Bu protokol, her bir gen nakavtının ölüm düzenleyici etkisini ölçmek için MEDUSA analitik yönteminin nasıl kullanılacağını açıklar. Hassasiyeti optimize eden deneysel koşulların belirlenmesine ilişkin talimatlar ve analizin gerçekleştirilmesine ilişkin adım adım bir eğitim içerir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kemo-genetik Profilleme Verilerinde Ölüm Düzenleyici Genlerin Tanımlanması için MEDUSA
Bu makalede
Özet
Özet
Kazanç veya fonksiyon kaybı genetik bozulmalarının sistematik olarak taranması, esasen herhangi bir hücresel ilgilenilen süreç için genetik bağımlılıkları ve düzenleme mekanizmalarını karakterize etmek için kullanılabilir. Bu deneyler tipik olarak, tek gen bozulmalarından oluşan bir havuzdan profil oluşturmayı ve her bir genetik bozulmanın göreceli hücre uygunluğunu nasıl etkilediğini içerir. Genellikle kemo-genetik profilleme olarak adlandırılan ilaç etkinliği çalışmaları bağlamında uygulandığında, bu yöntemler ilaç etki mekanizmalarını belirlemede etkili olmalıdır. Ne yazık ki, kondisyon temelli kemo-genetik profilleme çalışmaları, bir ilaç yanıtının tüm bileşenlerini tanımlamada etkisizdir. Örneğin, bu çalışmalar genellikle hangi genlerin ilaca bağlı hücre ölümünü düzenlediğini belirlemede başarısız olur. Proliferasyon hızı değişiminin kafa karıştırıcı etkileri, büyüme ve ölüm arasındaki ilaca bağlı koordinasyondaki varyasyon ve bazı durumlarda DNA'yı canlı ve ölü hücrelerden ayıramama dahil olmak üzere, fitness temelli ekranlarda ölüm düzenlemesinin gizlenmesine katkıda bulunan çeşitli sorunlar vardır. MEDUSA, konvansiyonel kemo-genetik profilleme verilerinde ölüm düzenleyici genleri tanımlamak için analitik bir yöntemdir. Zindeliğin kendisini puanlamak yerine, gözlemlenen bir fitness profili oluşturan büyüme ve ölüm oranlarını tahmin etmek için hesaplamalı simülasyonlar kullanarak çalışır. Yöntemin etkili kullanımı, ilaç dozu, başlangıç popülasyon büyüklüğü ve testin uzunluğu dahil olmak üzere deneysel koşulların optimal şekilde adlandırılmasına bağlıdır. Bu makale, MEDUSA tabanlı analiz için bir kemo-genetik profilleme çalışmasının nasıl kurulacağını açıklayacak ve kemo-genetik profilleme verilerindeki ölüm oranlarını ölçmek için yöntemin nasıl kullanılacağını göstereceğiz.
Giriş
Kemo-genetik profillemede, her bir genin belirli bir ilaç yanıtınakatkısını anlamak için sistematik genetik bozulmalar kullanılır 1,2,3. Bu deneyler değerlidir ve ilacın bağlanma hedefi ve ilaç akış/akış mekanizmaları dahil olmak üzere ilaç yanıtları hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, bu deneyler tipik olarak tüm genleri aynı anda değerlendiren bir havuzda gerçekleştirildiğinden, kemo-genetik profilleme verilerinden mekanik içgörüler üretmek zor olabilir.
İlaca bağlı hücre ölümü için kon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre ölümünü indüklemek için ilaç dozunun optimizasyonu
NOT: Aşağıdaki protokol, FLICK testi 7,8 kullanılarak hücre hattı, ilaç ve dozun bir kombinasyonunu optimize etmek içindir. Bu protokol için örnek veriler, U2OS hücrelerinde 5 μM etopositin optimizasyonunu ve taranmasını açıklar, ancak aynı optimizasyon adımları, istenen diğer herhangi bir hücre hattı ve ilaç / doz kombinasyonuna uygulanabilir. Bu protokol ölü hücrelerin toplanmasını veya analiz edilmesini gerektirmez. Bu protokol, ölü hücrelerin uzaklaştırılması şartıyla süs....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolü kullanarak, U2OS hücrelerinde etoposid kaynaklı ölümün genetik bağımlılıklarını araştırdık. Etoposid, yaygın olarak kullanılan DNA'ya zarar veren bir kemoterapidir15. Bu kemo-genetik profilleme deneyi, Cas9'da U2OS hücreleri5'i eksprese eden GeCKOv2 kütüphanesi16 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu tür deneylerde, gen fonksiyonu tipik olarak, ilaçla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen popülasyonları karşılaştırırken, belirli bir nakavt klonu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde, genetik bozulmaların ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını nasıl değiştirdiğini puanlamak için kemo-genetik profilleme verilerini ölçmek için MEDUSA analitik yönteminin kullanımını açıklıyoruz. Bir kemo-genetik profilleme deneyinin birincil çıktısı, oranlarla değil, popülasyon büyüklüğü ile ilgili olduğundan, altta yatan oranlar simülasyonlar kullanılarak çıkarılır. Bu nedenle, yöntemdeki kritik adımlar, tedavi edilmemiş hücre proliferasyon hızını, ilaca bağlı ölüm başlang.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Lee Lab'ın geçmişteki ve şimdiki tüm üyelerine, laboratuvarımızın ilaç yanıtlarını değerlendirme konusundaki bakış açısına katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (U01CA265709, R21CA294000 ve R35GM152194'ten MJL'ye ve F31CA268847'dan MEH'ye) MJL ve MEH'nin finansmanı ile desteklenmiştir ve MJL'yi Jayne Koskinas Ted Giovanis Vakfı'ndan finanse etmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100mm Fisherbrand TC Yemekleri | Fisher Scientific | FB012924 | Hücreleri büyütmek ve popülasyon büyüklüğünü optimize etmek için |
| 150mm Fisherbrand TC Yemekleri | Fisher Scientific | FB012925 | Hücreleri büyütmek ve popülasyon boyutunu optimize etmek için |
| DESeq2 | R Paketi | v1.44.0 | Katlama değişimi DMEM'i hesaplamak için |
| Corning | 10017CV | Tohumlama ve ilaçlama için hücreler | |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için |
| Fisherbrand 96-Kuyulu, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, U-Şekilli Tabanlı Mikroplaka | Fisher Scientific | FB012932 | Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için (pin plakası) |
| Greiner Bio-One HÜCRE YILDIZI & mu; Şeffaf 96 oyuklu, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, Düz Tabanlı Mikroplaka | Greiner | 655090 | Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için |
| MATLAB | Mathworks | R2024a | FLICK, GRADE ve MEDUSA gerçekleştirmek için Mikroplaka |
| floresan okuyucu | Tecan | Spark | Ölü hücre ölçümleri için |
| Sytox Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | Ölü hücre ölçümleri için |
| TKOV3 CRISPR kütüphanesi | Addgene | 125517 | CRISPR ekranı gerçekleştirmek için |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | Hücreleri geçirgen hale getirmek için |
| Tripan mavisi | Corning | MT25900CI | Canlı/ölü hücreleri ölçmek için |
Kaynaklar
- Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
- Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
- Colic, M., Hart, T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
