerden tasarruf etmek için, özel olarak tasarlanmış 9 oyuklu plaka, minimum "ölü hacim" ile platformun optimum uyumunu garanti eder. Boyama için kullanılan tüm antikorlar birincil konjuge antikorlardır ve kullanılan tüm florofor konjugatları (Hoechst boyası hariç), mükemmel parlaklıkları için seçilen Alexa Fluor boyalarıdır27. Diğer floroforlar Antikor panelleri, IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/) kullanan uluslararası bir bilim insanı grubundan veri setleri, protokoller ve geri bildirim toplayan açık, küresel bir depo olan IBEX görüntüleme topluluğundan depolanan verilere göre tasarlanmıştır. Antikor panellerinin sırası dikkatlice seçildi. Genel olarak, düşük bolluğa sahip hedefler daha önceki döngülere yerleştirildi. IBEX döngüsü 1 (CD45, CD44 ve Podoplanin) bir istisnadır, çünkü bu üç belirteç ilk boyama turunda tümör lezyonlarını tanımlamak için kullanılmıştır.

Antikor panelleri, konfokal bir mikroskop kullanarak dokuyu daha derin görüntülemek için gerekli olan yüksek lazer yoğunluğu ayarlarında kanal karışmasını azaltmak için nispeten küçüktür. Paneli 2 ila 3 antikordan genişletmek için mümkün olan her yerde AF750 konjugatları dahil edildi. Dikkat çekici bir şekilde, ticari olarak temin edilebilen çok fazla AF750 konjugatı yoktur ve bu kanal için hedefin oldukça bol olması gerektiği gerçeği, bu floroforun kullanımını sınırlar. Bir örnek, bu protokolde kullanılan AF750 konjuge anti-SMA antikorudur. Bu, AF488 veya AF594 ile güvenilir bir şekilde konjuge olarak çalışan bir klon olmasına rağmen, AF750 ile konjuge edilen bu antikor için sinyal yoğunluğu önemli ölçüde daha düşüktür, bu da yüksek kaliteli Z-yığınları oluşturmayı zorlaştırır.

Oda sıcaklığında 3 saatlik antikor inkübasyonları, orijinal protokole kıyasla kısadır ve büyük olasılıkla periton dokusu örneklerinde daha düşük hücre yoğunluğunu yansıtır. Buna karşılık, 60 dakika boyunca 1.5 mg / mL lityum borohidrür ile ağartma aşaması daha katıydı. Bu parametreler ampirik olarak belirlendi ve kullanılan doku ve antikorlara göre değişebilir. Reaktif ağartma solüsyonundaki inkübasyon nedeniyle, dokuda küçük hava kabarcıklarının sıkışabileceği unutulmamalıdır. Prosedürün görüntüleme aşaması sırasında bu durum belirginleştiğinde, 9 oyuklu inkübasyon plakasındaki platform bir emme kabı kullanılarak vakuma maruz bırakılarak numunelerin gazı alındı. Genellikle IBEX çalışmalarında uygulanan basit ITK numune kayıtları, görüntü analiz yazılımına yapılan aşırı veri girişi nedeniyle gerçekleştirilemedi. Bununla birlikte, aynı hücre popülasyonları, bireysel veri kümelerini karşılaştırarak kolayca tanımlanabilir. Genel olarak, yinelemeli döngüler, bir döngü bir günde tamamlanabilecek şekilde zamanlandı ve görüntüleme tüm döngünün çoğunu (~ 8 saat) kapladı.

Tekniğin bahsedilmeyi hak eden sınırlamaları vardır. Protokolün zaman gereksinimi, bu yöntemin geniş çapta benimsenmesini olası kılmaz, ancak belirli durumlarda daha ziyade benimsenmesini sağlar. Bu protokolün, tedavi öncesi ve sonrası tümör bağışıklık mikroçevresindeki değişiklikleri karakterize etmek (örneğin, kanser immünoterapisi için bispesifik antikorlar) veya genel tedavi sonuçlarını tahmin etmek için en iyi şekilde kullanılmasını öngörüyoruz. Bu protokol 3D karakterizasyon sunsa da, karmaşık hücre popülasyonları da dahil olmak üzere bir tümörü etkili bir şekilde tanımlamak için ne kadar alanın sorgulanması gerektiği bilinmemektedir28. Bazı merkezlerde taze insan dokusuna erişim de zor olabilir, ancak bu protokolün hayvan modelleri için de geçerli olduğunu öngörüyoruz29.

Bu protokolün uygulamaları, birden fazla katı tümörde TME bileşimini analiz eden temel araştırmalardan, klinik çalışmalara kayıtlı hastalar için doku öncesi / sonrası biyopsilere kadar çeşitlidir. Tek bir hücre tabakası kalınlığındaki doku bölümünden elde edilebilecek veriler çok büyük olmasına rağmen, 3D biyoloji kolayca göz ardı edilebilir. 3D görüntülemeyi, diğer mekansal biyoloji tekniklerine ek olarak görüyoruz ve muhtemelen sonraki analizler için 2D bölümlerin seçimine yardımcı oluyoruz. Ek olarak, açıklanan doku montajı ve görüntüleme kurulumunu kullanarak birkaç saat boyunca canlı bir görüntüleme bileşenini dahil etmeye yönelik bir protokol aktif olarak devam etmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma, Ronald Germain liderliğindeki NIAID ve NCI arasında bir araştırma işbirliği olan CAT-I tarafından da kısmen desteklenmiştir. Andrea Radtke'ye coşkulu ve işbirlikçi çabaları için şükranlarımızı sunarız. Uzmanlığı bu çalışmaya büyük fayda sağladı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor Plus 750 PhalloidinInvitrogenA30105F-aktin boya
Alexa Fluor 488 anti-insan CD206 (MMR) AntikoruBioLegend321114antikoru
Alexa Fluor 488 anti-insan CD31 AntikoruBioLegend303110antikoru
Alexa Fluor 488 anti-insan CD4 AntikoruBioLegend300519antikoru
Alexa Fluor 488 anti-insan HLA-DR AntikoruBioLegend307656antikoru
Alexa Fluor 488 anti-fare/insan CD44 antikoruBioLegend103016antikoru
Alexa Fluor 594 anti-insan CD45 AntikoruBioLegend304060antikoru
Alexa Fluor 647 Anti-Kalretinin antikoru [EP1798]Abcamab214244antikoru
Alexa Fluor 647 anti-insan CD3 AntikoruBioLegend300416antikoru
Alexa Fluor 647 anti-insan CD8 AntikoruBioLegend344726antikoru
Alexa Fluor 647 anti-insan Podoplanin AntikoruBioLegend337007antikoru
Alexa Fluor 647 anti-Vimentin AntikoruBioLegend677807antikoru
Alexa Fluor 647 CD68 Antikoru (KP1)Santa Cruzsc-20060AF647antikoru
Alexa Fluor 750 Sitokeratin, pan Antikoru (AE-1 / AE-3)NovusNBP2-33200AF750antikoru
Alexa Fluor 750 İnsan alfa-Düz Kas Aktin AntikoruR& DIC1420Santikoru
Alexa Fluor 488 CD20 Monoklonal Antikor (L26) eBioscienceThermo Fisher53-0202-82antikoru
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240096takviyesi hasat ortamı
BioMed Berrak Reçine (Form 3)Platform + inkübasyon plakası için kullanılanFormLabsRS-F2-BMCL-01
BSASigmaA7906-500gEngelleme Çözümü bileşeni
kesmek için kullanılandökme akrilik 1/32 "kalınlığında
CleanStation DT3 StratasysDT3yükseklik ayarlayıcı ve dış kapak
için son işlem Konteyner, Numune McKesson870203doku transferinin çalışma masasından hazırlık masasına
CorelDraw Lazer kesim için vektör tabanlı tasarım dosyasını hazırlamak içinCorelDRAW
CytofixBD Bioscience554655
Sabitleyici Çanak 15 cmFalcon353025çanağı
Çanak 35 mm No. 1.5 Lamel 14 mm Cam Çapı KaplamasızMatekP35G-1.5-14-Cgörüntüleme kabı
DMEM (glikozsuz)Gibco11966025hasat ortamı
Fc BlockBD Bioscience564220engelleme çözümü bileşeni
Form 3B+FormlabsPlatform + inkübasyon plakası için kullanılanForm 3B+
Form CureFormlabsFH-CU-01platform + inkübasyon plakası için işlem sonrası
Form WashFormlabsFH-WA-01platform + inkübasyon plakası
GrabCAD PrintGrabCADGrabCAD PrintStratasys yazıcılar için model hazırlamak için Yazılım
Hoechst 33342 10 mg/mLBiotium40046nükleer boya
J826 Prime 3D YazıcıStratasysJ826yazıcı yükseklik ayarlayıcı ve dış kapak için kullanılır
LAS XLeicaLAS XConfocal yazılımı
Lazer kesim sistemi Üniversal Lazer SistemleriULS PLS6.150DCO2 Kaydırıcı için kullanılan lazer kesim
Lityum BorhidritSTREM Chemicals93-0397ağartma kimyasalı
PBS, pH 7.4Gibco10010023baz Yıkama, blokaj, boyama için
tampon PreFormFormLabsFormlab yazıcılar için modeller hazırlamak içinPreForm
İpek sütürler  2-0 EthiconA305. O35platforma doku yapıştırma
Stellaris 8 WLL konfokal mikroskopLeicaSTELLARIS 8Konfokal Görüntüleme 
Şırınga filtrefiltresi ab çözeltisi
Triton X-100American BioAB02025-00100geçirgenleştirici reaktif, bloke edici çözelti bileşeni
Vero ContactClearStratasysCTT610, yükseklikayarlayıcı ve dış kapak için kullanılan
Isıtma Tepsisi YayıABDST-1220ortamı ve dokuyu sıcak tutar
Damıtılmış suLiBH4 için Gibco15230-170seyreltici
reçinesiKaydırıcı malzeme Yazılımı Montaj sırasında kullanılan yazıcıiçin son işlem Yazılımı4 KG reçine

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  2. Li, Z., Li, J., Bai, X., Huang, X., Wang, Q. Tumor microenvironment as a complex milieu driving cancer progression: A mini-review. Clin Transl Oncol. , (2024).
  3. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 14 (12), 717-734 (2017).
  4. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. Int J Mol Sci. 20 (4), 840(2019).
  5. Sheng, W., et al. Multiplex immunofluorescence: A powerful tool in cancer immunotherapy. Int J Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  6. Bollhagen, A., Bodenmiller, B. Highly multiplexed tissue imaging in precision oncology and translational cancer research. Cancer Discov. 14 (11), 2071-2088 (2024).
  7. Jin, Y., et al. Advances in spatial transcriptomics and its applications in cancer research. Mol Cancer. 23 (1), 129(2024).
  8. Kashyap, A., et al. Quantification of tumor heterogeneity: From data acquisition to metric generation. Trends Biotechnol. 40 (6), 647-676 (2022).
  9. Chang, Q., Hedley, D. Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology. Methods. 57 (3), 359-367 (2012).
  10. Zhang, L., et al. Single-cell analyses inform mechanisms of myeloid-targeted therapies in colon cancer. Cell. 181 (2), 442-459.e29 (2020).
  11. Wang, X. Q., et al. Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer. Nature. 621 (7980), 868-876 (2023).
  12. Maestri, E., et al. Spatial proximity of tumor-immune interactions predicts patient outcome in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 79 (4), 768-779 (2024).
  13. Wang, Q., et al. Role of tumor microenvironment in cancer progression and therapeutic strategy. Cancer Med. 12 (10), 11149-11165 (2023).
  14. Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
  15. Lin, J. R., et al. Multiplexed 3d atlas of state transitions and immune interaction in colorectal cancer. Cell. 186 (2), 363-381.e19 (2023).
  16. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  17. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  18. Van Baal, J. O., et al. The histophysiology and pathophysiology of the peritoneum. Tissue Cell. 49 (1), 95-105 (2017).
  19. Bridda, A., Padoan, I., Mencarelli, R., Frego, M. Peritoneal mesothelioma: A review. MedGenMed. 9 (2), 32(2007).
  20. Demuytere, J., Ernst, S., Van Ovost, J., Cosyns, S., Ceelen, W. The tumor immune microenvironment in peritoneal carcinomatosis. Int Rev Cell Mol Biol. 371, 63-95 (2022).
  21. Wang, Q., et al. Heterogeneity of tertiary lymphoid structures predicts the response to neoadjuvant therapy and immune microenvironment characteristics in triple-negative breast cancer. Br J Cancer. , (2024).
  22. Kepenekian, V., et al. Peritoneal mesothelioma: Systematic review of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) protocol outcomes. Indian J Surg Oncol. 14 (Suppl 1), 39-59 (2023).
  23. Mcquade, C., Renton, M., Chouhan, A., Macdermott, R., O'brien, C. Review of imaging peritoneal disease and treatment. Can Assoc Radiol J. , (2024).
  24. Kenerson, H. L., et al. Tumor slice culture as a biologic surrogate of human cancer. Ann Transl Med. 8 (4), 114(2020).
  25. Arrizabalaga, L., et al. Tumor slice culture system for ex vivo immunotherapy studies. Methods Cell Biol. 189, 55-69 (2024).
  26. Neumeister, V. M., et al. Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst. 104 (23), 1815-1824 (2012).
  27. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes: A series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), 1179-1188 (1999).
  28. Rajaram, S., et al. Sampling strategies to capture single-cell heterogeneity. Nat Methods. 14 (10), 967-970 (2017).
  29. Bella, A., et al. Mouse models of peritoneal carcinomatosis to develop clinical applications. Cancers (Basel). 13 (5), 963(2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tumor MicroenvironmentMultiplex ImmunofluorescenceThree Dimensional ImagingIterative BleachingIBEX MethodConfocal MicroscopyImmune Cell InfiltrationTumor Lesion AnalysisTertiary Lymphoid StructuresTissue Mounting

İlgili makaleler