Bu protokol, obstrüktif nefropatide doku fibrozunun ilerlemesini incelemek için farelerde tek taraflı üreter tıkanıklığını (UUO) indüklemek için bir yöntemi tanımlar. Cerrahi prosedürleri, ameliyat sonrası bakımı ve fibroz değerlendirmesi için yöntemleri içerir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Böbrek İnterstisyel Fibrozisinin Araştırılmasında Tek Taraflı Üreter Obstrüksiyon Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Böbrek fibrozisi, ilerleyici kronik böbrek hastalığının (KBH) nihai patolojik sonucudur. Tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) modeli, böbrek interstisyel fibrozisinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları aydınlatmak ve potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu model, farelerde, nispeten basit ve gerçekleştirilmesi kolay bir prosedür olan tek taraflı bir üreterin cerrahi ligasyonu yoluyla kurulur. Bununla birlikte, UUO fare modelinin, fare suşu, yaş, cinsiyet, anestezi tipi, ameliyat süresi, işlem sırasındaki vücut ısısı, operatörün cerrahi becerileri, beslenme koşulları ve farelerin genel sağlık durumu gibi faktörlerden etkilenen önemli değişkenlik ve tutarsızlık sergilediği bilinmektedir. Cerrahi tekniklerdeki, sütür yerleştirilmesindeki ve tıkanıklık süresindeki farklılıklar sonuçlardaki değişkenliğe katkıda bulunur. Ek olarak, tıkalı böbreklerin tutarsız örneklemesi, böbrek fibrozunun değerlendirilmesinde değişkenliği daha da artırır. Bu çalışma, UUO fare modelini geliştirme ve interstisyel fibrozu değerlendirme sürecini özetlemekte, modelin öngörülemezliğine katkıda bulunan teknik zorlukları tartışmakta ve potansiyel çözümler önermektedir. Bu içgörüler, böbrek fibrozunu araştırmak için daha standart ve evrensel olarak uygulanabilir bir yaklaşım oluşturmayı amaçlamaktadır.
Giriş
Kronik böbrek hastalığı (KBH) küresel nüfusun %10'undan fazlasını etkilemektedir ve prevalansı artmaktadır1. Konjenital anatomik anomaliler, nefrolitiyazis, prostat hiperplazisi ve mesane tümörleri dahil olmak üzere çeşitli idrar yolu rahatsızlıkları üreter tıkanıklığına yol açabilir². Sonuç olarak, tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) fare modeli, böbrek interstisyel fibrozunun yeni mekanizmalarını tanımlamak, hastalığın ilerlemesini anlamak ve potansiyel tedavi stratejilerini değerlendirmek için önemli bir araçtır. Miyofibroblastların, (myo)fibroblast alt kümelerinin, tübüler hücre metabolizmasının ve hücre döngüsü durmasının, kısmi epitelyal-mezenkimal geçişin ve diğer ilgili süreçlerin kökenini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır 3,4,5,6,7,8.
UUO'nun neden olduğu böbrek interstisyel fibrozuna ek olarak, böbrek interstisyel fibrozun yaygın olarak kullanılan diğer kemirgen modelleri arasında aristovolkanik asit, folik asit ve adenin kullananlar gibi toksin kaynaklı modellerin yanı sıra 5/6 nefrektomi ve iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) gibi cerrahi olarak indüklenen modeller bulunur. UUO modeli, alternatif böbrek fibrozu modellerine göre çeşitli avantajlar sunar. Örneğin, toksine bağlı böbrek fibrozu nispeten uzun bir modelleme süresi (yaklaşık 1-2 ay) gerektirir ve diğer organlar üzerindeki toksik yan etkileri fibroz mekanizmalarının araştırılmasını zorlaştırabilir 9,10,11. 5/6 nefrektomi gibi cerrahi olarak indüklenen modeller, önemli böbrek kanamasına ve enfeksiyona yol açarak ameliyat sonrası mortalite riskini artırabilir. Ek olarak, indüklenmiş interstisyel fibrozun kapsamı, rezeke edilen böbrek dokusunun hacmi ile doğrudan ilişkilidir, bu da her farede aynı derecede fibrozu tutarlı bir şekilde yeniden üretmeyi zorlaştırır12.
Renal IRI modeli, KBH'ye akut böbrek hasarını indüklemek için birincil yöntemdir ve önemli klinik öneme sahiptir. Fibrozisin şiddeti, iskemik zaman ve vücut ısısı ayarlanarak modüle edilebilir; bununla birlikte, UUO modeli ile karşılaştırıldığında, cerrahi olarak daha karmaşıktır ve interstisyel fibrozun indüksiyonu daha uzun bir süre gerektirir13. Bu modellerle karşılaştırıldığında, UUO modelinin kısa bir modelleme süresi, minimum değişkenlik, tekrarlanabilirlik ve nispeten basit bir cerrahi prosedür dahil olmak üzere çeşitli avantajları vardır. Toksin içermeyen UUO fare modeli, bir üreterin bağlanmasıyla oluşturulur ve iki hafta içinde obstrüktif nefropatiye yol açar. Bu, insanlarda gözlenen patolojik sürece çok benzeyen hidronefroz, tübüler dilatasyon ve interstisyel fibroz ile sonuçlanır14. Fibrozun şiddeti - hafif, orta veya şiddetli - deneyin süresi ayarlanarak kontrol edilebilir.
UUO fare modelinin gerçekleştirilmesi, KBH'yi araştırmak için hakaret kaynaklı diğer modellere göre daha basit olsa da, kararlılığını önemli ölçüde etkileyen birkaç faktör olabilir. Bu faktörler arasında fare suşu, yaş, cinsiyet, anestezi türü, ameliyat süresi, ameliyat sırasındaki vücut ısısı, operatörün cerrahi becerileri ve farelerin beslenme koşulları ve sağlık durumu yer almaktadır15,16.
Anestezi altında prosedürü sabit ve organize bir şekilde gerçekleştirirken cerrahi stresi ve enfeksiyonu en aza indirmek, tekrarlanabilir bir UUO fare modeli oluşturmak için çok önemlidir. Ek olarak, KBH'nin mekanizmaları ve potansiyel terapötik hedefleri üzerine yapılan araştırmalar, deneyimsiz operatörler tarafından tehlikeye atılabilir, bu da fare kaybının artmasına ve daha fazla model heterojenliğine yol açabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, cerrahi sürecin temel teknik yönleri - işlem öncesinde, sırasında ve sonrasında - ana hatlarıyla belirtilmekte ve dikkat edilmesi gereken kritik konular vurgulanmaktadır. Ayrıca, UUO fare modeli için değerlendirme metodolojisi, araştırmacılara tutarlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlamak için detaylandırılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, ajans yönergelerine uygun olarak yürütülür ve Nanjing Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanır. Cinsiyet ve suş farklılıklarını ortadan kaldırmak ve sonuçların karşılaştırılabilirliğini sağlamak için sadece 8-10 haftalık ve 22-25 g ağırlığındaki erkek CD1 fareleri kullanılır. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hayvan ve enstrüman hazırlama
- Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri otoklavlayın.
- Fareleri tartın ve uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). İnhalasyon anestezi cihazını uygun şekilde bağlayın ve fareleri 1-2 L / dk'da oksijenle karıştırılmış% 2 izofluran ile indüksiyon odasına yerleştirin. Ardından, fare burnunu sürekli bir anestezi kaynağı ile burun konisine yerleştirin. Bir ayak parmağı tutamına yanıt eksikliğini değerlendirerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın.
NOT: Solunum hızını düzenli olarak kontrol edin ve farelerin pedal refleksini kullanarak anestezi seviyesini değerlendirin. İzofluranı uygun şekilde ayarlayın. - Fareyi, hava yolunu açık tutmak için baş ve boyun uzatılmış olarak sırtüstü pozisyonda elektronik bir ısı yastığının üzerine yerleştirin. Pençeleri düşük yapışkan bantla sabitleyin.
- Ortam sıcaklığını izlemek ve 37-38 °C'de tutmak için bir termometre kullanın. Bir rektal prob yerleştirin ve işlem sırasında farelerin çekirdek vücut sıcaklığını 36.5-37 °C civarında tutun.
- Kornea kserozu yaralanmasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
- Ameliyat bölgesindeki saçları tüy dökücü krem ile tıraş edin ve üç kez betadin solüsyonu ile dezenfekte edin.
2. Cerrahi prosedür
NOT: Vücut ısısı ayar noktasında stabilize olduğunda ve ayak parmağını sıkıştırma refleksi olmadığında, aşağıdaki cerrahi prosedürleri başlatın.
- Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için mesaneden kaburgaların sol alt kenarına yaklaşık 1-1,5 santimetrelik dikey bir cerrahi kesi yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın.
- Dalağın arkasının altında ve omurganın yanında bulunan sol böbreği ortaya çıkarmak için steril normal tuzlu su ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak bağırsağı karın boşluğunun sağ tarafına hareket ettirin.
- Sol üreteri çevreleyen yağ ve bağ dokusunu temizlemek için kavisli iris forseps kullanın. Nazik bir izolasyondan sonra, 3/0 ipek örgülü bir sütür kullanarak sol üreteri böbreğin alt kutbuna yakın bir şekilde bağlayın. İlk ligasyon ile mesane arasında sol üreterin ikinci bir ligasyonunu gerçekleştirin.
NOT: Fareler arasındaki değişkenliği en aza indirmek için, ligasyon pozisyonunun tüm deneklerde tutarlı kaldığından emin olun. Sütürü sağ el forsepslerinin uçlarına yerleştirmek için sol el forsepslerini kullanın ve dikişi üreterin17 altına geri kaydırın. Ligasyona fazla yağ ve bağ dokusu dahil etmekten kaçının, çünkü bu eksik böbrek tıkanıklığına yol açabilir. Bunu, üreteri kuru pamuklu çubuklarla nazikçe okşayarak başarın. - Bağırsakları dikkatlice periton boşluğuna yeniden yerleştirin. 3/0 ipek örgülü sütür kullanarak kas ve cilt katmanlarını ayrı ayrı dikin.
NOT: Deri ve kas katmanlarının birbirine dikilmesi dikiş yarası yırtılmasına ve karın iç organlarının hasar görmesine neden olabilir. - Birden fazla farede çalışırken, bir sonraki fareye geçmeden önce cerrahi aletleri akan su ve% 75 etanol ile temizleyin.
3. Ameliyat sonrası bakım ve izleme
- Dehidrasyonu önlemek için intraperitoneal olarak 0.5 mL ılık normal salin enjekte edin.
- Fareleri tam bilinçlerini geri kazanana kadar temiz bir kafese geri koyun.
- Buprenorfini (50 μg/kg) 3 gün boyunca deri altı enjeksiyonla uygulayın. Fareleri tımar eksikliği, yeme azalması ve anormal duruş belirtileri açısından günlük olarak izleyin.
4. Ameliyat sonrası değerlendirmeler
- Histoloji
- Fareleri aşırı dozda izofluran ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Ötanaziden18 sonra tıkalı ve kontralateral tıkalı olmayan böbrekleri toplayın.
- Histolojik inceleme için böbrek bölümünün en büyük kesit alanını kullanın.
- Böbrek dokularını% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve elde edilen örnekleri 4 μm'lik bölümler halinde kesin.
- Böbrek tübüler hasarını ve böbrek fibrozunu tespit etmek için böbrek bölümlerini periyodik asit-Schiff (PAS), Masson'un trikrom boyaması (MTS) veya Sirius kırmızı boyaması ile boyayın.
- Işık mikroskobu altında 200× büyütme ile böbrek bölümlerinin on rastgele alanını seçin.
- ImageJ yazılımını kullanarak kolajen-pozitif mavi alanın oranını hesaplayın.
- Batı lekesi
- Radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu18 kullanarak aynı UUO böbrek kutbundan yaklaşık 20 mg böbrek dokusu çıkarın.
- Bir bikinkoninik asit tahlili19 kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
- Elektroforez için %4-10 Bis-Tris jellerine eşit miktarda protein numunesi yükleyin ve bunları poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
- PVDF membranlarını Tris-Tamponlu Salin Tween (TBST) içinde% 5 sütle bloke edin ve bunları gece boyunca 4 ° C'de birincil antikorlarla inkübe edin.
- PVDF membranlarını TBST ile yıkayın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında ikincil antikorlarla inkübe edin.
- Gelişmiş kemilüminesans (ECL) yöntemi kullanarak protein seviyelerini tespit edin ve yükleme kontrolü olarak gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ile ImageJ yazılımını kullanarak analiz edin.
- Böbrek Fonksiyonu
- Fareleri inhale izofluran ile uyuşturun (bkz. adım 1.2).
- Anesteziden sonra retroorbital olarak kan örnekleri toplayın.
- Kan örneklerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
- Böbrek fonksiyonunu izlemek için otomatik bir kuru kimyasal analizör kullanarak serum kreatinin ve kan üre nitrojenini (BUN) ölçün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Histoloji
Periyodik asit-Schiff (PAS) boyamasında tübüler dilatasyon, fırça sınırlarında kayıp, alçı oluşumu ve tübüler epitel şişmesi ortaya çıktı. Masson'un trikrom ve Sirius kırmızı boyanması, sahte grupta gözlenen fark edilebilir lümenlere sahip normal kompakt tübüllerin aksine, UUO'yu takiben interstisyel fibroz gösterdi. Masson trikrom boyamasında mavi alanlar ve Sirius kırmızı boyamasında kırmızı alanlar ile gösterilen renal interstisyel fibrozisin derecesi zamana bağlı olarak artmıştır (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Böbrek interstisyel fibrozunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olan UUO modelini oluşturmak için kapsamlı bir prosedür sağlanmıştır. Ek olarak, böbrek fonksiyonunun ve histolojik değişikliklerin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere modelin tanımlanması ve değerlendirilmesi gösterilmiştir. Modelin heterojenliğine katkıda bulunan değişkenler ve değiştirilebilir teknik faktörler tartışılmıştır.
UUO'ya duyarlılık yaşa, cinsiyete ve fare suşu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı Hibeleri (82370686/2024YFA1107704), Jiangsu Özel Olarak Atanmış Profesör Hibesi, Nanjing Bilim ve Teknoloji İnovasyon Projesi, Jiangsu Eyalet Hastanesi Üst Düzey Yetenek Geliştirme Programı (Faz I) (CZ0121002010037), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20240055) ve Jiangsu Tıbbi İnovasyon Ekibi tarafından desteklenmiştir. Jiangsu Eyalet Hastanesi (Nanjing Tıp Üniversitesi'ne İlk Bağlı Hastane) Klinik Kapasite Geliştirme Projesi (JSPH-MA-2023-4), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (Çin) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın Öncelikli Akademik Program Geliştirme (81970639/82151320) HM'ye.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL Şırınga | Mingankang | / | |
| 4/0 cerrahi sütür | Jinhuan Medical | F401 | |
| 6303060031 | %75 Etanol | Lircon | |
| RWD Yaşam | R510-29 | ||
| Anestezi İndüksiyon Odaları | RWD Yaşam Bilimleri | V102-V | |
| Hayvan saç kesme makinesi | Jinke | / | |
| Betadine çözeltisi | Lircon | 6303030036 | |
| Buprenorfin (analjezik) | RWD Yaşam Bilimi | / | |
| Kavisli iris forseps | jinke | / | |
| Elektronik ısı yastığı | Reptizoo | AHM23 | |
| ince düz forseps | Jinke | / | |
| Gaz Filtresi Teneke Kutu | RWD Yaşam Bilimleri | R510-31-6 | |
| Gazlı Bez Pedleri | Kazanan Tıbbi | 601-026576 | |
| İris Makas | Jinke | / | |
| İzofluran (anestezik) | RWD Yaşam Bilimleri | R510-22-10 | |
| Çok Çıkışlı Hayvan Anestezi Makinesi | RWD Yaşam Bilimleri | R550IE | |
| İğne tutucu | jinke | / | |
| Oftalmik merhem | Dechra NDC & nbsp; | 17033-211-38 | |
| Steril Pamuklu Çubuk | Kazanan Tıbbi | 601-015213 | |
| Steril salin | Shimen | H20066533 |
Kaynaklar
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
